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Biology

स्वचालित मॉड्यूलर उच्च Throughput Exopolysaccharide स्क्रीनिंग मंच बेहद संवेदनशील कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट विश्लेषण के साथ युग्मित

Published: April 11, 2016 doi: 10.3791/53249
Automatic Translation
1, 1, 1
1Chair of Chemistry of Biogenic Resources, Technische Universität München

Abstract

कई सूक्ष्मजीवों उत्पादन और exopolysaccharides (ईपीएस) है, जो चिकित्सा क्षेत्र, खाद्य अनुप्रयोगों में या पेट्रो-रसायन आधारित के प्रतिस्थापन में महत्वपूर्ण प्रभाव है स्रावित करने में सक्षम हैं। हम एक तरल हैंडलिंग प्रणाली है कि प्रकार और सूक्ष्मजीवों द्वारा उत्पादित ईपीएस की राशि का तेज और विश्वसनीय विश्लेषण की अनुमति देता है पर स्वचालित किया जा करने के लिए एक विश्लेषणात्मक मंच का वर्णन है। यह उपयोगकर्ता के उपन्यास प्राकृतिक माइक्रोबियल exopolysaccharide उत्पादकों की पहचान करने और उच्च throughput (हिंदुस्तान टाइम्स) में एक दिन के भीतर इसी पॉलिमर के कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट का विश्लेषण करने के लिए सक्षम बनाता है। इस मंच का उपयोग करना, तनाव संग्रह के रूप में अच्छी तरह से तनाव वेरिएंट की पुस्तकालयों कि इंजीनियरिंग दृष्टिकोण में प्राप्त किया जा सकता है की जांच की जा सकती है। मंच के एक मॉड्यूलर सेटअप है, जो दो प्रमुख भागों में प्रोटोकॉल के एक जुदाई की अनुमति देता है। सबसे पहले, वहाँ एक स्वचालित स्क्रीनिंग प्रणाली है, जो अलग-अलग polysaccharide का पता लगाने के मॉड्यूल को जोड़ती है: viscosit की एक अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषणएक centrifugation कदम, शराब वर्षा के माध्यम से बहुलक गठन के एक विश्लेषण और एक फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड परिवर्तन के माध्यम से कुल कार्बोहाइड्रेट सामग्री के निर्धारण के माध्यम से y गठन। यहाँ, यह रन प्रति 384 उपभेदों अप करने के लिए स्क्रीन करने के लिए संभव है। दूसरे भाग में दो अनिवार्य मॉड्यूल के संयोजन से पहले भाग में पहचान की सभी चयनित ईपीएस उत्पादकों के लिए एक विस्तृत विश्लेषण प्रदान करता है मोनोसैकराइड: अति उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से पूरा मोनोमर संरचना के विश्लेषण अल्ट्रा वायलेट और electrospray आयनीकरण आयन जाल का पता लगाने (के साथ युग्मित UHPLC-यूवी ईएसआई एमएस) और एक बहुलक substituent (पाइरूवेट ketal की उपस्थिति) एंजाइमी ऑक्सीकरण के माध्यम से है कि एक रंग के गठन के लिए युग्मित है के रूप में पाइरूवेट का निर्धारण। सभी इस स्क्रीनिंग मंच के विश्लेषणात्मक मॉड्यूल अलग अलग तरीकों से जोड़ा और व्यक्तिगत आवश्यकताओं के लिए समायोजित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, वे सब मैन्युअल संभाला या एक तरल हैंडलिंग प्रणाली के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रकार, स्क्रीनिंग पीएलएtform आदेश विभिन्न ईपीएस की पहचान करने में एक बड़ा लचीलापन सक्षम बनाता है।

Introduction

माइक्रोबियल exopolysaccharides (ईपीएस) पॉलिमर कि विभिन्न जैविक कार्यों को पूरा करने के लिए एक संरचनात्मक रूप से अत्यधिक विविध समूह हैं। वे आम तौर पर जटिल दोहराने इकाइयों, जो monomers के विभिन्न प्रकार (चीनी, चीनी डेरिवेटिव, चीनी एसिड), इन monomers और उनके प्रतिस्थापन के बीच बांड द्वारा प्रतिष्ठित हैं के लिए बनाया जाता है। माइक्रोबियल polysaccharides के संरचनात्मक विविधता इस अणु वर्ग है, जो खाद्य 1 की तरह अलग अलग क्षेत्रों में अपने आवेदन की अनुमति देता है, सौंदर्य प्रसाधन 2,3, निर्माण रसायन शास्त्र 4 या 5 जल उपचार के सदस्यों को नहीं बल्कि अलग विशेषताओं प्रदान करता है। आगे इन जैव आधारित है और इस तरह के स्थायी पॉलिमर उपन्यास प्राकृतिक माइक्रोबियल polysaccharides की पहचान के रूप में अच्छी तरह के रूप में संरचनात्मक वेरिएंट की इंजीनियरिंग आशाजनक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है के आवेदन के क्षेत्र का विस्तार। बहरहाल, एक तेजी से स्क्रीनिंग विधि जल्दी से उनके व्यापार के लिए माइक्रोबियल उपभेदों की एक बड़ी संख्या को स्कैन करने की आवश्यकता हैआर polysaccharide गठन, और उनके उत्पादों का विश्लेषण करने के लिए। इसलिए, हम हाल ही में प्राकृतिक वियोजन या इंजीनियर तनाव वेरिएंट कि monomeric रचना 6 की पहचान शामिल है, से माइक्रोबियल polysaccharide उत्पादन के विश्लेषण के लिए एक 96 अच्छी तरह से हिंदुस्तान स्क्रीनिंग मंच विकसित किया है।

~ 500 प्राकृतिक वियोजन की पहली स्क्रीनिंग दौर के लिए इस मंच को लागू करने के लिए हमें ईपीएस उत्पादन करने में सक्षम होने के रूप में के बारे में केवल 10 अलग नस्लों के 20% करने के लिए की पहचान करने की अनुमति दी (डेटा) नहीं दिखाया। इसका मतलब यह है कि विश्लेषण किया स्ट्रेन के 80-90% की शर्तों के तहत आवेदन किया ईपीएस उत्पादन नहीं किया था, और इसलिए, विस्तृत कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट का एक और विश्लेषण आवश्यक नहीं था। monomeric रचना के इस अत्यधिक परिष्कृत पहचान के रूप में एक समय लेने वाली प्रक्रिया है, विशेष रूप से डेटा विश्लेषण के लिए, एक तेजी से पूर्व स्क्रीनिंग विधि उपभेदों ईपीएस उत्पादन में सकारात्मक पहचान करने के लिए काफी दक्षता में वृद्धि होती है। इसके अलावा, अभिकर्मकों,UHPLC-यूवी ईएसआई एमएस में उपभोग्य और माप समय कम हो जाएगा। इसके अतिरिक्त, विभिन्न विश्लेषणात्मक मॉड्यूल, जबकि एक हाथ पर विधि अत्यंत विश्वसनीय बनाने, दूसरे हाथ समानांतर में दो से अधिक 96 अच्छी तरह से प्लेटों के मैनुअल हैंडलिंग उलझी पर हैं, और इस तरह के रूप में विधि की पूरी क्षमता को सीमित। इन कारणों के लिए, हम एक स्वचालित स्क्रीनिंग प्लेटफार्म विकसित करने का निर्णय लिया। इसलिए, हम absorbance के माप के आधार पर कुल चीनी सामग्री की एक पूरी तरह से स्वचालित तेजी से पता लगाने की विधि के साथ मौजूदा कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट तकनीक की मॉड्यूलर प्रारूप संयुक्त।

फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड पद्धति अभी भी बैक्टीरियल और संयंत्र polysaccharides 7.8 की कुल कार्बोहाइड्रेट सामग्री की तेजी निर्धारण के लिए पसंद की विधि का प्रतिनिधित्व करता है। इस विधि के पहले 96 अच्छी तरह प्लेटें 10,11 में भी छोटे पैमाने के लिए, ड्यूविस एट अल। 9 से वर्णित है और विभिन्न अनुप्रयोगों और नमूना आकार के लिए अनुकूलित किया गया था। PheNol-सल्फ्यूरिक एसिड विधि, एक मूल्य द्वारा कुल कार्बोहाइड्रेट सामग्री के उपाय सभी monomeric, oligomeric और नमूनों की बहुलक कार्बोहाइड्रेट summating।

खाते में इन पहलुओं को लेते हुए एक उपयुक्त खेती मध्यम की पसंद इस पद्धति लागू करने के लिए आवश्यक है। जटिल मीडिया oligomeric या खमीर निकालने की तरह बहुलक कार्बोहाइड्रेट युक्त यौगिकों एक बदल बहुलक सामग्री के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और इसलिए, सख्ती से बचा जाना चाहिए। इसके अलावा, शर्करा की उच्च मात्रा उपभेदों की खेती के लिए सी-स्रोत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। खेती की प्रक्रिया से शेष कार्बोहाइड्रेट के उच्च स्तर पर नकारात्मक ईपीएस सामग्री की माप के साथ हस्तक्षेप कर सकता है।

इसलिए, परिभाषित और शुद्ध शर्करा के उपयोग की सलाह दी है। हमारे प्रयोगों में हम कोशिकाओं की खेती के लिए ग्लूकोज का इस्तेमाल किया। खेती के बाद शेष ग्लूकोज एक जेल निस्पंदन के माध्यम से कम और एक ग्लूकोज-परख के माध्यम से निर्धारित किया गया था। अंत में, ग्लूकोज बराबरpolysaccharides के रों कि फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि के साथ पाया गया था कुल कार्बोहाइड्रेट सामग्री से जेल छानने के बाद शेष ग्लूकोज घटाकर द्वारा गणना की गई। जेल निस्पंदन और फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि के साथ संयोजन में ग्लूकोज-परख विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने और हमारे पहले, पूरी तरह से स्वचालित पहचान प्रणाली से किया जा रहा करने में सक्षम हैं।

वर्षा और चिपचिपाहट में वृद्धि का अवलोकन: दो नई विश्लेषणात्मक मॉड्यूल ईपीएस-पहचान प्रणाली से जानकारी की मात्रा में वृद्धि करने के लिए स्वचालित स्क्रीनिंग मंच में शामिल थे।

कई अलग अलग ईपीएस - जैसे succinoglycan, जिंक और colonic एसिड 12 - पर चीनी पदों सी 4 और C6 एक गैर कार्बोहाइड्रेट पाइरूवेट ketal के साथ संशोधित होने की सूचना है। उन पाइरूवेट ketals (बस के रूप में succinyl आधा एस्टर और uronic एसिड) polyanionic प्रकृति के लिए योगदान करते हैं और इसलिए, शारीरिक prope के लिएद्विसंयोजक केशन पुलों 13 के माध्यम से बातचीत से बहुलक का rties। आदेश में उन विशेष पॉलिमर की पहचान करने में पाइरूवेट के निर्धारण के लिए एक और अतिरिक्त विश्लेषणात्मक मॉड्यूल के रूप में स्थापित किया गया था। यह polysaccharide substituents और उनके संभावित स्थूल संपत्तियों के बारे में जानकारी बढ़ जाती है।

