Automatiseret Modular High Throughput exopolysaccharid Screening Platform Sammen med Highly Sensitive Kulhydrat Fingerprint Analysis

Abstract

Mange mikroorganismer er i stand til at producere og udskille exopolysaccharider (EPS), som har stor betydning i medicinske områder, fødevarer applikationer eller i udskiftning af petro-baserede kemikalier. Vi beskriver en analytisk platform, der skal automatiseres på en flydende håndteringssystem, der tillader hurtig og pålidelig analyse af typen og mængden af ​​EPS produceret af mikroorganismer. Det gør det muligt for brugeren at identificere hidtil ukendte naturlige mikrobielle exopolysaccharid- producenter og analysere kulhydrat fingeraftryk af de tilsvarende polymerer indenfor en dag i high-throughput (HT). Ved hjælp af denne platform, kan stamme samlinger samt biblioteker af stamme-varianter, der kan opnås i tekniske tiltag screenes. Platformen har en modulær konfiguration, som tillader en adskillelse af protokollen i to hovedkategorier. Første er der et automatiseret screeningssystem, som kombinerer forskellige polysaccharid detektion moduler: en semi-kvantitativ analyse af viscosity-dannelse via centrifugering, en analyse af polymer dannelse via alkohol nedbør og bestemmelse af det samlede kulhydratindhold via en phenol-svovlsyre-syre transformation. Her er det muligt at screene op til 384 stammer pr løb. Anden del giver en detaljeret monosaccharid analyse for alle de udvalgte EPS producenter er identificeret i den første del ved at kombinere to vigtigste moduler: analysen af ​​den fuldstændige monomersammensætning via ultra-højtryksvæskekromatografi koblet med ultraviolet og elektrosprayionisering ion trap ( UHPLC-UV-ESI-MS) og bestemmelse af pyruvat som en polymer substituent (tilstedeværelse af pyruvat ketal) via enzymatisk oxidation, der er koblet til en farvedannelse. Alle de analytiske modulerne i denne screening platform kan kombineres på forskellige måder og tilpasses individuelle behov. Derudover kan de alle håndteres manuelt eller udført med en håndteringssystem væske. Derved screeningen platform giver en enorm fleksibilitet for at identificere forskellige EPS.

Introduction

Mikrobielle exopolysaccharider (EPS) er et strukturelt meget forskelligartet gruppe af polymerer, der opfylder forskellige biologiske funktioner. De normalt er bygget af komplekse gentagelsesenheder, der udmærker sig ved forskellige typer af monomerer (sukker, sukkerderivater, sukker syrer), bindingerne mellem disse monomerer og deres substitutioner. Den strukturelle mangfoldighed af mikrobielle polysaccharider giver temmelig forskellige karakteristika til medlemmerne af dette molekyle klasse, som giver deres anvendelse i forskellige områder som mad ^1, kosmetik ^2,3, byggeri kemi ⁴ eller vandbehandling ^5. For yderligere at udvide området for anvendelsen af ​​disse bio-baserede og sådanne bæredygtige polymerer identifikation af nye naturlige mikrobielle polysaccharider samt engineering af strukturelle varianter repræsenterer lovende tilgange. Uanset hvad, er en hurtig screeningsmetode forpligtet til hurtigt at scanne et utal af mikrobielle stammer til their polysaccharid dannelse, og analysere deres produkter. Derfor har vi for nylig udviklet en 96-brønds HT-screening platform til analyse af mikrobielle polysaccharid produktion fra naturlige isolater eller manipulerede stamme-varianter, der muliggør identificering af den monomere sammensætning ^6.

Anvender dette platform for en første screeningsrunde på ~ 500 naturlige isolater tilladt os at identificere kun omkring 10 til 20% af de isolerede stammer som værende i stand til at producere EPS (data ikke vist). Det betyder, at 80-90% af de analyserede stammer ikke producerede EPS under de anvendte betingelser, og derfor en yderligere analyse af den detaljerede kulhydrat fingeraftryk ikke var nødvendigt. Da dette meget avancerede identifikation af den monomere sammensætning er en tidskrævende proces, især til dataanalyse, til en hurtig pre-screeningsmetode identificere de stammer, positive i EPS produktion, ville øge effektiviteten. Endvidere reagenser,hjælpematerialer og måling tid på UHPLC-UV-ESI-MS ville blive reduceret. Derudover forskellige analytiske moduler, mens det på den ene side gør fremgangsmåden yderst pålidelige, er på den anden side komplicere manuel håndtering af mere end to plader med 96 brønde i parallel, og som sådan begrænse det fulde potentiale af fremgangsmåden. Af disse årsager besluttede vi at udvikle en automatiseret screening platform. Derfor vi kombineret den modulære format af den eksisterende kulhydrat fingeraftryk teknik med en fuldt automatiseret hurtig påvisningsfremgangsmåde af det totale sukkerindhold, baseret på absorbansmålinger.

Phenol-svovlsyre-syre metode repræsenterer stadig den foretrukne metode til hurtig bestemmelse af det totale indhold af bakterielle og plante polysaccharider ^7,8 kulhydrat. Denne metode blev først beskrevet af Dubois et al. ⁹ og tilpasset til forskellige anvendelser og prøvestørrelser, selv for små i 96-brønds plader ^10,11. PHEnol-svovlsyre-syre metode måler det samlede kulhydratindhold med en værdi, summating alle monomere, oligomere og polymere carbonhydrater af prøverne.

Idet disse aspekter i betragtning, at valget af et egnet dyrkningsmedium er vigtigt at anvende denne metode. Komplekse medier indeholdende oligomere eller polymere kulhydrat forbindelser som gærekstrakt kan føre til en ændret polymer og derfor bør strengt undgås. Endvidere er store mængder af sukkerarter anvendes som C-kilde til dyrkning af stammerne. Høje niveauer af resterende kulhydrater fra dyrkning proces kan negativt interferere med målingen af ​​EPS indhold.

Derfor er brugen af ​​definerede og rene sukkerarter tilrådes. I vore eksperimenter anvendte vi glucose til dyrkning af cellerne. Den resterende glucose efter dyrkning blev reduceret via en gel-filtrering og bestemmes via en glucose-assay. Endelig glucose ækvivalents af polysacchariderne blev beregnet ved at subtrahere det resterende glucose efter gelfiltrering fra det samlede kulhydratindhold, der var blevet påvist med phenol-svovlsyre-syre metode. Gel-filtrering og glucose-assay i kombination med phenol-svovlsyre-syre metode sikrer pålidelige resultater og er i stand til at blive vores første, fuldstændig automatiseret detektionssystem.

To nye analytiske moduler indgik i den automatiserede screening platform for at øge mængden af ​​information fra EPS-detektionssystem: udfældningen og observation af en stigning i viskositet.

Mange forskellige EPS - fx succinoglycan, xanthan og colon syre ¹² - rapporteres at være modificeret med en ikke-kulhydrat pyruvat ketal på sukker positioner C4 og C6. Disse pyruvatforbindelser ketaler (ligesom succinyl halvestere og uronsyrer) bidrager til polyanioniske natur og derfor til det fysiske properties af polymeren ved at interagere via divalente kation broer ^13. For at identificere disse særlige polymerer bestemmelse af pyruvat blev etableret som en anden ekstra analytisk modul. Dette øger de oplysninger om polysaccharid substituenter og deres potentielle makroskopiske egenskaber.

Kombinere alle moduler muliggør identifikation af forskellige EPS samt en hurtig og effektiv bestemmelse af EPS-producenter. Ved denne fremgangsmåde screening platform kan opdeles i to store dele (figur 1). Inden for den automatiserede screening (del I) arbejdsgangen sker fuldautomatisk (tabel 1) til hurtigt forudindstille EPS-producerende stammer. Carbohydrat fingeraftryk analyse (del II) kvantitativt bestemmer monomersammensætning af EPS produceret af de forudvalgte stammer. Derved blev dataanalyse minimeret for at optimere screening af store strain samlinger. Dennegiver mulighed for at analysere 384 stammer i en enkelt automatiseret screening løbe og med to kørsler, der er mulige per dag af 768 stammer per dag. Derudover kulhydrat fingeraftryk Analysen giver en endnu mere detaljeret oversigt over alle de identificerede EPS. Dette muliggør rettet analyse og identifikation af kun lidt forskellige EPS varianter eller helt nye forhold til de allerede beskrevne kemiske strukturer af EPS.

Protocol

1. Automatiseret Screening

Bemærk: Alle trin flydende håndtering er færdig med en robot væske håndteringssystem. Sammensætningen af robotten arbejdsbordet er vist i figur 2. Alle hjælpematerialer gemmes i lageret karrusel, medmindre andet er nævnt. For alle de automatiserede screening trin a robotic manipulator (RM) bevæger hjælpematerialer, (dyb brønd plade (DWP); mikrotiterplade (MTP); polymerasekædereaktion plade (PCR-plade) og så videre) mellem karrusel positioner (CP ) og arbejdsbord positioner (WTP). Alle pipette trin udføres med en 96-kanal-pipette-arm, medmindre det er nævnt andet. Alle trin er programmeret og udføres automatisk i 96-brønds format.