सभी मॉड्यूल के संयोजन अलग ईपीएस की पहचान के रूप में अच्छी तरह से ईपीएस उत्पादकों में से एक तेज और कुशल दृढ़ संकल्प सक्षम बनाता है। उस दृष्टिकोण से स्क्रीनिंग मंच के दो प्रमुख भागों (चित्रा 1) में विभाजित किया जा सकता है। स्वचालित स्क्रीनिंग (भाग मैं) कार्यप्रवाह पूरी तरह से स्वचालित होता है के भीतर (तालिका 1) जल्दी से उपभेदों उत्पादन ईपीएस पहिले से चयन करने के लिए। कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट विश्लेषण (भाग द्वितीय) मात्रात्मक चुने हुए उपभेदों द्वारा उत्पादित ईपीएस की मोनोमर संरचना निर्धारित करता है। इस प्रकार, डेटा विश्लेषण के क्रम में बड़े तनाव संग्रह की स्क्रीनिंग का अनुकूलन करने में कम से कम किया गया था। इसएक ही स्वचालित स्क्रीनिंग समय में और दो रन है कि प्रति दिन प्रति 768 नस्लों के दिन संभव हो रहे हैं साथ 384 उपभेदों का विश्लेषण करने की संभावना प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट विश्लेषण सभी की पहचान की ईपीएस का एक भी अधिक विस्तृत सिंहावलोकन देता है। यह निर्देश दिया विश्लेषण और ईपीएस की पहले से ही वर्णित रासायनिक संरचना की तुलना में केवल थोड़ा भिन्न ईपीएस वेरिएंट या पूरी तरह से नए लोगों की पहचान के लिए सक्षम बनाता है।