1. Stamme Dyrkning (Opgave 1 i figur 1)
   Bemærk: Håndter podning af de formodede EPS producerende stammer og forsegling af dyrknings- pladerne under sterile forhold (laminar flow). den automatiseredehurtig screening kan håndtere fire plader med 96 brønde pr løb. Forskellige stammer af flere slægter blev allerede testet ^seks.
   1. Manuelt pode præ-kultur (1 ml EPS-medier i en DWP) med en 96-polet replikator fra en 96-brønds glycerol stock plade. Dæk pladen med en åndbar forseglingsfilm at undgå fordampning og tillade beluftning. Inkuber ved 30 ° C i 48 timer ved 1.000 rpm på en MTP-rysteapparat.
   2. Pode main-kultur (990 pi EPS-medier i en DWP) ved at overføre 10 pi præ-kultur under anvendelse af en 50 pi 12-kanals multi-pipette og inkuberes under de samme betingelser som forkultur. Tag et notat af alle de stammer, som ikke vokser.
2. Forberedelse af Robot Arbejdsbord og opbevaring Carousel
   1. Give alle forbrugsstoffer, der er anført i materialer og udstyr til den korrekte position i opbevaring karrusellen. Tilføj 990 pi dobbelt destilleret vand (DDH ₂ O) i hver brønd af DWP for de 1: 100 fortyndinger til the glucose-assay (karrusel position 4-1 til 4-4).
   2. Arranger en 250 ml beholder indeholdende 150 ml Hedeselskabet ₂ O på arbejdsbord position (WTP) 11.
   3. Deponere en 250 ml beholder indeholdende 50 ml glucose-assayreagens-mix (4 ml 500 mM kaliumphosphat (pH 5,7), 1,5 ml 50 mM 2,2-azinobis- (3ethylbenzthiazoline) -6-sulfonsyre, 2 ml 100 U glucoseoxidase, 10 pi 1000 U peberrodsperoxidase og 42.49 ml Hedeselskabet ₂ O) på position WTP 1-2.
   4. Placer to tomme dummy F-bund MTP'er ved position WTP 3-1 og 3-2.
   5. Fjern åndbar forsegling film, tildele de vigtigste-kulturer i karrusel positioner (CP) 1-1 til 1-4, og start den automatiske robot program.
3. Ligevægt af gelfiltrering Plader
   Bemærk: De gelfiltrering plader, der anvendes under denne screening kan genbruges. Til dette vaskes og centrifugeres tre gange hver med 150 pi Hedeselskabet ₂ O ved 2000 xg i 2 min ved 20 ° C. Bagefter opbevares ved 4° C med 75 pi 20% ethanol og tildækkes med en silicium cap mat.
   1. Flyt 250 ml truget (CP 5-7) med 5 mM ammoniumacetatpuffer (pH 5,6) til WTP 3-3.
   2. Overfør gelfiltrering plader (CP 1-6, 1-7, 2-6 og 2-7) fra karrusellen til WTPs 4-1 til 4-4.
   3. Aspirer 150 pi ammoniumacetatpuffer anvendelse af 200 pi tips og dispensere ind i midten af ​​alle gel-filtrerings- plader til ækvilibrering.
   4. Overfør gelfiltrering plader i centrifugen (2.000 xg i 2 min ved 20 ° C).
   5. Overfør pladerne tilbage til arbejdsbordet, gentag trin 1.3.3, 1.3.4 og 1.3.3. Gentag ikke centrifugeringen skridt for at undgå dehydrering af gel-filtrering plader. den ækvilibrerede gelfiltrering plader opbevares tilbage i karrusellen.
4. Celle Fjernelse via centrifugering (Opgave 1 i figur 1)
   Bemærk: For at sikre en lav baggrund i screeningen tilgang, analysere cellefritEPS indeholdende supernatanter kun og fjerne celler via centrifugering efter dyrkning.
   1. Overfør main-kultur DWP fra karrusellen (1-1 til 1-4) i centrifugen (4.300 xg i 30 minutter ved 20 ° C).
   2. Forbered arbejdsbordet via RM at behandle hovedkulturen.
      Bemærk: For trin 1.4.2 til 1.4.3.5 systemet altid håndterer to plader parallelt og derefter gentager alle trin med de næste to plader.
      1. For nedbør før filtrering flytte MTP fra CP 6-1 og 6-2 til WTP 4-1 og 5-1. Flyt pH-indikatoren MTP'er fra CP 7-1 og 7-2 til WTP 4-2 og 5-2.
      2. Overfør filtrering plade sammen med solfangeren pladen fra CP 2-1 og 2-2 til WTP 4-3 og 5-3. Flyt den vigtigste-kultur DWP 1-1 og 1-2 fra centrifugen til WTP 4-4 og 5-4.
      3. Forbered analytiske moduler.
         Bemærk: Tag 200 ul tips fra spidsen opbevaring (position 2-1 til 2-4). For at reducere forbrugsstoffer, bruge det samme tip-sæt til trin 1.4.3.1.
         1. Overfør 180 ul af main-kultursupernatant til filtreringspladen. Aspirer 150 pi fra main-kultursupernatanten og dispensere 50 pi ind i MTP for nedbør inden filtrering og 100 pi til pH-indikator plade.
            Bemærk: pH-bestemmelse er ikke afgørende; Men efter tilsætning 12,5 ml methyl røde indikator (50 mg i 50 ml ethanol) i hver brønd med en multi-trins pipette indikerer det høje syre-producerende stammer. Denne information kan være nyttig for at undgå væksthæmning (ved lav pH) for yderligere dyrkninger, fx til en anden screening med højere buffer koncentration. Endvidere kan lave pH også inducere EPS produktion for at beskytte cellen mod det sure miljø.
         2. Gentag trin 1.4.3.1 for den anden hoved-kultur plade. Brug en ny spids-sæt.
         3. Flyt filtrering plader til centrifugen og fjerne alle andre plader fra arbejdsbordet tilbage til deres udgangspositioner i carousel.
         4. Gentag trin 1.4.2.1 til 1.4.3.3 for tredje og fjerde hoved-kultur plade.
         5. Notér disse fermenteringsvæsker, der viser nedsat sedimentation efter centrifugering af de vigtigste dyrkningsplader, når de overføres tilbage til karrusellen (viskositet kontrol).
5. 96-brønd Filtration for Complete Cell Fjernelse (Task 2 i figur 1)
   Bemærk: For at sikre celle fjernelse fra tyktflydende gæringsvæske en filtrering skridt er inkluderet i screeningen.
   1. Centrifuger filtreringsplader ved 3.000 xg i 10 minutter ved 20 ° C og bringe dem tilbage til deres karrusel udgangsposition.
   2. Forbered gelfiltreringen plader.
      1. Flyt ækvilibrerede gelfiltrering plader fra karrusellen til centrifugen og centrifugering ved 1.000 xg i 2 min ved 20 ° C.
      2. Overfør gelfiltrering plader fra centrifugen til WTP 4-1 til 44.
      3. Flyt friske gel-filtration opkøber plader fra CP (3-1 til 3-4) til WTP (5-1 til 5-4).
      4. Overfør ækvilibrerede gel-filtrering plader (WTP 4-1 til 4-4) friske opsamlingsplader (5-1 til 5-4).
      5. Ryd op arbejdsbordet undtagen positionerne 5-1 og 5-2 og flytte position 5-1 til position 4-1.
   3. Forbered arbejdsbord via RM at behandle filtraterne.
      Bemærk: For trin 1.5.3 til 1.6.3.5 systemet håndterer to plader i parallelle og gentager alle trin med de næste to plader.
      1. Flyt 50 pi tips fra karrusellen (4-6 og 4-7) til WTP 3-3 og 3-4.
      2. Overfør filtreringsplader fra CP 3-1 til 3-2 på arbejdsbordet (4-4 og 5-4).
      3. Flyt DWP (1: 100 fortynding) til påvisning af glukose forbrug fra CP 4-1 og 4-2 til WTP 4-2 og 5-1.
      4. Flyt MTP for anden nedbør efter filtrering fra CP 8-1 og 8-2 til WTP 4-3 og 5-3.
      5. Løft filtreringsplader fra kollektorpladens (WTP 4-4 og 5-4) og flytte dem til WTP 3-1 og 3-2.
   4. Forbered de analytiske moduler efter filtrering. For at reducere forbrugsstoffer, bruge det samme tip-sæt til trin 1.5.4.1 og 1.5.4.3.
      1. Tag 50 pi tips og afpipetteres en 10 pi alikvot af filtratet til DWP (1: 100 fortynding) til glucose-assay (glukose forbrug).
      2. Pipetter 35 pi filtrat til centrum af den ækvilibrerede gelfiltrering plade og 50 pi til MTP, der bruges til udfældning.
      3. Gentag trin 1.5.4.1 til 1.5.4.2 for anden filtrering plade.
      4. Flyt gel-filtrering plader til centrifugen og flytte alle andre plader fra arbejdsbordet tilbage til hjemmet positioner i karrusellen.
      5. Gentag trin 1.5.3.1 til 1.5.4.4 for tredje og fjerde filtrering plade.
      6. Efter opbevaring af alle plader igen i karrusellen noterer højviskose supernatanter, som angivet ved residualer i filterpladen (høj viscosity kontrol efter filtrering trin). En mangel på filtrat kan føre til falske negative resultater i de følgende analytiske moduler.
6. Fjernelse af glucosen via 96-brønds Gel-filtrering (Opgave 3 i figur 1)
   1. Centrifuger gelfiltrering plader ved 1000 xg i 2 min ved 20 ° C.
   2. Forbered arbejdsbord via robot manipulator at behandle gel-filtrater.
      1. Giv 50 pi tips fra karrusellen (5-3 og 5-4) til WTP 3-3 og 3-4.
      2. Til bestemmelse af den resterende glucose efter gel-filtrering flytte to MTP'er fra CP 9-1 og 9-2 til WTP 4-1 og 5-1.
      3. For phenol-svovlsyre-syre metode flytte to MTP'er fra CP 8-5 og 8-6 til WTP 4-2 og 5-2.
      4. Overfør to gelfiltrering plader fra centrifugen til WTP (4-3 og 5-3).
      5. Løft gel-filtrering plader fra indsamleren plade (4-3 og 5-3) og flytte dem til WTP 3-1 og 3-2.
   3. Forbered arbejdsbord via robot manipulator at behandle gel-filtrater.
      Bemærk: For at reducere forbrugsstoffer, bruge den samme tip-sæt for trin 1.6.3.1 og 1.6.3.2.
      1. For at detektere den resterende glucose efter gel-filtrering (1:10 fortynding) tager 50 pi tips og overføre 25 pi Hedeselskabet ₂ O (WTP 1-1) til en frisk MTP. Aspirer 20 pi Hedeselskabet ₂ O (WTP 1-1), 5 pi luft og 5 pi gel-filtrat og dispensere ind i den samme plade.
      2. For phenol-svovlsyre-syre-metoden pipette 20 pi gel-filtratet til MTP.
      3. Gentag trin 1.6.3.1 og 1.6.3.2 for den anden gel-filtrat plade.
      4. Overfør alle plader fra arbejdsbordet tilbage til hjemmet positioner i deres karrusel.
      5. Gentag trin 1.6.2.1 til 1.6.3.4 for tredje og fjerde gel-filtrering plade.
7. Glucose-analysemoduler
   1. Forbered arbejdsbord via robot manipulator at udføre glukose-assige.
      1. Flyt DWP (1: 100 fortynding) fra CP 4-1 og 4-4 ​​til WTP 5-1 og 5-4.
      2. Flyt alle MTP'er fra CP 9-5 og 9-8 til WTP 4-1 og 4-4.
      3. Tag 200 pi tips og bland fortyndingen ved sugning og afgivelse ti gange volumenet af 180 pi. Så afpipetteres en 50 pi portion til MTP.
      4. Gentag trin 1.7.1.2 og 1.7.1.3 for alle fire DWPs (1: 100 fortynding).
      5. Fjern alle DWPs (5-1 til 5-4) fra arbejdsbordet.
   2. Forbered arbejdsbordet for at starte glucose-assayet.
      1. Til bestemmelse af den resterende glucose efter gelfiltrering overføre alle MTP'er fra CP (9-1 til 9-4) til WTP (5-1 til 5-4).
      2. Flyt glucose-assay kalibrering plade - indeholdende tre gange 50 pi af følgende glucosekoncentrationer (90, 45, 18, 9, 4,5, 1,8, 0,9, 0,45 og 0 mg / l) - fra CP 9-9 til WTP 3- 3.
      3. Tag 200 ul tips og aspirat 50 pi af glukose-assayreagens-mix fra WTP 1-2, for at starte den første assay. Flytte MTP'erne i inkubatoren (30 ° C ved 150 rpm i 30 min).
      4. Indstil tidsplan for at starte programmet med 5 min forsinkelse mellem pladerne.
      5. Efter 30 minutters inkubation flytte pladerne fra inkubatoren til MTP-reader og optage absorbans ved 418 og 480 nm.
      6. Efter målingen flytte pladerne til deres udgangsposition i karrusellen.
8. Fremstilling af Precipitation
   Bemærk: For at vurdere EPS produktion udføre en udfældning af supernatanten med 2-propanol før og efter den første filtreringstrin. Endvidere vurdering af adsorptionen af ​​polymer på filtermembranen ved observation af fibre og flager i den første, men ikke i den anden udfældning.
   Forsigtig: Håndtag 2-propanol som en brændbar væske strengt under en emhætte.
   1. Fjern alle nedbør plader (CP 6-1 til 6-4 og 8-1 til 8-4) fra karrusellen. og tilføjemanuelt 150 pi 2-propanol til hver brønd med en 12,5 ml flertrins pipette.
   2. Dække alle MTP'er med en silikone hætte mat og omrystes ved stuetemperatur (RT) (10 min ved 900 rpm). Visuelt observere fiber eller flake formationer efter omrystning, der indikerer EPS produktion.
9. Phenol-svovlsyre-syre Metode
   Forsigtig: Håndter koncentreret svovlsyre-syre og phenol under en emhætte. Phenol er et ætsende og mutagent middel.
   1. For phenol-svovlsyre-syre-metode, fjerne pladerne (CP 8-5 til 8-8) fra karrusellen og placere dem i den flydende håndteringssystem (Position 4 til 8). Indbefatter kalibrering plade med 20 pi forskellige glucosekoncentrationer (10; 5; 2,5; 1; 0,5; 0,25; 0,1; 0,05; 0 g / l) i tre eksemplarer.
   2. Anbring en affaldsbeholder i stilling 1, en ​​200 pi tip boks i position 2 og en 250 ml trug med 110 ml phenol-svovlsyre-syre (frisk fremstillet på is with18.3 ml phenol 5% (vægt / volumen) i Hedeselskabet ₂ O og 91,7 ml koncentreret. sulfuric syre) i position 3.
   3. Benyt en 8-kanals pipette med 300 pi tips og overføre 180 pi phenol-svovlsyre-syre til hver række af alle pladerne.
   4. Dække alle MTP'er med låg, blandes de ved rystning (5 min ved 900 rpm, RT) og inkuber dem i 35 min ved 80 ° C i en ovn i farvereaktion. Efter afkøling under en emhætte, måle ekstinktion ved 480 nm.
10. Valg af EPS Positiv Ovenstående væsker (Opgave 4 i figur 1)
    1. Til vurdering af EPS produktion, skal du vælge disse stammer fra den automatiserede screening, der opfylder mindst to af de tre kriterier som positive (viskositet kontrol 2.6.1 og 2.6.2, afsløring af polymer 2.6.3, glucose tilsvarende 2.6.5). Overfør de resterende filtrater fra de positive hits i et nyt MTP til yderligere behandling.
       Bemærk: Når pladerne er dækket med en aluminium forseglingsfilm de kan opbevares ved -20 ° C i mindst en uge. Inden for denne gang Determinaordning for kulhydrat fingeraftryk skal udføres.