Protocol

1. स्वचालित स्क्रीनिंग

नोट: सभी तरल से निपटने कदम एक रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली के साथ किया जाता है। रोबोट worktable की संरचना चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है। सभी उपभोज्य, भंडारण हिंडोला में जमा हो जाती है, जब तक अन्यथा उल्लेख किया है। (सीपी हिंडोला स्थितियों के बीच सभी स्वचालित स्क्रीनिंग के लिए एक रोबोट जोड़तोड़ (आरएम) उपभोग्य चलता है, (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन प्लेट (पीसीआर प्लेट) और इतने पर; माइक्रो अनुमापांक प्लेट (एमटीपी) गहरी अच्छी तरह से थाली (DWP)) कदम ) और worktable पदों (डब्ल्यूटीपी)। सभी पिपेट कदम को छोड़कर अगर यह अन्यथा उल्लेख किया गया है, एक 96 चैनल पिपेट हाथ के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं। सभी चरणों का प्रोग्राम किया जाता है और 96 अच्छी तरह प्रारूप में स्वचालित रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. तनाव की खेती (चित्रा 1 में कार्य 1)
    नोट: ख्यात उपभेदों उत्पादन ईपीएस का टीका और बाँझ शर्तों (लामिना का प्रवाह) के तहत खेती प्लेटों की सील संभाल लेना। स्वचालिततेजी से स्क्रीनिंग रन प्रति चार 96 अच्छी तरह प्लेटें संभाल सकते हैं। कई पीढ़ी के विभिन्न प्रकारों के पहले से ही 6 परीक्षण किया गया।
    1. मैन्युअल रूप से एक 96 अच्छी तरह से ग्लिसरॉल स्टॉक थाली से एक 96-पिन replicator के साथ प्री-संस्कृति (एक DWP में 1 मिलीलीटर ईपीएस-मीडिया) टीका लगाना। एक सांस सील फिल्म के साथ थाली कवर वाष्पीकरण से बचने के लिए और वेंटिलेशन की अनुमति है। एक एमटीपी-प्रकार के बरतन पर 1000 rpm पर 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. एक 50 μl 12 चैनल बहु पिपेट का उपयोग और पूर्व संस्कृति के रूप में एक ही परिस्थितियों में सेते पूर्व संस्कृति के 10 μl हस्तांतरण से मुख्य-संस्कृति (एक DWP में 990 μl ईपीएस-मीडिया) टीका लगाना। सभी उपभेदों कि हो जाना नहीं है का एक नोट ले लो।
  2. रोबोट worktable और भंडारण हिंडोला की तैयारी
    1. भंडारण हिंडोला में सही स्थिति के लिए सामग्री और उपकरणों में सूचीबद्ध सभी उपभोग्य प्रदान करें। 100 वें लिए dilutions: 1 के लिए DWP के प्रत्येक कुएं में (DDH 2 हे) दोहरा आसुत जल के 990 μl जोड़ेई ग्लूकोज-परख (हिंडोला स्थिति 4-1 4-4)।
    2. एक 250 मिलीलीटर worktable स्थिति (डब्ल्यूटीपी) 11 पर DDH 2 हे की 150 मिलीग्राम से युक्त गर्त की व्यवस्था।
    3. एक 250 मिलीलीटर 50 मिलीलीटर ग्लूकोज-परख अभिकर्मक मिश्रण (4 मिलीलीटर 500 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट (5.7 पीएच), 1.5 मिलीग्राम 50 मिमी 2.2 azinobis- (3ethylbenzthiazoline) -6-सल्फोनिक एसिड, 2 मिलीलीटर 100 यू ग्लूकोज oxidase युक्त गर्त जमा है, 10 μl 1,000 यू हॉर्सरैडिश peroxidase और 42.49 मिलीलीटर DDH 2 हे) की स्थिति डब्ल्यूटीपी 1-2 पर।
    4. स्थिति डब्ल्यूटीपी 3-1 और 3-2 पर दो खाली डमी एफ-नीचे MTPS रखें।
    5. सांस सील फिल्म निकालें, हिंडोला पदों (सीपी) 1-1 1-4 करने के लिए मुख्य संस्कृतियों का आवंटन और स्वचालित रोबोट कार्यक्रम शुरू करते हैं।
  3. जेल निस्पंदन प्लेट्स का संतुलन
    नोट: जेल निस्पंदन प्लेटें कि इस स्क्रीनिंग के दौरान इस्तेमाल कर रहे हैं पुन: उपयोग किया जा सकता है। इसके लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 2,000 XG पर धोने और सेंट्रीफ्यूज तीन बार DDH 2 हे के 150 μl के साथ प्रत्येक। बाद में, 4 पर दुकान20% इथेनॉल के 75 μl के साथ सी ° और एक सिलिकॉन टोपी चटाई के साथ कवर किया।
    1. 250 मिलीलीटर गर्त 5 मिमी अमोनियम एसीटेट बफर (पीएच 5.6) डब्ल्यूटीपी 3-3 के साथ (सीपी 5-7) ले जाएँ।
    2. 4-4 को WTPs 4-1 हिंडोला से जेल निस्पंदन प्लेट (सीपी 1-6, 1-7, 2-6 और 2-7) हस्तांतरण।
    3. महाप्राण 200 μl युक्तियों का उपयोग और संतुलन के लिए सभी जेल निस्पंदन प्लेटों के बीच में बांटना अमोनियम एसीटेट बफर के 150 μl।
    4. (20 डिग्री सेल्सियस पर के लिए 2,000 XG 2 मिनट) अपकेंद्रित्र में जेल निस्पंदन प्लेटों स्थानांतरण।
    5. प्लेटों worktable को वापस स्थानांतरण, कदम 1.3.3, 1.3.4 और 1.3.3 दोहराएँ। centrifugation कदम जेल निस्पंदन प्लेटों के निर्जलीकरण से बचने के लिए दोहराना नहीं है। equilibrated जेल निस्पंदन प्लेटों हिंडोला के भीतर वापस स्टोर।
  4. Centrifugation के माध्यम से सेल निकालना (चित्रा में कार्य 1 1)
    नोट: आदेश में स्क्रीनिंग के दृष्टिकोण के भीतर एक कम पृष्ठभूमि सुनिश्चित करने के लिए, सेल मुक्त विश्लेषणईपीएस supernatants केवल युक्त और खेती के बाद centrifugation के माध्यम से कोशिकाओं को हटा दें।
    1. (20 डिग्री सेल्सियस पर के लिए 4300 XG 30 मिनट) हिंडोला (1-4 को 1-1) अपकेंद्रित्र में से मुख्य-संस्कृति DWP स्थानांतरण।
    2. मुख्य संस्कृति पर कार्रवाई करने के आरएम के माध्यम से worktable तैयार करें।
      नोट: 1.4.3.5 करने के लिए कदम 1.4.2 के लिए प्रणाली हमेशा समानांतर में दो प्लेटों को संभालती है और फिर अगले दो प्लेटों के साथ सभी चरणों को दोहराता है।
      1. छानने का काम पहले वर्षा के लिए 4-1 और 5-1 डब्ल्यूटीपी के लिए सी.पी. 6-1 और 6-2 से एमटीपी चलते हैं। 4-2 और 5-2 डब्ल्यूटीपी के लिए सी.पी. 7-1 और 7-2 से पीएच-सूचक MTPS ले जाएँ।
      2. सीपी 2-1 और 2-2 से कलेक्टर थाली के साथ एक साथ छानने का काम थाली हस्तांतरण 4-3 और 5-3 डब्ल्यूटीपी करने के लिए। सेंट्रीफ्यूज से मुख्य-संस्कृति DWP 1-1 और 1-2 से स्थानांतरित 4-4 और 5-4 डब्ल्यूटीपी करने के लिए।
      3. विश्लेषणात्मक मॉड्यूल तैयार करें।
        नोट: टिप भंडारण (स्थिति 2-4 को 2-1) से 200 μl सुझाव ले लो। आदेश उपभोग्य को कम करने के लिए, चरण 1 के लिए एक ही टिप-सेट का उपयोग.4.3.1।
        1. निस्पंदन थाली करने के लिए मुख्य-संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के 180 μl स्थानांतरण। मुख्य-संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से महाप्राण 150 μl और छानने से पहले वर्षा के लिए एमटीपी में 50 μl और पीएच-सूचक प्लेट के लिए 100 μl बांटना।
          नोट: पीएच-निर्णय आवश्यक नहीं है; हालांकि, एक बहु कदम विंदुक के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक में 12.5 मिलीलीटर मिथाइल लाल सूचक (50 मिलीलीटर इथेनॉल में 50 मिलीग्राम) जोड़ने के बाद यह उच्च एसिड उत्पादक उपभेदों इंगित करता है। यह जानकारी आगे खेती, उच्च बफर एकाग्रता के साथ एक दूसरे स्क्रीनिंग के लिए उदाहरण के लिए (कम पीएच) विकास निषेध से बचने के लिए उपयोगी हो सकता है। इसके अलावा, कम पीएच भी आदेश अम्लीय वातावरण के खिलाफ सेल की रक्षा के लिए ईपीएस उत्पादन को प्रेरित कर सकता है।
        2. दूसरा मुख्य-संस्कृति की थाली के लिए दोहराएँ चरण 1.4.3.1। एक ताजा टिप-सेट का प्रयोग करें।
        3. सेंट्रीफ्यूज को छानने का काम प्लेटों को स्थानांतरित और अन्य सभी प्लेटों carous में उनके घर के पदों के लिए वापस worktable से हटा देंएल।
        4. तीसरे और चौथे मुख्य-संस्कृति की थाली के लिए 1.4.3.3 करने के लिए कदम 1.4.2.1 दोहराएँ।
        5. उन किण्वन बतख, जो शो मुख्य संस्कृति प्लेटों की centrifugation के बाद अवसादन में कमी आई है, जब वे हिंडोला (चिपचिपापन नियंत्रण) वापस करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं का एक नोट ले लो।
  5. पूरा सेल हटाने के लिए 96 अच्छी तरह से निस्पंदन (चित्रा 1 में टास्क 2)
    नोट: चिपचिपा किण्वन शोरबा एक निस्पंदन कदम स्क्रीनिंग में शामिल है से सेल हटाने सुनिश्चित करने के।
    1. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3,000 XG पर निस्पंदन प्लेटों अपकेंद्रित्र और उन्हें वापस उनके हिंडोला घर की स्थिति को ले आओ।
    2. जेल निस्पंदन प्लेटों की तैयारी।
      1. 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर सेंट्रीफ्यूज और स्पिन करने के लिए हिंडोला से equilibrated जेल निस्पंदन प्लेटों ले जाएँ।
      2. 44 डब्ल्यूटीपी 4-1 सेंट्रीफ्यूज से जेल निस्पंदन प्लेटों स्थानांतरण।
      3. ताजा जेल ले जाएँडब्ल्यूटीपी के लिए सी.पी. से (3-1 3-4 से) -filtration कलेक्टर प्लेट (5-1 5-4 के लिए)।
      4. ताजा कलेक्टर प्लेट (5-4 को 5-1) को equilibrated जेल निस्पंदन प्लेट (4-4 को डब्ल्यूटीपी 4-1) स्थानांतरण।
      5. पदों 5-1 और 5-2 को छोड़कर worktable को साफ और 4-1 की स्थिति के लिए स्थिति को 5-1 से चलते हैं।
    3. filtrates संसाधित करने के लिए आर एम के माध्यम से worktable तैयार करें।
      नोट: कदम 1.5.3 प्रणाली 1.6.3.5 करने के लिए समानांतर में दो प्लेटों को संभालती है और अगले दो प्लेटों के साथ सभी चरणों को दोहराता है।
      1. डब्ल्यूटीपी 3-3 और 3-4 से हिंडोला (4-6 और 4-7) से 50 μl सुझावों के लिए ले जाएँ।
      2. worktable (4-4 और 5-4) पर 3-2 करने के लिए सी.पी. 3-1 से छानने का काम प्लेटों स्थानांतरण।
      3. सीपी 4-1 और 4-2 से ग्लूकोज की खपत का पता लगाने के लिए: (100 कमजोर पड़ने 1) 4-2 और 5-1 डब्ल्यूटीपी के लिए DWP स्थानांतरित करना।
      4. 4-3 और 5-3 डब्ल्यूटीपी के लिए सी.पी. 8-1 और 8-2 से छानने के बाद दूसरे नंबर पर वर्षा के लिए एमटीपी ले जाएँ।
      5. कलेक्टर की थाली से छानने का काम प्लेटों लिफ्टएस (डब्ल्यूटीपी 4-4 और 5-4) और उन्हें डब्ल्यूटीपी 3-1 और 3-2 के लिए कदम।
    4. छानने के बाद विश्लेषणात्मक मॉड्यूल तैयार करें। आदेश उपभोग्य कम करने के लिए, कदम 1.5.4.1 और 1.5.4.3 के लिए एक ही टिप-सेट का उपयोग करें।
      1. 50 μl टिप्स ले और DWP को छानना की एक 10 μl विभाज्य पिपेट (1: 100 कमजोर पड़ने) ग्लूकोज-परख (ग्लूकोज की खपत) के लिए।
      2. पिपेट equilibrated जेल निस्पंदन प्लेट के केंद्र के लिए छानना के 35 μl और एमटीपी कि वर्षा के लिए प्रयोग किया जाता है करने के लिए 50 μl।
      3. दोहराएँ कदम 1.5.4.1 दूसरी निस्पंदन प्लेट के लिए 1.5.4.2 करने के लिए।
      4. सेंट्रीफ्यूज को जेल निस्पंदन प्लेटों ले जाएँ और हिंडोला में घर पदों के लिए वापस worktable से अन्य सभी प्लेटों के लिए कदम।
      5. दोहराएँ कदम 1.5.3.1 तीसरे और चौथे निस्पंदन प्लेट के लिए 1.5.4.4 करने के लिए।
      6. पीठ में अत्यधिक चिपचिपा supernatants का हिंडोला नोट ले लो, के रूप में फिल्टर थाली में बच ने संकेत में (सभी प्लेटों के भंडारण के उच्च वी के बादनिस्पंदन कदम के बाद iscosity नियंत्रण)। छानना की कमी निम्न विश्लेषणात्मक मॉड्यूल में झूठी नकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
  6. 96 अच्छी तरह से जेल निस्पंदन के माध्यम से ग्लूकोज का हटाया (चित्रा में टास्क 3 1)
    1. 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर जेल निस्पंदन प्लेटों अपकेंद्रित्र।
    2. जेल filtrates संसाधित करने के लिए रोबोट जोड़तोड़ के माध्यम से worktable तैयार करें।
      1. डब्ल्यूटीपी 3-3 और 3-4 से हिंडोला (5-3 और 5-4) से 50 μl सुझाव प्रदान।
      2. जेल छानने के बाद शेष ग्लूकोज के निर्धारण के लिए 4-1 और 5-1 डब्ल्यूटीपी के लिए सी.पी. 9-1 और 9-2 से दो MTPS चलते हैं।
      3. फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि के लिए 4-2 और 5-2 डब्ल्यूटीपी के लिए सी.पी. 8-5 और 8-6 से दो MTPS चलते हैं।
      4. डब्ल्यूटीपी (4-3 और 5-3) को सेंट्रीफ्यूज से दो जेल निस्पंदन प्लेटों स्थानांतरण।
      5. कलेक्टर प्लेट (4-3 और 5-3) से जेल निस्पंदन प्लेटों लिफ्ट और उन्हें ले जाने के 3-1 और 3-2 डब्ल्यूटीपी करने के लिए।
    3. जेल filtrates संसाधित करने के लिए रोबोट जोड़तोड़ के माध्यम से worktable तैयार करें।
      नोट: उपभोग्य को कम करने के लिए, का उपयोग एक ही टिप-सेट कदम 1.6.3.1 और 1.6.3.2 के लिए।
      1. जेल निस्पंदन (1:10 कमजोर पड़ने) के बाद शेष ग्लूकोज का पता लगाने के लिए 50 μl टिप्स ले और एक ताजा एमटीपी को DDH 2 हे (डब्ल्यूटीपी 1-1) का 25 μl हस्तांतरण। DDH 2 हे की महाप्राण 20 μl (डब्ल्यूटीपी 1-1), हवा के 5 μl और जेल छानना के 5 μl और एक ही थाली में बांटना।
      2. फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड-विधि पिपेट एमटीपी को जेल छानना के 20 μl के लिए।
      3. दोहराएँ 1.6.3.1 और दूसरा जेल छानना प्लेट के लिए 1.6.3.2 कदम।
      4. उनकी हिंडोला में घर पदों के लिए वापस worktable से सभी प्लेटों स्थानांतरण।
      5. तीसरे और चौथे जेल निस्पंदन प्लेट के लिए 1.6.3.4 करने के लिए कदम 1.6.2.1 दोहराएँ।
  7. ग्लूकोज-परख मॉड्यूल
    1. के रूप में ग्लूकोज-प्रदर्शन करने के लिए रोबोट जोड़तोड़ के माध्यम से worktable तैयारकहते हैं।
      1. सीपी 4-1 और 4-4 से को 5-1 से और 5-4 डब्ल्यूटीपी रहे हैं: DWP (100 कमजोर पड़ने 1) स्थानांतरित करना।
      2. 4-1 और 4-4 डब्ल्यूटीपी के लिए सी.पी. 9-5 और 9-8 से सभी MTPS ले जाएँ।
      3. 200 μl टिप्स ले और श्वास और दस बार 180 μl की मात्रा वितरण से कमजोर पड़ने मिश्रण। तब एमटीपी करने के लिए एक 50 μl विभाज्य पिपेट।
      4. (: 100 कमजोर पड़ने 1) दोहराएँ 1.7.1.2 और 1.7.1.3 सभी चार DWPs के लिए कदम।
      5. worktable से सभी DWPs (5-4 को 5-1) निकालें।
    2. ग्लूकोज-परख शुरू करने के लिए worktable तैयार करें।
      1. डब्ल्यूटीपी को जेल निस्पंदन हस्तांतरण सी.पी. से सभी MTPS (9-4 को 9-1) (5-1 5-4 करने के लिए) के बाद शेष ग्लूकोज के निर्धारण के लिए।
      2. ग्लूकोज-परख अंशांकन थाली ले जाने - तीन बार निम्न ग्लूकोज सांद्रता के 50 μl (90, 45, 18, 9, 4.5, 1.8, 0.9, 0.45 और 0 मिलीग्राम / एल) युक्त - सीपी 9-9 से 3 डब्ल्यूटीपी के लिए 3।
      3. 200 μl सुझावों और महाप्राण डब्ल्यू से ग्लूकोज-परख अभिकर्मक मिश्रण के 50 μl ले लोटी.पी. 1-2, पहली परख शुरू करने के लिए। इनक्यूबेटर (30 डिग्री 30 मिनट के लिए 150 rpm पर सी) में MTPS ले जाएँ।
      4. समय समय निर्धारित करें प्लेटों के बीच में 5 मिनट की देरी के साथ कार्यक्रम शुरू करने के लिए।
      5. ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद 418 और 480 एनएम पर एमटीपी पाठक और रिकॉर्ड absorbance को इनक्यूबेटर से प्लेटें ले जाते हैं।
      6. माप के बाद हिंडोला में अपने घर की स्थिति के लिए प्लेटों के लिए कदम।
  8. वर्षा की तैयारी
    नोट: आकलन करने के लिए ईपीएस उत्पादन से पहले और पहले निस्पंदन कदम के बाद 2-propanol के साथ सतह पर तैरनेवाला के एक वर्षा प्रदर्शन में। इसके अलावा, फाइबर और पहली बार में गुच्छे के अवलोकन के द्वारा फिल्टर झिल्ली पर बहुलक का सोखना का मूल्यांकन, लेकिन दूसरे वर्षा में नहीं।
    सावधानी: कड़ाई से एक धूआं हुड के तहत संभाल एक ज्वलनशील तरल के रूप में 2-propanol।
    1. सभी वर्षा प्लेटें निकालें (सीपी 6-1, 6-4 और 8-1 8-4 करने के लिए) हिंडोला से। और जोड़मैन्युअल 150 12.5 मिलीलीटर बहु ​​कदम विंदुक के साथ एक अच्छी तरह से 2-propanol के μl।
    2. एक सिलिकॉन टोपी चटाई के साथ सभी MTPS कवर और कमरे के तापमान (आरटी) (900 rpm पर 10 मिनट) पर हिला। नेत्रहीन झटकों से संकेत मिलता है कि ईपीएस उत्पादन के बाद फाइबर या परत संरचनाओं निरीक्षण करते हैं।
  9. फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि
    सावधानी: एक धूआं हुड के तहत संभाल केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड और फिनोल। फिनोल एक संक्षारक और mutagenic एजेंट है।
    1. फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि के लिए, हिंडोला से प्लेटें (सीपी 8-8 से 8-5) को हटाने और उन्हें तरल हैंडलिंग प्रणाली (8 की स्थिति 4) में जगह है। triplicates में (0 जी / एल; 5; 2.5; 1; 0.5; 0.25; 0.1; 0.05 10) अलग ग्लूकोज सांद्रता के 20 μl के साथ अंशांकन थाली में शामिल हैं।
    2. स्थिति 1 पर बर्बादी कंटेनर रखें, स्थिति 2 में एक 200 μl टिप बॉक्स और 110 मिलीलीटर फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड (हौसले बर्फ with18.3 मिलीलीटर फिनोल पर तैयार 5% (के साथ एक 250 मिलीलीटर गर्त w / v) DDH 2 हे में और 91.7 सान्द्र की मिलीलीटर। रोंस्थिति 3 पर ulfuric एसिड)।
    3. 300 μl सुझावों के साथ एक 8 चैनल पिपेट का प्रयोग करें और सभी प्लेटों की प्रत्येक पंक्ति में फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड के 180 μl हस्तांतरण।
    4. पलकों के साथ सभी MTPS कवर, मिलाते (900 आरपीएम, आरटी पर 5 मिनट) द्वारा उन्हें मिश्रण और रंग प्रतिक्रिया के लिए एक ओवन में 80 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं। एक धूआं हुड के नीचे ठंडा करने के बाद, 480 एनएम पर विलुप्त होने का उपाय।
  10. ईपीएस सकारात्मक Supernatants का चयन (चित्रा में टास्क 4 1)
    1. ईपीएस उत्पादन के मूल्यांकन के लिए, स्वचालित स्क्रीनिंग कि सकारात्मक रूप में तीन मानदंडों के कम से कम दो पूरा (चिपचिपापन नियंत्रण 2.6.1 और 2.6.2, 2.6.3 बहुलक का पता लगाने, ग्लूकोज बराबर 2.6.5) से उन उपभेदों का चयन करें। आगे की प्रक्रिया के लिए एक नया एमटीपी करने के लिए सकारात्मक हिट से शेष filtrates स्थानांतरण।
      नोट: प्लेटें एक एल्यूमीनियम सील फिल्म में वे कम से कम एक सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है के साथ कवर कर रहे हैं। उस समय के भीतर Determinaकार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट की tion प्रदर्शन करने की जरूरत है।

2. कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट

नोट: कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट के लिए सभी कदम मैन्युअल रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. (चित्रा 1 में टास्क 5) सकारात्मक Supernatants की जेल निस्पंदन
    नोट: जेल निस्पंदन आवश्यक है के रूप में कोई छानना स्वचालित स्क्रीनिंग से छोड़ दिया है। कमी आई है शोधन क्षमता में 35 से अधिक μl परिणामों की एक मात्रा के साथ जेल निस्पंदन।
    1. 12.5 मिलीलीटर बहु कदम पिपेट के माध्यम से सभी कुओं में अमोनियम एसीटेट बफर के 150 μl वितरण द्वारा जेल निस्पंदन प्लेटों के संतुलन को तैयार है।
    2. सेंट्रीफ्यूज में जेल निस्पंदन थाली हस्तांतरण (के लिए 2,000 XG 2 मिनट 20 डिग्री सेल्सियस पर)।
    3. दोहराएँ 2.1.1, 2.1.2 और 2.1.1 फिर से कदम। आगे उपयोग से पहले 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर जेल निस्पंदन प्लेट अपकेंद्रित्र।
    4. पिपेट में छानना के 35 μlएक 12-चैनल 50 μl पिपेट का उपयोग कर जेल निस्पंदन प्लेट के केंद्र।
    5. 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर जेल निस्पंदन थाली अपकेंद्रित्र और उसके बाद कलेक्टर थाली से इसे उठा।
    6. हाइड्रोलिसिस से पहले ग्लूकोज-परख तैयार: एक 12-चैनल 50 μl विंदुक के साथ DDH 2 हे के 45 μl और जेल छानना के 5 μl जोड़कर 1:10 कमजोर पड़ने प्रदर्शन और एक सिलिकॉन टोपी चटाई के साथ MTPS को कवर किया।
      नोट: के लिए बहुलक का ग्लूकोज मूल्य का सही निर्धारण, हाइड्रोलिसिस से पहले ग्लूकोज सामग्री को मापने और हाइड्रोलिसिस कदम के बाद मात्रा निर्धारित ग्लूकोज सामग्री से यह घटाना।
    7. हाइड्रोलिसिस से पहले पाइरूवेट-परख तैयार: अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए DDH 2 हे के 95 μl, स्थानांतरण जेल छानना के 5 μl जोड़ने के लिए एक 12 चैनल 200 μl पिपेट का उपयोग कर एक 1:20 कमजोर पड़ने प्रदर्शन और एक सिलिकॉन टोपी चटाई के साथ एमटीपी सील ।
  2. 96 अच्छी तरह से माइक्रो हाइड्रोलिसिस (टास्क 6 चित्रा 1 में)
    नोट: गर्मीऊष्मायन ओवन 121 डिग्री सेल्सियस के लिए कम से कम 1.5 घंटे के लिए उपयोग करने से पहले (एक रेत स्नान सहित)। एक विशेष clamping डिवाइस छोटे से छोटा हाइड्रोलिसिस चरण के दौरान वाष्पीकरण से बचने के लिए विकसित किया गया था।
    1. एक नई पीसीआर थाली ले लो और एक 12-चैनल 50 μl विंदुक के साथ जेल छानना के 20 μl हस्तांतरण।
      सावधानी: trifluoroacetic एसिड एक संक्षारक एसिड और विषैला होता है। अमोनियम समाधान संक्षारक है। केवल एक धूआं हुड के तहत दोनों रसायनों संभाल।
    2. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एक 1.25 मिलीलीटर बहु ​​कदम विंदुक के साथ 4 एम trifluoroacetic एसिड के 20 μl जोड़ें। फिर एक थर्माप्लास्टिक elastomer (TPE) टोपी चटाई के साथ पीसीआर प्लेट को कवर किया और विशेष clamping डिवाइस में पीसीआर थाली जगह है।
    3. clamping डिवाइस inverting दस बार के माध्यम से समाधान मिक्स। 2,000 XG पर एक सेंट्रीफ्यूज और स्पिन में पीसीआर थाली रखो 2 मिनट के तल पर सभी तरल इकट्ठा करने के लिए। पीसीआर प्लेट वापस clamping डिवाइस के लिए रखो और शिकंजा के साथ डिवाइस सुरक्षित है।
    4. इसे रखोपूर्व गर्म रेत स्नान में सुरक्षित clamping डिवाइस और 121 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. रेत स्नान से clamping डिवाइस निकालें और यह आरटी के लिए ठंडा होने दें।
    6. शिकंजा निकालें और फिर से आदेश कुओं के नीचे स्थित सभी घनीभूत इकट्ठा करने के लिए 2 मिनट के लिए 2,000 XG पर एक अपकेंद्रित्र में स्पिन और टोपी चटाई के हटाने के दौरान पार संक्रमण को रोकने के लिए।
    7. 3.2% अमोनिया समाधान लगभग पीएच को समायोजित करने के लिए जोड़ें। 8 एक 12 चैनल 200 μl पिपेट का उपयोग। एक TPE टोपी चटाई के साथ पीसीआर प्लेट कवर और मैन्युअल clamping डिवाइस का उपयोग कर इसे हिला।
    8. निराकरण के बाद 2 मिनट के लिए 2,000 XG पर पीसीआर थाली अपकेंद्रित्र।
  3. उच्च throughput-1-फिनाइल-3-मिथाइल-5-pyrazolone (चित्रा 1 में टास्क 7) (HT-पीएमपी) कार्बोहाइड्रेट की -derivatization
    1. स्थानांतरण एक 12 चैनल 50 μl पिपेट का उपयोग कर एक ताजा पीसीआर प्लेट में निष्प्रभावी हायड्रोलायसेट के 25 μl।
      नोट: विभाज्य लेने के बाद, neutr जाँचएक 1.25 मिलीलीटर बहु ​​कदम विंदुक के साथ 12.5 μl फिनोल लाल सूचक (5 मिलीलीटर 20% इथेनॉल में 0.05 जी फिनोल लाल) जोड़ने के माध्यम से हाइड्रोलिसिस थाली में शेष तरल की alization। सभी कुओं कि गुलाबी रंग (8 पीएच) में बारी नहीं है सही ढंग से derivatized नहीं कर रहे हैं।
    2. 75 μl derivatization अभिकर्मक मिश्रण (125 मिलीग्राम पीएमपी, 7 मिलीलीटर मेथनॉल, 3.06 मिलीलीटर DDH 2 हे, और 438 μl 3.2% अमोनियम समाधान) जोड़ें और एक TPE टोपी चटाई के साथ थाली को कवर किया।
    3. 2,000 XG पर थाली clamping डिवाइस सेंट्रीफ्यूज में पीसीआर प्लेट मिलाने के बाद 2 मिनट के तल पर सभी तरल जमा करने के लिए।
    4. derivatization जगह के लिए 100 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक पीसीआर साइक्लर में पीसीआर प्लेट 20 डिग्री सेल्सियस तक नीचे ठंडा द्वारा पीछा किया।
    5. एक नए एमटीपी में एक 20 μl विभाज्य स्थानांतरण एक 12 चैनल 50 μl पिपेट का उपयोग। फिर एक 12 चैनल 200 μl पिपेट का उपयोग करें और 130 μl 19.23 मिमी प्रत्येक लाइन के लिए एसिटिक एसिड (0.962 मिलीग्राम 1 एम एसिटिक एसिड + 49.038 मिलीलीटर DDH 2 हे) जोड़ें। aspirat के माध्यम से सीधे मिक्सआईएनजी और वितरण (कम से कम छह बार) और एक एमटीपी कलेक्टर थाली के साथ एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर थाली करने के लिए सभी तरल हस्तांतरण।
    6. अपकेंद्रित्र प्लेट (5 मिनट के लिए 1,000 XG), फिल्टर प्लेट को दूर एक सिलिकॉन टोपी चटाई के साथ एमटीपी सील और कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट 14 के निर्धारण के लिए UHPLC-यूवी ईएसआई एमएस में एमटीपी जगह है।
  4. ग्लूकोज-परख की तैयारी
    1. DDH 2 हे के 45 μl और एक 12-चैनल 50 μl पिपेट का उपयोग निष्प्रभावी हायड्रोलायसेट के 5 μl जोड़ने के माध्यम से 1:10 कमजोर पड़ने प्रदर्शन और एक सिलिकॉन टोपी चटाई के साथ MTPS को कवर किया। एक नई जांच के लिए इस्तेमाल किया एमटीपी करने के लिए तीन बार अलग अलग ग्लूकोज मानकों (500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2.5 और 0 माइक्रोन) के 50 μl जोड़ें।
    2. एक 12-चैनल 50 μl पिपेट का उपयोग ग्लूकोज-परख अभिकर्मक मिश्रण (नुस्खा step1.2.3) के 50 μl जोड़ें। फिर एक सिलिकॉन टोपी चटाई के साथ प्लेटों को कवर किया और 30 डिग्री सेल्सियस और एक एमटीपी-इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए 400 rpm पर सेते हैं।
  5. पाइरूवेट-परख की तैयारी
    1. एक 12 चैनल 200 μl पिपेट का उपयोग कर एक 1:20 कमजोर पड़ने प्रदर्शन करना। प्रत्येक अच्छी तरह से निष्प्रभावी हायड्रोलायसेट की DDH 2 हे के 95 μl और हस्तांतरण 5 μl जोड़ें। एक सिलिकॉन टोपी चटाई के साथ एमटीपी कवर।
    2. (Carboxymethylamino-कार्बोनिल) -4.4'-बीआईएस (dimethylamino) -diphenylamine सोडियम नमक (डीए -64), 300 μl 10 मिमी thiamine पाइरोफॉस्फेट, 60 μl 100 - पाइरूवेट-परख अभिकर्मक मिश्रण (3 मिलीग्राम 1 मिमी एन के 100 μl जोड़े मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड hexahydrate, 2.4 मिलीग्राम 500 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट Puffer (5.7 पीएच), 30 μl 100 यू पाइरूवेट oxidase, 12 μl 1,000 यू हॉर्सरैडिश peroxidase और 24.19 मिलीलीटर DDH 2 हे) एक 12 चैनल 200 μl पिपेट का उपयोग।
    3. एक सिलिकॉन टोपी चटाई एक साथ प्लेट कवरएन डी 37 डिग्री सेल्सियस और 30 मिनट के लिए 150 rpm पर सेते हैं। सीधे 727 और 540 एनएम पर एक एमटीपी-रीडर में ऊष्मायन के उपाय absorbance के बाद।
  6. स्वचालित स्क्रीनिंग और कार्बोहाइड्रेट उंगलियों के निशान के सभी परिणाम मूल्यांकन।
    1. उन नमूनों कि अवसादन में कमी आई शो के बाद मुख्य संस्कृति प्लेटों centrifuged किया गया है और हिंडोला (चिपचिपापन नियंत्रण कदम 1.4.1) के लिए वापस संग्रहीत का ध्यान रखना। नमूने है कि गोली गठन नहीं दिखा सकारात्मक रहे हैं (स्वचालित स्क्रीनिंग के लिए कसौटी 1)।
    2. अत्यधिक चिपचिपा supernatants, जो छानने कदम (उच्च चिपचिपापन नियंत्रण कदम 1.5.4.6) के बाद फिल्टर प्लेट में बच द्वारा संकेत कर रहे हैं का ध्यान रखना। छानना की कमी निम्न विश्लेषणात्मक मॉड्यूल में एक झूठी नकारात्मक परिणाम हो सकता है। नमूने है कि फिल्टर कुओं में संस्कृति supernatants बनाए रखने के लिए सकारात्मक रहे हैं (यह भी स्वचालित स्क्रीनिंग के लिए 1 कसौटी)।
    3. दिखने में ऊष्मायन के बाद फाइबर या परत के गठन का पालन। वें के रूप में नोट ले लोहै polysaccharides इंगित करता है। दर के साथ कोई वर्षा (-); साथ (+) फाइबर या गुच्छे की कम वर्षा और के साथ उच्च वर्षा (++)। इसके अलावा, पहली में फाइबर और गुच्छे के अवलोकन के माध्यम से फिल्टर झिल्ली पर बहुलक का पता लगाने के सोखना, लेकिन दूसरे वर्षा (स्वचालित स्क्रीनिंग के लिए कसौटी 2) में नहीं है।
    4. ग्लूकोज एकाग्रता की गणना के लिए एक रेखीय अंशांकन प्रदर्शन करना।
      1 समीकरण
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    5. 5 0.1 ग्राम / एल ग्लूकोज के बीच रेखीय अंशांकन (एकाग्रता से अधिक अवशोषण) प्रदर्शन करना। hydrolyzed पॉलिमर के ग्लूकोज बराबर की गणना और निम्नलिखित मानकों के द्वारा मूल्यांकन करें: ग्लूकोज बराबर:> 700 मिलीग्राम / एल = सकारात्मक; 300-700 मिलीग्राम / एल = ख्यात सकारात्मक; <ईपीएस प्रारूप के संबंध में 300 मिलीग्राम / एल = नकारात्मकआयन (स्वचालित स्क्रीनिंग के लिए कसौटी 3)।
      2 समीकरण
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    6. एचटी-पीएमपी विधि के साथ निर्धारित सभी कार्बोहाइड्रेट यों। सभी मात्रा को योग और इस प्रकार का मूल्यांकन:> 300 मिलीग्राम / एल (सकारात्मक); 150-300 मिलीग्राम / एल (ख्यात सकारात्मक) और <150 मिलीग्राम / एल (नकारात्मक)।
    7. पाइरूवेट एकाग्रता की गणना के लिए एक रेखीय अंशांकन (100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5 और 0 माइक्रोन) के प्रदर्शन करते हैं। सतह पर तैरनेवाला में शेष पाइरूवेट बाहर करने के लिए, हाइड्रोलिसिस से पहले पाइरूवेट सामग्री के माध्यम से हाइड्रोलिसिस के बाद पाइरूवेट सामग्री सही।
      3 समीकरण
      इस equat का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआयन।