2. Kulhydrat Fingeraftryk

Bemærk: Alle trin for kulhydrat fingeraftryk manuelt udført.

1. Gel-filtrering af de positive Supernatanter (Opgave 5 i figur 1)
   Bemærk: Gel-filtrering er nødvendig, da der ikke er nogen filtrat venstre fra den automatiserede screening. Gel-filtrering med et volumen på mere end 35 pi resulterer i nedsat rensning effektivitet.
   1. Forbered ligevægt af gelfiltrering plader ved dispensering 150 pi ammoniumacetatpuffer i alle hullerne via en 12,5 ml flertrins pipette.
   2. Overfør gelfiltrering plade i centrifugen (2.000 xg i 2 min ved 20 ° C).
   3. Gentag trin 2.1.1, 2.1.2 og igen 2.1.1. Centrifugeres gelfiltrering plade ved 1.000 xg i 2 min ved 20 ° C før yderligere anvendelse.
   4. Pipette 35 pi af filtratet tilmidten af ​​gelfiltrering plade med en 12-kanal 50 pi pipette.
   5. Centrifugeres gelfiltrering plade ved 1.000 xg i 2 min ved 20 ° C og derefter løfte den op fra kollektorpladen.
   6. Forbered glukose-analysen før hydrolyse: Udfør en 1:10 fortynding ved at tilføje 45 pi Hedeselskabet ₂ O og 5 pi gel-filtratet med en 12-kanals 50 pi pipette og dække MTP'er med en silikone hætte mat.
      Bemærk: Til korrekt bestemmelse af glukose værdi af polymeren, måle glukose indhold, før hydrolyse og trække det fra glucoseindholdet kvantificeret efter hydrolyse trin.
   7. Forbered pyruvat-analysen før hydrolyse: Udfør en 1:20 fortynding med en 12-kanal 200 pi pipette for at tilføje 95 ul Hedeselskabet ₂ O, transfer 5 pi gel-filtratet til hver brønd og forsegle MTP med en silicium cap mat .
2. 96-brønd Micro Hydrolyse (Opgave 6 i figur 1)
   Bemærk: Varm opinkubationen ovn (herunder et sandbad) til 121 ° C i mindst 1,5 time før brug. En særlig spændeanordning blev udviklet for at undgå fordampning under den lille skaleret hydrolysetrin.
   1. Tag en ny PCR-plade og overføre 20 pi gel-filtratet med en 12-kanal 50 pi pipette.
      Forsigtig: Trifluoreddikesyre er en ætsende syre og toksisk. Ammonium løsning er ætsende. Håndtag både kemikalier kun under en emhætte.
   2. Tilsæt 20 pi 4 M trifluoreddikesyre med en 1,25 ml flertrins pipette til hver brønd. Så dækker PCR-plade med en termoplastisk elastomer (TPE) cap måtten og placere PCR-plade i den særlige klemindretning.
   3. Bland opløsningerne via inverterende klemindretningen ti gange. Sæt PCR-plade i en centrifuge og centrifugering ved 2.000 xg i 2 minutter for at samle al væsken i bunden. Sætte PCR-pladen tilbage til klemindretningen og fastgør enheden med skruer.
   4. Placersikret klemindretning i forvarmet sandbad og inkuberes i 90 minutter ved 121 ° C.
   5. Fjern spændeindretningen fra sandet bad og lad den køle ned til stuetemperatur.
   6. Fjern skruerne og spin igen i en centrifuge ved 2.000 xg i 2 min for at indsamle alle kondensatet i bunden af ​​brøndene og for at forhindre krydskontaminering under fjernelse af hætten måtten.
   7. Tilføj 3,2% ammoniakopløsning for at indstille pH til ca. 8 med en 12-kanal 200 pi pipette. Dæk PCR-plade med en TPE kasket mat og ryst den manuelt ved hjælp af fastspænding enhed.
   8. Efter neutralisering centrifugeres PCR-pladen ved 2000 xg i 2 min.
3. High-throughput-1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon (HT-PMP) -derivatization af kulhydrater (opgave 7 i figur 1)
   1. Transfer 25 pi den neutraliserede hydrolysat i en frisk PCR-plade ved anvendelse af en 12-kanals 50 pi pipette.
      Bemærk: Efter at have taget den udtagne kontrollere neutralization af den resterende væske i hydrolysen plade via tilsætning 12.5 pi phenolrødt-indikator (0,05 g phenolrødt i 5 ml 20% ethanol) med en 1,25 ml flertrins pipette. Alle brønde, der ikke bliver til lyserød farve (pH 8) er ikke korrekt derivatiseret.
   2. Tilføj 75 pi derivatiseringsreagens-mix (125 mg PMP, 7 ml methanol, 3,06 ml Hedeselskabet ₂ O og 438 pi 3,2% ammonium-opløsning) og tildækkes pladen med en TPE cap mat.
   3. Efter omrystning PCR-plade i spændeindretningen centrifuge pladen ved 2000 xg i 2 min for at akkumulere al væsken i bunden.
   4. Til derivatisering sted PCR-plade i en PCR-cyklusapparat ved 70 ° C i 100 minutter efterfulgt af afkøling til 20 ° C.
   5. Overfør en 20 pi alikvot til en ny MTP med en 12-kanal 50 pi pipette. Brug derefter en 12-kanal 200 pi pipette og tilsæt 130 pi 19,23 mM eddikesyre (0,962 ml 1 M eddikesyre + 49.038 ml Hedeselskabet ₂ O) til hver linje. Bland direkte via aspirating og dispensering (minimum seks gange) og overføre al væsken til et 0,2 um filter plade med en MTP kollektorpladen.
   6. Centrifugeres pladen (1000 xg i 5 min), fjern filteret plade, forsegle MTP med en silikone hætte mat og placer MTP i UHPLC-UV-ESI-MS til bestemmelse af kulhydrat fingeraftryk ^14.
4. Fremstilling af Glucose-assayet
   1. Udfør en 1:10 fortynding via tilføje 45 pi Hedeselskabet ₂ O og 5 pi neutraliseret hydrolysat ved hjælp af en 12-kanals 50 pi pipette og dække MTP'er med en silikone hætte mat. Tilføj tre gange 50 pi forskellige glucose standarder (500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2,5 og 0 uM) til et nyt MTP anvendt til kalibrering.
   2. Der tilsættes 50 pi glucose-assayreagens-mix (opskrift step1.2.3) med en 12-kanal 50 pi pipette. Derefter dække pladerne med et silicium cap mat og inkuberes ved 30 ° C og 400 rpm i 30 min i en MTP-inkubator.
5. Fremstilling af pyruvat-assay
   1. Udfør fortyndet 1:20 under anvendelse af en 12-kanals 200 pi pipette. Tilføj 95 pi Hedeselskabet ₂ O og overføre 5 ul neutraliseret hydrolysat til hver brønd. Dæk MTP med en silicium cap mat.
   2. Tilsæt 100 pi pyruvat-assayreagens-mix (3 ml 1 mM N - (carboxymethylamino-carbonyl) -4.4'-bis (dimethylamino) -diphenylamine natriumsalt (DA-64), 300 pi 10 mM thiaminpyrophosphat, 60 pi 100 mM magnesiumchlorid-hexahydrat, 2,4 ml 500 mM kaliumphosphat puffer (pH 5,7), 30 pi 100 E pyruvatoxidase, 12 pi 1.000 U peberrodsperoxidase og 24,19 ml Hedeselskabet ₂ O) ved anvendelse af en 12-kanals 200 pi pipette.
   3. Dæk pladerne med et silikone hætte mat ennd inkuberes ved 37 ° C og 150 rpm i 30 min. Umiddelbart efter inkubation foranstaltning absorbans i en MTP-læser ved 727 og 540 nm.
6. Evaluering af alle resultater af Automatiseret screening og Kulhydrat Fingeraftryk.
   1. Vær opmærksom på de prøver, der viser nedsat sedimentation efter de vigtigste dyrkningsplader er blevet centrifugeret, og lagret tilbage til karrusellen (viskositet kontrol trin 1.4.1). Prøver, som ikke viser pellet dannelse er positive (kriterium 1 til automatiseret screening).
   2. Vær opmærksom på højviskose supernatanter, som er angivet med residualer i filterpladen efter filtrering trin (høj viskositet kontrol trin 1.5.4.6). En mangel på filtratet kan føre til et falsk negativt resultat i de følgende analytiske moduler. Prøver, der opretholder kultursupernatanterne i filteret-brønde er positive (også kriterium 1 til automatiseret screening).
   3. observere visuelt dannelse fiber eller flage efter inkubation. Tag noter som thsige indikerer polysaccharider. Bedøm ingen udfældning med (-); lav udfældning af fibre eller flager med (+) og høj nedbør med (++). Endvidere detektere adsorption af polymeren på filtermembranen via observation af fibre og flager i den første, men ikke i den anden udfældning (kriterium 2 til automatiseret screening).
   4. Udfør en lineær kalibrering til beregning af glucosekoncentrationen.
      
      Klik her for at se en større version af denne ligning.
   5. Udfør den lineære kalibrering (absorption overkoncentration) mellem 5 og 0,1 g / l glucose. Beregning af glucose ækvivalent af de hydrolyserede polymerer og evaluere ved følgende parametre: glucose ækvivalent:> 700 mg / L = positiv; 300-700 mg / L = formodede positive; <300 mg / L = negativ med hensyn til EPS-formation (kriterium 3 for automatiseret screening).
      
      Klik her for at se en større version af denne ligning.
   6. Kvantificere alle kulhydrater bestemt med HT-PMP-metoden. Opsummere alle mængder og vurdere som følger:> 300 mg / l (positiv); 150-300 mg / l (formodet positiv) og <150 mg / l (negativ).
   7. Til beregning af pyruvat-koncentration udføre en lineær kalibrering (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5 og 0 uM). For at udelukke den resterende pyruvat i supernatanten, korrigere pyruvat indhold efter hydrolyse via indholdet pyruvat før hydrolyse.
      
      Klik her for at se en større version af denne equation.

Representative Results

Valideringen af phenol-svovlsyre-syre metode viste gode resultater med en koefficient på beslutsomhed (r²) af 0,9998 (Tabel 2). For 5 g / l koncentration variationskoefficienten (CV) og nøjagtigheden viste en god præstation med 1,8% og 2,2% fejl, men lavere ydelse for 0,25 g / l standard med 5,3% (CV) og 6,1% fejl ( Partiskhed).

Koefficienterne for bestemmelse af både pyruvat-assay kalibreringskurver (med og uden matrix) var> 0,9999 i et kalibreringsområde på 150 uM (tabel 3). De variationskoefficienter (CV) for den højeste og laveste kalibreringsniveau var <4,6% og nøjagtigheden viste en meget god præstation over hele kalibrering sortiment med mindre end 3,9% fejl. Således matricen fra hydrolysetrinnet viste ingen indflydelse på den enzymatiske assay som derfor kan til measure pyruvat før og efter hydrolyse.

Tabel 4 viser de detaljerede resultater af tre eksemplariske nye stammer som med succes identificeret med screeningen platform. Den venstre del af tabellen viser resultaterne af de automatiserede screening modulerne vedrørende viskositet dannelse, polymer produktion og glukose tilsvarende fra den totale hydrolyse, der blev brugt som evaluering parametre for detaljeret kulhydrat fingeraftryk analyse. Carbohydrat fingeraftryk baseret på kalibrerede sukker samt ukendte sukre, dimerer og substituenter er angivet i den højre del af tabellen. Ved brug af denne information den monomere sammensætning kan beregnes og sammenlignes med allerede kendte polymerstrukturer. Endvidere kan der udføres en målrettet screening for interessante monomere sammensætninger og sjældne kulhydrater.

Den høje ydeevne af mikroskala hydrolyse og HT-PMP-derivatisering blev påvist i vores tidligere arbejde ^14. Endvidere har valideringen af gelen-filtrering og kulhydrat fingeraftryk af forskellige slægter blevet beskrevet i en anden publikation ^6. Alt i alt kan screeningen platform med den modulære opbygning let modificeres og tilpasses til individuelle behov hos brugeren. Den automatiserede screening af platformen muliggør en otte gange højere gennemløb og giver pålidelige resultater. Hidtil ukendte analytiske moduler som pyruvat-assayet kan integreres og i kombination med kulhydrat fingerprintsanalyse de giver meget detaljeret information om identificerede EPS. Derved screening platform er afgørende, når du søger efter både let modificerede og helt nye EPS varianter.

Figur 1: Samlet ordning af den modulære hIGH-throughput exopolysaccharid screening platform. Den automatiserede screening omfatter de første tre opgaver. Efter bakterier dyrkes i plader med 96 brønde, cellerne fjernes ved centrifugering (opgave 1) og en 96-brønd filtrering (opgave 2). Derefter bliver de resterende monomere sukkere fra vækstmedierne fjernet via en 96-brønds gelfiltrering (opgave 3). EPS indeholder prøver evalueres i opgave 4. kulhydrat fingeraftryk af screeningen platform indeholder de sidste tre opgaver. Det resterende filtrat af de positive hits fra opgave 2 giver grundlag for gel-filtratet i opgave 5. Efter hydrolysering i opgave 6 carbohydratet fingeraftryk kan analyseres via HT-PMP-metoden (high-throughput 1-phenyl-3-methyl -5-pyrazolon, opgave 7). Alle opgaver bliver fulgt af forskellige analytiske moduler og / eller en viskositet kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Robot arbejdsbord setup for screening platform Layouts af både flydende håndtering robot arbejdsborde vises:. (A) robot flydende håndteringssystem og håndtering station (B) væske. (A) Opsætningen består af en mikroplade luftfartsselskab med to positioner (positioner 1-1 til 1-2), en bærer for engangs tips med fire positioner (positioner 2-1 til 2-4) og tre mikroplade luftfartsselskaber med fire positioner hver (positionerne 3-1 til 3-4, 4-1 til 4-4 og 5-1 til 5-4). Derudover er der et opbevaringsrum karrusel med fem hotel bærere (1 til 5) hver for syv dybe brønde (DWP) og fire hotel bærere (6-9) hver for 21 mikro-titer-pladerne. Hardwaren installeret på væskehåndtering robot er en 96-kanal-pipette-arm til brug med engangsspidser og en robot manipulator (RM), som bevæger plader / udstyr between arbejdsbordet, oplagring karrusellen, MTP-læser, centrifugen og ryste-inkubator. (B) Den væskehåndtering station er udstyret med en væskehåndtering arm og en 8-kanals 300 pi pipette, en affaldsbeholder i stilling 1, et tip adapter med 300 pi tips (position 2), en højde adapter 30 med en 250 ml trug (position 3) og fem højde adapter 60 for MTP'er (position 4 til 8). Nummereringen af ​​positionerne omtales i hele denne protokol. Alternative arbejdsborde kan også bruges, hvis der er tilsvarende opsætninger tilgængelige. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Pyruvat indhold af 16 kommercielt tilgængelige polymerer bestemt via pyruvat-assay. Efter 1 g / L polymeropløsnings blev hydrolyseret og neutraliseret, blev pyruvat-analysen udføres fra en 1:10 fortynding (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Diagram af den modulære high-throughput screening platform. Den automatiserede screeningssystem, som kombinerer forskellige polysaccharid detection moduler: analyse af viskositet dannelse, polymer produktion og bestemmelse af det samlede kulhydratindhold. Anden del giver en detaljeret monosaccharid analyse for alle de valgte EPS producenter er identificeret i den første del. Alle data fra den automatiske screening og data fra kulhydrat fingeraftryk via UHPLC-ESI-MS samles i en database og muliggøre enkel identifikation af strukturelt beslægtede varianter af ALREady kendte EPS eller nye EPS og derfor en målrettet screening. Klik her for at se en større version af dette tal.