Representative Results

फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि के सत्यापन की .9998 (तालिका 2) दृढ़ संकल्प (r²) के गुणांक के साथ अच्छा परिणाम दिखाया। 5 ग्राम / एल एकाग्रता भिन्नता (सीवी) के गुणांक और सटीकता के लिए 1.8% और 2.2% त्रुटि है, लेकिन 5.3% (सीवी) और 6.1% त्रुटि के साथ 0.25 छ / एल मानक के लिए कम प्रदर्शन के साथ एक अच्छा प्रदर्शन (दिखाया पूर्वाग्रह)।

दोनों पाइरूवेट-परख अंशांकन घटता के साथ (और मैट्रिक्स के बिना) के निर्धारण के गुणांक 150 सुक्ष्ममापी (3 टेबल) के एक अंशांकन रेंज में थे> 0.9999। उच्चतम और निम्नतम स्तर अंशांकन के लिए भिन्नता (सीवी) के गुणांक <4.6% थे और सटीकता के कम से कम 3.9% त्रुटि के साथ पूरा अंशांकन रेंज पर एक बहुत अच्छा प्रदर्शन दिखाया। इस प्रकार, हाइड्रोलिसिस कदम से मैट्रिक्स एंजाइमी परख पर कोई प्रभाव है, जो इसलिए Meas करने में सक्षम है दिखायाUre पाइरूवेट से पहले और बाद हाइड्रोलिसिस।

तालिका 4 तीन अनुकरणीय उपन्यास उपभेदों के रूप में सफलतापूर्वक स्क्रीनिंग मंच के साथ पहचान की विस्तृत परिणामों से पता चलता है। तालिका के बाएं हिस्से चिपचिपापन गठन, बहुलक उत्पादन और कुल हाइड्रोलिसिस जो विस्तृत कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट विश्लेषण के लिए मूल्यांकन के मापदंडों के रूप में इस्तेमाल किया गया से ग्लूकोज बराबर के विषय में स्वचालित स्क्रीनिंग मॉड्यूल के परिणामों को प्रदर्शित करता है। कार्बोहाइड्रेट calibrated शक्कर के साथ ही अज्ञात शर्करा, dimers और substituents के आधार पर फिंगरप्रिंट तालिका के दाहिने हिस्से में दिया जाता है। इस जानकारी का उपयोग करके monomeric रचना की गणना है और पहले से ही ज्ञात बहुलक संरचनाओं के साथ तुलना की जा सकती। इसके अलावा, दिलचस्प monomeric रचनाओं और दुर्लभ कार्बोहाइड्रेट के लिए एक लक्षित स्क्रीनिंग प्रदर्शन किया जा सकता है।

माइक्रो के उच्च प्रदर्शनपैमाने हाइड्रोलिसिस और एचटी-पीएमपी-derivatization हमारे पिछले काम 14 में प्रदर्शन किया गया। इसके अलावा, जेल निस्पंदन और विभिन्न पीढ़ी के लिए कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट के सत्यापन के एक अन्य प्रकाशन 6 में वर्णित किया गया है। संक्षेप में, अपनी मॉड्यूलर संरचना के साथ स्क्रीनिंग मंच आसानी से संशोधित और उपयोगकर्ता की व्यक्तिगत आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। मंच के स्वचालित स्क्रीनिंग एक आठ गुना अधिक throughput सक्षम बनाता है और विश्वसनीय परिणाम देता है। पाइरूवेट-परख की तरह उपन्यास विश्लेषणात्मक मॉड्यूल एकीकृत किया जा सकता है और कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट विश्लेषण के साथ संयोजन में वे पहचान ईपीएस के बारे में बहुत विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं। इस प्रकार, स्क्रीनिंग मंच आवश्यक है जब दोनों थोड़ा संशोधित और पूरी तरह से उपन्यास ईपीएस वेरिएंट के लिए खोज कर रहा है।