Vigtigste trin / Analytisk modul	Workflow	Observation / Beskrivelse
Dyrkning af stammerne	1 ml EPS-medium A Forkultur 48 timer, 30 ° C, 1.000 rpm a Main-kultur 48 timer, 30 ° C, 1000 rpm en	Produktion af EPS
Cell fjernelse / viskositet	Centrifugering: 30 minutter ved 4.300 xg	Nr pellet = forøget viskositet = positiv
Påvisning af polymer: Precipitation	50 pi supernatant + 150 pi 2-propanol B Omrystning 10 minutter ved stuetemperatur og 900 rpm B	Visuelle: Fibre og flager = positiv udfældning af polymer
Celle fjernelse / høj viskositet	180 pi supernatant af main-kultur Centrifugering: 10 minutter ved 3.000 x g 1,0 um glasfiber membran	Ingen filter passerer = høj viskositet = positiv
Påvisning af polymer: Precipitation	50 pi filtrat + 150 pi 2-propanol B Omrystning 10 minutter ved stuetemperatur og 900 rpm B	Visuelle: Fibre og flager = positiv udfældning af polymer
Glucose forbrug: Glucose-assay	Fortynding 1: 100: 10 pi filtrat + 990 pi Hedeselskabet 2 O 50 pi alikvot + 50 pi reagent-mix Inkubation 30 minutter ved 30 ° C 150 rpm Måling 418-480 nm	Resterende glukose efter dyrkning
Gelfiltrering	ækvilibrering: 3 x 150 pi NH4 -acetat buffer pH 5,6 2 x 2 min ved 2000 xg 1 x 2 min ved 1.000 xg Gelfiltrering: 35 pi filtrat, 2 min ved 1.000 xg Vask: 3 x 150 pi Hedeselskabet 2 O, 2 min ved 2000 xg 75 pi 20% ethanol til opbevaring	Polymer oprensning: Fjernelse af salte, pyruvat, glucose og andre sukkerarter monomerer fra dyrkning supernatant
Resterende glukose efter gel-filtrering Glucose-assay	Fortynding 1:10: 25 pi Hedeselskabet 2 O + 20 pi Hedeselskabet 2 O og 5 pi filtrat + 50 pi reagens-mix Måling 418-480 nm	Subtraktion af resterende glucose efter gel-filtrering fra phenol-svovlsyre-syre metode
Glucose tilsvarende: Phenol-svovlsyre-syre fremgangsmåde c	20 pi gel-filtrat + 180 pi phenol-svovlsyre-syre (30 pi 5% (w / v) phenol i Hedeselskabet 2 O + 150 pi koncentreret. H 2 SO 4 (ρ = 1,84 g / ml)) Rystning 5 minutter ved 900 rpm Inkubation 35 min ved 80 ° C Måling ved 480 nm	Glucose tilsvarende: Δ (phenol-svovlsyre-syretal - resterende glucose efter gel-filtrering) <300 mg / l negativ > 300 og <700 mg / l formodede positive > 700 mg / l positiv
en håndteres manuelt under sterile forhold (laminar flow).
b Brandfarlig væske håndteres manuelt under en emhætte.
c Phenol-svovlsyre-syre håndteres med Brand Væskehåndtering Station (LHS) under en emhætte.

Tabel 1:. Komplet workflow af den automatiserede prescreening med robot væskehåndteringssystem og væskehåndtering station Oversigt over alle parametre for de automatiserede analytiske moduler.

Linearitet			LOD	LOQ
r² en	Slope en	Offset en	mg / l	mg / l
0,9998	0,0007	-0,021	50	100
Standard		Mean b	Precision b	Nøjagtighed b
mg / l		mg / l	CV%	Bias (% fejl)
5.000		5112	1.8	2.2
250		265	5.3	6.1
et gennemsnit på otte målinger, kalibrering med seks niveauer glukose fra 0,1 til 5 g / l
b udføres med en t-test (α = 0,05; n = 8).
LOD: bestemmelsesgrænsen, LOQ: bestemmelsesgrænsen, CV: variationskoefficient.

Tabel 2:Validering af phenol-svovlsyre-syre metode udførtes med den flydende håndtering station. Lineariteten blev beregnet baseret på en seks punkts kalibrering (n = 8). Mean, præcision og nøjagtighed på to eksemplarisk udvalgte glucosekoncentrationer er givet her.

	Linearitet			LOQ
	r² en	Slope en	Offset en	uM
uden matrix	0,99999	0,0223	-0,0019	1
01:10 fortyndet matrix	0,99999	0,0221	-0,0011	1
	Standard	Mean b	Precision b	Nøjagtighed b
	uM	uM	CV%	Bias (% fejl)
uden matrix	50	49,96	3.05	-0,09
	1	1,04	2,95	3,86
01:10 fortyndet matrix	50	49.98	0,44	-0,04
	1	1.00	4,58	0,33
et gennemsnit på tre målinger, kalibrering med seks koncentrationer af pyruvat fra 1 til 50 uM.
b (n = 3)
LOQ: bestemmelsesgrænsen, CV: variationskoefficient.

Tabel 3:. Validering af pyruvat-assayet med og uden en 1:10 fortyndet neutraliseret trifluoreddikesyre-syre-matrix To seks point kalibreringer (n = 3) med og uden evaluering af matrix påvirkninger blev udført. Mean, præcision og nøjagtighed på to eksemplarisk udvalgte pyruvat koncentrationer med og uden virkningerne af en 1:10 fortynding blev beregnet.

Tabel 4:.. Resultater af tre eksemplariske stammer screenes med platformen data indsamlet fra den automatiserede screening og kulhydrat fingeraftryk venligst cslikke her for at downloade denne tabel som en Microsoft Excel-fil.

Kulhydrat	Absorption max [nm]	Absorption ved 480 nm middel ± SD		Absorbans i forhold til glucose [%]
diutangummi	470	0,342	± 0,010	187
gellangummi	472	0,334	± 0,002	183
guargummi	478	0,387	± 0,017	212
Gummi arabicum	476	0,393	± 0,034	215
hyaluronsyre	484	0,231	± 0,011	126
karayagummi	478	0,455	± 0,023	249
Konjacgummi	480	0,297	± 0,009	163
Lærk gum	480	0,337	± 0,032	185
Johannesbrødgummi	478	0,354	± 0,033	194
scleroglucan	484	0,168	± 0010	92
succinoglycan	482	0,168	± 0,005	92
taragummi	480	0,318	± 0,016	174
traganth	478	0,513	± 0,003	281
welangummi	472	0,226	± 0,016	124
xylan 472	0,567	± 0,007	311
xanthangummi	482	0,245	± 0,021	134
Glucose	484	0,191	± 0,014	100
SD: standardafvigelse

Tabel 5:. Resultater som opnået ved phenol-svovlsyre-syre fremgangsmåde til 16 kommercielt tilgængelige polymerer og glucose absorptionsmaksimum og absorption ved 480 nm af 16 kommercielt tilgængelige polymerer (1 g / l) samt glucose (1 g / l ) blev målt anvende phenol-svovlsyre-syre metode. Absorbansen i forhold til glucose af alle polymererne blev beregnet.