आकृति 1
चित्रा 1: मॉड्यूलर घंटा की समग्र योजनाigh-throughput exopolysaccharide स्क्रीनिंग मंच। स्वचालित स्क्रीनिंग पहले तीन कार्य भी शामिल है। बैक्टीरिया 96 अच्छी तरह प्लेटें में खेती कर रहे हैं के बाद, कोशिकाओं centrifugation (कार्य 1) ​​और एक 96 अच्छी तरह से छानने का काम (कार्य) 2 से हटा रहे हैं। फिर, विकास मीडिया से शेष monomeric शक्कर एक 96 अच्छी तरह से जेल निस्पंदन (कार्य 3) के माध्यम से हटा रहे हैं। नमूने युक्त ईपीएस कार्य 4 में मूल्यांकन कर रहे हैं स्क्रीनिंग मंच के कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट पिछले तीन कार्य शामिल हैं। कार्य 2 से सकारात्मक हिट की शेष छानना कार्य 6 में कार्य 5 में जेल छानना hydrolyzation के बाद कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट एचटी-पीएमपी विधि के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है (उच्च throughput 1-फिनाइल-3-मिथाइल के लिए आधार प्रदान करता है -5-pyrazolone, कार्य 7)। सभी कार्यों को अलग विश्लेषणात्मक मॉड्यूल और / या एक चिपचिपापन नियंत्रण से पालन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2: स्क्रीनिंग मंच के लिए रोबोट worktable सेटअप दोनों तरल से निपटने रोबोट Worktables के लेआउट दिखाए गए हैं:। (ए) रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली और (बी) के तरल से निपटने स्टेशन। (ए) सेटअप दो पदों (पदों 1-2 1-1), चार पदों (पदों 2-4 को 2-1) और प्रत्येक चार पदों के साथ तीन microplate वाहकों के साथ डिस्पोजेबल खरीदारों के लिए एक वाहक के साथ एक microplate वाहक होते हैं (पदों को 3-1 3-4 से, 4-1 4-4 और 5-1 के लिए 5-4)। इसके अलावा, वहाँ पाँच होटल 21 माइक्रो अनुमापांक-प्लेट के लिए सात गहरी अच्छी तरह से प्लेट (DWP) और चार होटल वाहक (6-9) प्रत्येक के लिए (1 से 5) वाहक प्रत्येक के साथ एक भंडारण हिंडोला है। हार्डवेयर तरल से निपटने रोबोट पर स्थापित डिस्पोजेबल सुझावों और एक रोबोट जोड़तोड़ (आरएम) कि betwee चालें प्लेटें / उपकरणों के साथ प्रयोग के लिए एक 96-चैनल-पिपेट हाथ हैn worktable, भंडारण हिंडोला, एमटीपी पाठक, सेंट्रीफ्यूज और मिलाते-इनक्यूबेटर। (बी) के तरल से निपटने स्टेशन एक तरल से निपटने हाथ के साथ सुसज्जित है और एक 8 चैनल 300 μl पिपेट, स्थिति 1 पर एक अपशिष्ट कंटेनर, 300 μl टिप्स (स्थिति 2), एक ऊंचाई एडाप्टर 30 के साथ एक टिप एडाप्टर के एक 250 मिलीलीटर के साथ MTPS के लिए गर्त (स्थिति) 3 और पांच ऊंचाई एडाप्टर 60 (8 की स्थिति 4)। पदों की नंबरिंग इस प्रोटोकॉल भर में जाना जाता है। अगर वहाँ बराबर setups उपलब्ध हैं वैकल्पिक Worktables भी इस्तेमाल किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: 16 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पाइरूवेट-परख के माध्यम से निर्धारित पॉलिमर के पाइरूवेट सामग्री। 1 जी / एल बहुलक समाधान के बादएस hydrolyzed और निष्प्रभावी रहे थे, पाइरूवेट-परख 1:10 कमजोर पड़ने से प्रदर्शन किया गया था (एन = 3)। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: मॉड्यूलर उच्च throughput स्क्रीनिंग मंच के फ्लो चार्ट। स्वचालित स्क्रीनिंग प्रणाली है, जो अलग-अलग polysaccharide का पता लगाने के मॉड्यूल को जोड़ती है: चिपचिपापन गठन, बहुलक उत्पादन और कुल कार्बोहाइड्रेट सामग्री के निर्धारण का विश्लेषण। दूसरे भाग पहले भाग में पहचान की सभी चयनित ईपीएस उत्पादकों के लिए एक विस्तृत मोनोसैकराइड विश्लेषण प्रदान करता है। UHPLC-ईएसआई एमएस के माध्यम से कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट से स्वचालित स्क्रीनिंग से सभी डेटा और डेटा एक डेटाबेस में एकत्र की है और alr की संरचनात्मक रूप से संबंधित वेरिएंट की सरल पहचान सक्षम रहे हैंEady जाना जाता ईपीएस या उपन्यास ईपीएस और इसलिए, एक लक्षित स्क्रीनिंग। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मुख्य कदम / विश्लेषणात्मक मॉड्यूल कार्यप्रवाह अवलोकन / विवरण
उपभेदों की खेती 1 मिलीलीटर ईपीएस-मध्यम एक
प्री-संस्कृति 48 घंटा, 30 डिग्री सेल्सियस, 1000 rpm एक
मुख्य-संस्कृति 48 घंटा, 30 डिग्री सेल्सियस, 1000 rpm एक 		ईपीएस का उत्पादन
सेल को हटाने / चिपचिपापन Centrifugation: 4300 XG पर 30 मिनट कोई गोली = वृद्धि हुई चिपचिपापन = सकारात्मक
पॉलिमर की जांच: वर्षा 50 μl सुpernatant + 150 μl 2-propanol ख
आरटी पर 10 मिनट और 900 आरपीएम ख हिलती 		दृश्य: फाइबर और गुच्छे = बहुलक का सकारात्मक वर्षा
सेल को हटाने / उच्च चिपचिपापन मुख्य-संस्कृति के 180 μl सतह पर तैरनेवाला
Centrifugation: 3,000 XG पर 10 मिनट
1.0 माइक्रोन ग्लास फाइबर झिल्ली 		कोई भी फ़िल्टर गुजर = उच्च चिपचिपाहट = सकारात्मक
पॉलिमर की जांच: वर्षा 50 μl छानना + 150 μl 2-propanol ख
आरटी पर 10 मिनट और 900 आरपीएम ख हिलती 		दृश्य: फाइबर और गुच्छे = बहुलक का सकारात्मक वर्षा
ग्लूकोज की खपत:
ग्लूकोज-परख 		कमजोर पड़ने 1: 100:
10 μl छानना + 990 μl DDH 2 हे
50 μl विभाज्य + 50 μl REAGईएनटी मिश्रण
ऊष्मायन 30 30 डिग्री सेल्सियस 150 rpm पर मिनट
मापन 418-480 एनएम 		खेती के बाद ग्लूकोज शेष
जेल निस्पंदन संतुलन:
3 एक्स 150 μl एनएच 4 -acetat बफर पीएच 5.6
2,000 XG पर 2 एक्स 2 मिनट
1,000 XG पर 1 एक्स 2 मिनट
जेल निस्पंदन:
35 μl छानना, 1000 XG पर 2 मिनट
धुलाई:
3 एक्स 150 μl DDH 2 हे, 2,000 XG पर 2 मिनट
भंडारण के लिए 75 μl 20% इथेनॉल 		पॉलिमर शुद्धि:
लवण, पाइरूवेट, ग्लूकोज और अन्य चीनी monomers खेती सतह पर तैरनेवाला से हटाने की
जेल निस्पंदन के बाद शेष ग्लूकोज
ग्लूकोज-परख 		कमजोर पड़ने 01:10:
25 μl DDH 2 ओ +
20 μl DDH 2 हे और 5 μl छानना
+ 50 μl अभिकर्मक मिश्रण मापन 418-480 एनएम 		फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि से जेल छानने के बाद शेष ग्लूकोज के घटाव
ग्लूकोज बराबर:
फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि ग 		20 μl जेल छानना + 180 μl फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड (30 μl 5% (w / v) DDH में फिनोल 2 ओ + 150 μl सान्द्र। एच 2 अतः 4 (ρ = 1.84 g / एमएल))
900 rpm पर 5 मिनट हिलती
ऊष्मायन 35 80 डिग्री सेल्सियस पर मिनट
480 एनएम पर मापन 		ग्लूकोज बराबर:
Δ (फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड मूल्य - जेल छानने के बाद शेष ग्लूकोज)
<300 मिलीग्राम / एल नकारात्मक
> 300 और <700 मिलीग्राम / एल ख्यात सकारात्मक
> 700 मिलीग्राम / एल सकारात्मक
एक मैन्युअल बाँझ शर्तों (लामिना का प्रवाह) के तहत संभाला।
ख ज्वलनशील तरल एक धूआं हुड के तहत मैन्युअल संभाला।
ग फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड ब्रांड तरल एक धूआं हुड के तहत स्टेशन (LHS) हैंडलिंग के साथ संभाला।

तालिका 1:। रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली और तरल से निपटने स्टेशन के साथ स्वचालित prescreening का पूरा कार्यप्रवाह स्वचालित विश्लेषणात्मक मॉड्यूल के लिए सभी मापदंडों का अवलोकन।

linearity लोद LOQ
r² एक ढलान एक ऑफसेट एक मिलीग्राम / एल मिलीग्राम / एल
0.9998 0.0007 -0.021 50 100
मानक मतलब ख प्रेसिजन ख सटीकता ख
मिलीग्राम / एल मिलीग्राम / एल सीवी% पूर्वाग्रह (% त्रुटि)
5000 5112 1.8 2.2
250 265 5.3 6.1
0.1 से 5 ग्राम / एल के लिए आठ माप, छह स्तरों ग्लूकोज के साथ अंशांकन का एक मतलब
बी एक छात्र की टी परीक्षण के साथ प्रदर्शन किया (α = 0.05; एन = 8)।
लोद: दृढ़ संकल्प की सीमा, LOQ: मात्रा का ठहराव की सीमा, सीवी: विभिन्नता का गुणांक।

सारणी 2:फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि के मान्यकरण तरल स्टेशन से निपटने के साथ बाहर किया गया था। Linearity एक छह बिंदु अंशांकन के आधार पर गणना की गई (एन = 8)। मतलब, सटीक और दो exemplarily चुना ग्लूकोज सांद्रता की सटीकता यहां दिए गए हैं।

linearity LOQ
r² एक ढलान एक ऑफसेट एक सुक्ष्ममापी
मैट्रिक्स के बिना 0.99999 0.0223 -0.०,०१९ 1
पतला 1:10 मैट्रिक्स 0.99999 0.0221 -0.०,०११ 1
मानक मतलब ख प्रेसिजन ख सटीकता ख
सुक्ष्ममापी सुक्ष्ममापी सीवी% पूर्वाग्रह (% त्रुटि)
मैट्रिक्स के बिना 50 49.96 3.05 -0.09
1 1.04 2.95 3.86
पतला 1:10 मैट्रिक्स 50 49.98 0.44 -0.04
1 1.00 4.58 0.33
तीन माप, 1 से 50 माइक्रोन के लिए पाइरूवेट के छह सांद्रता के साथ अंशांकन का एक मतलब।
बी (एन = 3)
LOQ: मात्रा का ठहराव की सीमा, सीवी: विभिन्नता का गुणांक।

तालिका 3:। के साथ और एक पतला 1:10 निष्प्रभावी trifluoroacetic एसिड मैट्रिक्स के बिना पाइरूवेट-परख के मान्यकरण दो से छह बिंदु calibrations (एन = 3) के साथ और बिना मैट्रिक्स प्रभावों के मूल्यांकन प्रदर्शन किया गया। मतलब, सटीक और के साथ और एक 1:10 कमजोर पड़ने के प्रभाव के बिना दो exemplarily चुना पाइरूवेट सांद्रता की सटीकता की गणना की गई।

तालिका 4
सारणी 4:।। तीन अनुकरणीय मंच के साथ जांच की नस्लों के परिणाम डेटा स्वचालित स्क्रीनिंग और कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट से एकत्र ग कृपयायहाँ चाटना एक माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल फाइल के रूप में इस तालिका डाउनलोड करने के लिए।

कार्बोहाइड्रेट अवशोषण अधिकतम [एनएम] 480 एनएम मतलब ± एसडी पर अवशोषण Absorbance रिश्तेदार ग्लूकोज [%]
Diutan गम 470 0.342 ± 0.010 187
Gellan गम 472 0.334 ± 0.002 183
ग्वार गम 478 0.387 ± 0.017 212
Gummi अरबी 476 0.393 ± 0.034 215
हाईऐल्युरोनिक एसिड 484 0.231 ± 0.011 126
Karaya गम 478 0.455 ± 0.023 249
Konjac गम 480 0.297 ± 0.009 163
एक प्रकार का वृक्ष गम 480 0.337 ± 0.032 185
शलभ फली गोंद 478 0.354 ± 0.033 194
Scleroglucan 484 0.168 ± 0010 92
Succinoglycan 482 0.168 ± 0.005 92
तारा गम 480 0.318 ± 0.016 174
tragacanth 478 0.513 ± 0.003 281
Welan गम 472 0.226 ± 0.016 124
xylan 472 0.567 ± 0.007 311
जिंक गम 482 0.245 ± 0.021 134
शर्करा 484 0.191 ± 0.014 100
एसडी: मानक विचलन

तालिका 5:। परिणाम के रूप में 16 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलिमर और ग्लूकोज के लिए फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि द्वारा प्राप्त 16 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलिमर (1 जी / एल) के 480 एनएम पर अवशोषण अधिकतम और अवशोषण के रूप में अच्छी तरह के रूप में ग्लूकोज (1 जी / एल ) फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड पद्धति लागू मापा गया। सभी पॉलिमर के ग्लूकोज को absorbance के रिश्तेदार गणना की गई।

मानक मतलब प्रेसिजन एक सटीकता एक
मिलीग्राम / एल मिलीग्राम / एल सीवी% पूर्वाग्रह (% त्रुटि)
1:10 कमजोर पड़ने 450 460 1.01 2.14
45 44.7 1.41 -0.70
1: 100 कमजोर पड़ने 4500 5026 1.19 11.6
450 471 1.16 4.55
बी एक छात्र की टी परीक्षण के साथ प्रदर्शन किया (α = 0.05; एन = 8)।
सीवी: विभिन्नता का गुणांक।

टेबल 6:। ग्लूकोज-परख के लिए स्वचालित कमजोर पड़ने के मान्यकरण खेती (1: 100) के बाद ग्लूकोज-परख के लिए कमजोर पड़ने और जेल निस्पंदन (1:10) के बाद मान्य किया गया। दो ग्लूकोज सांद्रता (एन = 8) तरल हैंडलिंग प्रणाली के माध्यम से पतला है और मूल्यांकन किया गया। मतलब, सटीक और सटीकता की गणना की गई।

सैद्धांतिक ग्लूकोज मूल्य सिलिकॉन टोपी चटाई के साथ कवर किया वाष्पीकरण की टेस्ट (खुला)
मतलब एक प्रेसिजन एक सटीकता एक मतलब एक प्रेसिजन एक सटीकता एक </ Strong> भाप
मिलीग्राम / एल मिलीग्राम / एल सीवी % पूर्वाग्रह (% त्रुटि) मिलीग्राम / एल सीवी % पूर्वाग्रह (% त्रुटि) % त्रुटि
45.0 45.2 0.69 0.44 46.0 0.66 2.05 1.60
18.0 17.7 0.80 -1.68 18.0 0.72 -0.01 1.69
9.0 8.74 1.20 -2.98 8.92 0.81 -0.95 2.09
4.5 4.50 1.26 -0.04 4.58 1.57 1.76 1.80
1.8 1.85 0.74 2.90 2.01 2.82 11.6 8.48
0.9 1.03 1.43 14.1 1.16 3.52 28.3 12.4
एक (एन = 4)
सीवी: विभिन्नता का गुणांक।

टेबल 7:। कवर किया और खुला एमटीपी छह अलग ग्लूकोज मानकों के वाष्पीकरण प्रभाव का मूल्यांकन (एन = 4) कमरे के तापमान पर 3.5 घंटे के लिए हिंडोला में संग्रहीत किया गया। वाष्पीकरण के प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से मानक नमूनों का पर्दाफाश का उपयोग कर कवर (सिलिकॉन चटाई) द्वारा मूल्यांकन किया गया था। मतलब, सटीक, सटीकता और% त्रुटि में वाष्पीकरण की गणना की गई।

इससे पहले जेल निस्पंदन <टीडी> 25.1
जेल छानने के बाद जेल निस्पंदन के बाद शेष ग्लूकोज
मतलब एक एसडी एक मतलब एक एसडी एक
मिलीग्राम / एल मिलीग्राम / एल मिलीग्राम / एल मिलीग्राम / एल %
1 8647 110 259 121 3.00
2 5108 56 116 37 2.27
3 2,014 12 50.8 14 2.52
4 1,015 12 8.1 2.47
5 510 4.9 12.8 4.3 2.51
6 223 8.6 6.6 1.5 2.94
7 122 5.6 4.3 0.9 3.48
8 75 6.0 3.1 0.3 4.18
एक (एन = 8)
एसडी: मानक विचलन

टेबल 8:। जेल निस्पंदन कुशलता का परिणाम आठ अलग ग्लूकोज मानकों से पहले और जेल छानने के बाद निर्धारित किया गया है जेल निस्पंदन की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए। मतलब, मानक विचलन और शेष ग्लूकोज के बाद% में जेल निस्पंदन गणना की गई।

Discussion

फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि के साथ Polysaccharide का पता लगाने: विभिन्न monosaccharides विभिन्न अवशोषण Maxima और इस विधि के प्रयोग से 9 दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक दिखा। इस पॉलिमर, जो अलग अलग मात्रा में कई शर्करा को नियंत्रित के विभिन्न अवशोषण Maxima में यह परिणाम है। 16 विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलिमर के लिए अवशोषण Maxima के विभिन्न तरंग दैर्ध्य DDH 2 हे में 5 तालिका में दिया जाता है। पॉलिमर भंग कर रहे थे (1 जी / एल), हड़कंप मच गया (150 आरपीएम) रातोंरात और फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड-विधि के साथ मापा जाता । Diutan गम 470 एनएम और scleroglucan और hyaluronic एसिड 484 एनएम पर उच्चतम में सबसे कम अवशोषण Maxima दिखाया। इन परिणामों के आधार पर 480 एनएम इस स्क्रीनिंग मंच के लिए चुना गया था। पॉलिमर के सापेक्ष absorbance absorbance 1 जी / एल ग्लूकोज (100% के रूप में सेट) के साथ प्राप्त के आधार पर गणना की गई। सबसे कम परिणाम 92% के साथ scleroglucan और succinoglycan, दोनों के साथ प्राप्त किया गया। इस ऍक्स्प थाected क्योंकि scleroglucan केवल ग्लूकोज होता है और succinoglycan 7 के अनुपात में ग्लूकोज और गैलेक्टोज शामिल हैं: 1। दोनों वाणिज्यिक पॉलिमर सुखाने और विभिन्न राख सामग्री के विभिन्न नुकसान है, इस कारण ~ 110% की सैद्धांतिक मूल्य तक पहुँच नहीं किया गया है। Xylan 311% के साथ उच्चतम रिश्तेदार absorbance दिखाया। इस का कारण यह और अधिक प्रभावी furanose फार्म के कारण उच्च दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक सिलोज़ से हासिल की है। 0.1 ग्राम / एल ग्लूकोज के स्तर पर मात्रा का ठहराव अंत तक पहुँच गया था, साथ ही एक एकाग्रता <0.05 g / एल पर सीमा का पता लगाने। हालांकि, स्क्रीनिंग में सकारात्मक उपभेदों के लिए सीमा का पता लगाने की तुलना में अधिक 0.7 ग्राम / एल है और इसलिए, परख एक अच्छा प्रदर्शन दिखाया। आदेश विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, जेल-छानने के बाद शेष ग्लूकोज एक ग्लूकोज-परख के साथ निर्धारित किया गया था और यह मान फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि से मूल्य से घटाया गया था।

स्वचालित ग्लूकोज-परख कमजोर पड़ने प्रदर्शनखेती (कमजोर पड़ने 1: 100) के बाद ग्लूकोज निर्धारण की जांच की गई। इस के लिए, सतह पर तैरनेवाला के 10 μl एक गहरी अच्छी तरह से थाली में DDH 2 हे के 990 μl को हस्तांतरित और दस बार श्वास और इस कमजोर पड़ने से बाहर 180 μl वितरण के माध्यम से मिलाया गया। दूसरा महत्वपूर्ण कदम जेल छानने के बाद ग्लूकोज-परख से 1:10 कमजोर पड़ने के लिए केवल 5 μl विभाज्य का सही pipetting था। आदेश DDH 2 हे के कमजोर पड़ने के 25 μl उत्पन्न करने के लिए एक 50 μl की नोक के साथ पहली बार स्थानांतरित कर दिया गया, DDH 2 हे और 5 μl जेल छानना के बाद में 20 μl एक साथ aspirated थे। इस टिप में से 5 μl विभाज्य का एक बेहतर हटाने सुनिश्चित करता है। दोनों कमजोर पड़ने कदम एक ग्लूकोज-परख के माध्यम से विभिन्न ग्लूकोज मानकों के साथ सत्यापित कर रहे थे। ग्लूकोज सामग्री का निर्धारण करने के लिए 100 कमजोर पड़ने के बाद खेती एक CV & # के साथ दोनों मानकों के लिए उच्च परिशुद्धता दिखाया: दो अनुकरणीय सांद्रता के लिए परिणाम तालिका 6 में दिए गए हैं 1।60; 1.2%। इसी समय, उच्च मानक के लिए सटीकता 11.6 (% त्रुटि) तक गया था। हालांकि, इस नगण्य रूप में ग्लूकोज दृढ़ संकल्प की खेती के बाद ही शेष ग्लूकोज सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है और इसलिए, बहुलक का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है। जेल छानने के बाद शेष ग्लूकोज के लिए 1:10 कमजोर पड़ने एक CV <1.4% और एक सटीकता <2.1% त्रुटि के साथ बहुत विश्वसनीय नतीजे बताते हैं।

वाष्पीकरण के विचार: स्क्रीनिंग पहले ग्लूकोज-परख करने के लिए पहला कदम से 3.5 मानव संसाधन की आवश्यकता है। आदेश में इस समय सीमा के नवोदित एमटीपी भंडारण पर एक प्रभाव है कि क्या पता लगाने के लिए, में, ग्लूकोज-परख अंशांकन मानकों के 50 μl के साथ और रोबोट हिंडोला में 3.5 घंटे के लिए कवर के बिना संग्रहीत किया गया। अंशांकन रेंज (45 करने के लिए 4.5 मिलीग्राम / एल) में नमूना एकाग्रता शायद ही वृद्धि हुई है। वृद्धि हुई है - वाष्पीकरण की वजह से - 2.1% नीचे और केवल दो सबसे कम सांद्रता (1.8 और 0.9 मिलीग्राम / एल) यह 12.4% तक पहुँच (लिए किया गया था

जेल निस्पंदन: गैर metabolized ग्लूकोज की उच्च मात्रा में hydrolyzed बहुलक से ग्लूकोज की मात्रात्मक का पता लगाने परेशान। इसलिए, एक जेल निस्पंदन कदम खेती के बाद शेष ग्लूकोज को दूर करने के लिए आवश्यक था। इसके अतिरिक्त, जेल निस्पंदन लवण और monomeric कार्बोहाइड्रेट यौगिकों, ग्लूकोज की तुलना दूसरों से सतह पर तैरनेवाला युक्त बहुलक शुद्ध, मोनोमर विश्लेषण में विश्लेषणात्मक पृष्ठभूमि कम से कम। जेल निस्पंदन कदम पर छानना के 35 μl अच्छी तरह से केंद्र में रखा गया था। स्वचालित प्रणाली में जेल निस्पंदन की मजबूती के सत्यापन के लिए, 0.045 से आठ अंशांकन मानकों 9 ग्राम / एल ग्लूकोज के लिए ऊपर filtrated थे (एन = 8)। हर एकाग्रता की ग्लूकोज हमेशा प्रारंभिक मूल्य (तालिका 8) के 95% से अधिक की कमी थी। ऐसा करने में, जेल निस्पंदन ग्लूकोज के विभिन्न सांद्रता के लिए बहुत अच्छा परिणाम दिखाया। इसके अतिरिक्त, शेष ग्लूकोज के बाद जेल-एफiltration भी एक ग्लूकोज-परख के साथ चुना गया और hydrolyzed बहुलक के लिए ग्लूकोज बराबर की सही मात्रा में प्राप्त करने के लिए फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड दृढ़ संकल्प से घटाया गया था।

पाइरूवेट-परख: सबसे पहले, यह जांच की गई निष्प्रभावी और पतला (1:10) हाइड्रोलिसिस कदम से टीएफए मैट्रिक्स enzymatic प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप है। इसलिए, पूरी परख दो बार मैट्रिक्स के बिना के साथ एक बार और एक बार प्रदर्शन किया, और विश्वसनीय परिणामों से पता चला था। अंत में, 16 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलिमर के पाइरूवेट सामग्री सफलतापूर्वक मापा गया था और 3 चित्र में दिखाया गया है। यह आम तौर पर जाना जाता है कि उन 16 पॉलिमर के बाहर केवल succinoglycan और जिंक स्वाभाविक रूप से पाइरूवेट होते हैं। हमारे पाइरूवेट-परख के साथ पॉलिमर के इन दोनों को सही ढंग से पहचान की गई। scleroglucan में, welan गम और xylan पाइरूवेट भी काफी मात्रा में पाया गया था। कुल मिलाकर, दृष्टिकोण की क्षमता मान्य किया गया था और पाइरूवेट-परख रोंएक उच्च प्रदर्शन howed। यह हाइड्रोलिसिस के बाद विभिन्न पॉलिमर में पाइरूवेट पता लगाने में सक्षम साबित हुई।

कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट: स्वचालित स्क्रीनिंग में सभी विश्लेषणात्मक मॉड्यूल प्रदर्शन के बाद, संभावित ईपीएस उत्पादकों कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट विश्लेषण के लिए चयन किया गया था। इसके लिए कई मानदंड लागू किया गया है: 1) चिपचिपापन के सकारात्मक अवलोकन centrifugation के बाद और / या छानने के बाद। 2) वर्षा से पहले और छानने के बाद। मनाया फाइबर और गुच्छे सकारात्मक रूप में मूल्यांकन किया गया। 3) फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि से ग्लूकोज बराबर मूल्य। मान> 700 मिलीग्राम / एल सकारात्मक रूप में मूल्यांकन किया गया था और 300 और 700 मिलीग्राम / एल के बीच मूल्यों ख्यात ईपीएस उत्पादकों के रूप में मूल्यांकन किया गया। दो या तीन मानदंडों सकारात्मक रूप में मूल्यांकन किया गया है, उपभेदों आगे कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट विश्लेषण के लिए चयन किया गया था। मानदंड ईपीएस स्क्रीनिंग (जैसे कम चिपचिपापन ईपीएस) के अलग-अलग उद्देश्य के प्रति अनुकूलित किया जा सकता है। हमारा दृष्टिकोण effici खोजने के उद्देश्य सेईएनटी उत्पादकों EPS। जब उपभेदों कि केवल ईपीएस की छोटी मात्रा में उत्पादन के लिए खोज ग्लूकोज बराबर के मूल्यांकन लिमिट कम किया जाना चाहिए।

तकनीकी लाभ और भविष्य के आवेदन: इस प्रोटोकॉल का एक दिलचस्प सुविधा कदम और विभिन्न विश्लेषणात्मक मॉड्यूल की मॉड्यूलर चरित्र है। वे अलग अलग तरीकों से जोड़ा जा सकता है व्यक्तिगत आवश्यकताओं के लिए निकाला जाता है और उपन्यास मॉड्यूल को आसानी से लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए इसके अलावा, विश्लेषणात्मक मॉड्यूल, अलग से इस्तेमाल किया जा सकता एचटी-पीएमपी-derivatization मॉड्यूल के साथ संयोजन में हाइड्रोलिसिस मॉड्यूल 96 अच्छी तरह प्रारूप में अलग बहुलक समाधान (1 जी / एल) से एक मोनोमेरिक संरचना विश्लेषण प्रदर्शन करने में सक्षम है। एक तरल हैंडलिंग प्रणाली पूरा स्क्रीनिंग pipetting योजना में किसी भी बदलाव के बिना मैन्युअल नियंत्रित किया जा सकता करने के लिए उपयोग किए बिना प्रयोगशालाओं के लिए। हालांकि, एक तरल से निपटने प्रणाली का उपयोग करने के लिए ऊपर 768 उपभेदों (के बजाय 192 उपभेदों यदि screene को throughput बढ़ जाती हैप्रति दिन मैन्युअल डी)। प्रोटोकॉल है कि यहाँ वर्णित है अलग पीढ़ी के लिए एक स्क्रीनिंग में सक्षम है और इसलिए, बड़े तनाव संग्रह उपन्यास ईपीएस उत्पादकों की पहचान करने और एक दृष्टिकोण (चित्रा 4) में उनके कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट का विश्लेषण करने की स्क्रीनिंग के लिए। इसके अलावा, fucose की तरह दुर्लभ शर्करा, uronic एसिड या यहां तक ​​कि अज्ञात शर्करा युक्त polysaccharides के लिए एक लक्षित स्क्रीनिंग विस्तृत मोनोसैकराइड विश्लेषण के माध्यम से किया जा सकता है। इसके अलावा, परिभाषित अनुपात में विभिन्न चीनी संयोजन का पता लगाया जा सकता है। यह पहले से ही ज्ञात ईपीएस या उपन्यास ईपीएस के संरचनात्मक रूप से संबंधित वेरिएंट की सरल पहचान सक्षम बनाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well deep well plate 2.0 ml (DWP) Greiner Bio-One 780271 Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990 µl of ddH2O
Breathable Sealing Film Axygen BF-400-S Incubation film for pre- and main-culture DWP
Aluminum Sealing Film Axygen PCR-AS-200 -80 °C storage film for glycerol-stock plates
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl TECAN 30038619 Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)
A/B glass-filter-plate 1 µm Pall Corporation PN 8031 Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well micro titer plate V-Bottom Greiner Bio-One 651201 Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well SpinColumn G-25 Harvard Apparatus 74-5612 Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)
96-well micro titer plate V-Bottom Nunc 249944 Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips TECAN 30038609 Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)
Trough 250 ml Axygen Res-SW96-HP Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetate buffer pH 5.6 (CP 5-7)
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP) Greiner Bio-One 655101 precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)
96-well silicon cap mat  Whatmann 7704-0105 Cover mat for MTP
200 µl pipette tips Sarstedt 70.760.002 For manually handling
1,000 µl pipette tips Sarstedt 70.762 For manually handling
96-well-PCR micro titer plate  Brand 781350 Hydrolysis, PMP-derivatisation
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat  Brand 781405 Hydrolysis, PMP-derivatisation
Filter plate 0.2 µm Supor Pall Corporation PN 8019 Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate
Pipette Tips LHS 5-300 µl Brand 732150 Brand LHS system
Glucose oxidase  Sigma-Aldrich G2133 Glucose-assay
Horseradish peroxidase  Sigma-Aldrich P6782 Glucose-assay, pyruvat-assay
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt) Wako Chemicals GmbH 043-22351 Pyruvat-assay
Pyruvate oxidase  Sigma-Aldrich P4591 Pyruvat-assay
Potassium phosphate dibasic Carl-Roth P749.3 Pyruvat- and glucose-assay
Potassium phosphate monobasic Carl-Roth 3904.3 Pyruvat- and glucose-assay
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754 Pyruvat-assay
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 31413 Pyruvat-assay
2-Propanol VWR 20922.466 Precipitation
Phenol VWR 20599.231 Phenol-sulfuric-acid method
Sulfuric acid Carl-Roth 4623.4 Phenol-sulfuric-acid method
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508 Hydrolysis
Ammonium solution Carl-Roth P093.1 Hydrolysis, PMP-derivatization
Ethanol absolut VWR 20821.321 Hydrolysis, PMP-derivatization
Phenol red  Alfa Aesar B21710 Hydrolysis, PMP-derivatization
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone Sigma-Aldrich M70800 PMP-derivatization
Methanol LC-MS VWR 83638.320 PMP-derivatization
Acetonitril LC-MS VWR 83040.320 PMP-derivatization
Acetic acid Sigma-Aldrich 338826 PMP-derivatization
Ethanol absolut VWR 20821.321 PMP-derivatization
Methyl red Alfa Aesar 36667 pH-value
Robotic liquid handling system  Tecan Freedom EVO Worktable setup in Figure 2
Liquid handling station LHS Brand 709400 Worktable setup in Figure 2
Tip-Adapter Brand 709434 Worktable setup in Figure 2
Liquid Ends MC 20-300 µl Brand 709416 Worktable setup in Figure 2
Adapter 60 mm Brand 709430 Worktable setup in Figure 2

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References

  1. Milani, J., Maleki, G. Ch. 2, Hydrocolloids in Food Industry. Food Industrial Processes - Methods and Equipment. Valdez, B. 2, InTech. (2012).
  2. Thibodeau, A. Protecting the skin from environmental stresses with an exopolysaccharide formulation. Cosmet Toiletries. 120 (12), 81-90 (2005).
  3. Prajapati, V. D., Jani, G. K., Zala, B. S., Khutliwala, T. A. An insight into the emerging exopolysaccharide gellan gum as a novel polymer. Carbohydr Polym. 93 (2), 670-678 (2013).
  4. Schmidt, W., Brouwers, H. J. H., Kuehne, H. C., Meng, B. The working mechanism of starch and diutan gum in cementitious and limestone dispersions in presence of polycarboxylate ether superplasticizers. Appl. Rheol. 23 (5), 52903 (2013).
  5. Srinivasan, R. Natural Polysaccharides as Treatment Agents for Wastewater. Green Materials for Sustainable Water Remediation and Treatment. , The Royal Society of Chemistry. 51-81 (2013).
  6. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. High throughput exopolysaccharide screening platform: From strain cultivation to monosaccharide composition and carbohydrate fingerprinting in one day. Carbohydr Polym. 122, 212-220 (2015).
  7. Ortega-Morales, B. O., et al. Characterization of extracellular polymers synthesized by tropical intertidal biofilm bacteria. J Appl Microbiol. 102 (1), 254-264 (2007).
  8. Xu, R., Ma, S., Wang, Y., Liu, L., Li, P. Screening identification and statistic optimization of a novel exopolysaccharide producing Lactobacillus paracasei HCT. Afr. J. Microbiol. Res. 4 (9), 783-795 (2010).
  9. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28 (3), 350-356 (1956).
  10. Masuko, T., et al. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).
  11. Geater, C. W., Fehr, W. R., Wilson, L. A., Robyt, J. F. A more rapid method of total sugar analysis for soybean seed. Crop Sci. 41 (1), 250-252 (2001).
  12. Sutherland, I. W. Ch 16, Microbial Exopolysaccharides. Polysaccharides Structural Diversity and Functional Versatility. Dumitriu, S. , Marcel Dekker. 431-457 (2005).
  13. Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances?. Microbial extracellular polymeric substances: characterization, structure and function. Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. , Springer. 258 (1999).
  14. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Fast carbohydrate analysis via liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection in 96-well format. J. Chromatogr. A. 1350, 44-50 (2014).

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स्वचालित मॉड्यूलर उच्च Throughput Exopolysaccharide स्क्रीनिंग मंच बेहद संवेदनशील कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट विश्लेषण के साथ युग्मित
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