	Standard	Betyde	Precision en	Accuracy en
	mg / l	mg / l	CV%	Bias (% fejl)
1:10 fortynding	450	460	1.01	2.14
	45	44,7	1,41	-0,70
1: 100 fortynding	4500	5026	1.19	11.6
	450	471	1.16	4,55
b udføres med en t-test (α = 0,05; n = 8).
CV: variationskoefficient.

Tabel 6:. Validering af den automatiserede fortynding for glucose-assayet Fortyndingen for glucose-assayet efter dyrkning (1: 100) og efter gel-filtrering (1:10) blev valideret. To glucosekoncentrationer (n = 8) blev fortyndet via væskehåndteringssystem og evalueres. Mean, præcision og nøjagtighed blev beregnet.

Teoretisk glukoseværdi	Dækket med silikone hætte mat			Test af fordampning (udækket)
	betyde en	Precision en	Accuracy en	betyde en	Precision en	Nøjagtighed a </ Strong>	Fordampning
mg / l	mg / l	CV%	Bias (% fejl)	mg / l	CV%	Bias (% fejl)	%fejl
45,0	45.2	0,69	0,44	46.0	0,66	2.05	1,60
18,0	17,7	0,80	-1,68	18,0	0,72	-0,01	1,69
9,0	8,74	1.20	-2,98	8,92	0,81	-0,95	2.09
4,5	4,50	1.26	-0,04	4,58	1,57	1,76	1,80
1.8	1,85	0,74	2,90	2.01	2,82	11.6	8,48
0.9	1.03	1,43	14.1	1.16	3,52	28.3	12.4
a (n = 4)
CV: variationskoefficient.

Tabel 7:. Evaluering af fordampning virkning haller og MTP Seks forskellige glucose standarder (n = 4) blev opbevaret i karrusellen i 3,5 timer ved stuetemperatur. Effekten af ​​inddampningen blev evalueret ved hjælp udækket samt overdækket (silicium mat) standardprøver. Mean, præcision, nøjagtighed og fordampningen i% fejl blev beregnet.

Før gel-filtrering <td> 25,1

	Efter gelfiltrering		Resterende glukose efter gel-filtrering
	betyde en	SD en		betyde en	SD en
	mg / l	mg / l	mg / l	mg / l	%
1	8647	110	259	121	3.00
2	5108	56	116	37	2,27
3	2014	12	50,8	14	2,52
4	1015	12	8.1	2,47
5	510	4.9	12.8	4.3	2,51
6	223	8.6	6.6	1.5	2,94
7	122	5.6	4.3	0.9	3,48
8	75	6.0	3.1	0,3	4.18
a (n = 8)
SD: standardafvigelse

Tabel 8:. Resultater af gel-filtreringseffektivitet Otte forskellige glucose standarder blev bestemt før og efter gelfiltrering at vurdere effektiviteten af gelen-filtrering. Middelværdi, standardafvigelse og resterende glucose efter gel-filtrering i% blev beregnet.

Discussion

Polysaccharid detektion med phenol-svovlsyre-syre metode: Forskellige monosaccharider vise forskellige absorptionsmaksima og molære ekstinktionskoefficienter ved brug af denne metode ^9. Dette resulterer i forskellige absorptionsmaksima af polymerer, som indeholder flere sukker i forskellige mængder. De forskellige bølgelængder af absorptionsmaksima for 16 forskellige kommercielt tilgængelige polymerer er givet i tabel 5. Polymererne blev opløst (1 g / l) i Hedeselskabet ₂ O, omrørt (150 rpm) natten over og målt med phenol-svovlsyre-syre-metoden . Diutangummi viste den laveste absorptionsmaksima ved 470 nm og scleroglucan og hyaluronsyre det højeste ved 484 nm. Baseret på disse resultater 480 nm blev valgt til denne screening platform. Den relative absorbans af polymererne blev beregnet på basis af absorbansen opnået med 1 g / l glucose (sat til 100%). De laveste resultater blev opnået med scleroglucan og succinoglycan, begge med 92%. Dette var expected fordi scleroglucan kun indeholder glucose og succinoglycan indeholder glucose og galactose i forholdet 7: 1. Både kommercielle polymerer har forskellige tab af tørring og forskellige askeindhold, dette er grunden til den teoretiske værdi af ~ 110% ikke blev nået. Xylan viste den højeste relative absorbans med 311%. Årsagen til dette er den høje molære ekstinktionskoefficient opnået fra xylose grund af den dominerede furanoseform. På et niveau på 0,1 g / l glucose grænsen kvantificering blev nået, samt detektionsgrænsen ved en koncentration <0,05 g / l. Imidlertid detektionsgrænsen for positive stammer i screeningen er højere end 0,7 g / l, og derfor viste assayet en god præstation. For at få pålidelige resultater, blev den resterende glucose efter gelfiltrering bestemt med et glucose-assay, og denne værdi blev trukket fra den værdi fra phenol-svovlsyre-syre metode.

Automatiseret glucose-assay fortynding: Præstationenaf glucosen opgørelsen efter dyrkning (fortynding 1: 100) blev undersøgt. Til dette blev 10 pi supernatant overført til 990 pi Hedeselskabet ₂ O i en dyb brønd plade og blandes via ti gange opsugning og dispensering 180 pi af denne fortynding. Det andet kritiske trin var den korrekte pipettering af kun 5 pi aliquot for 1:10 fortynding fra glucose-assayet efter gel-filtrering. For at generere fortyndingen 25 pi Hedeselskabet ₂ O blev overført med en 50 pi-tip først blev bagefter 20 pi Hedeselskabet ₂ O og 5 pi gel-filtrat aspireret sammen. Dette sikrer en bedre fjernelse af 5 pi aliquot ud af spidsen. Begge fortyndingstrin blev verificeret med forskellige glucose standarder via en glukose-assay. Resultaterne for to eksempelvise koncentrationer er anført i tabel 6 1:. 100 fortynding til bestemmelse af glucoseindholdet efter dyrkning viste høj præcision for begge standarder med en CV & #60; 1,2%. Samtidig, nøjagtigheden for højere standard var op til 11,6 (% fejl). Men dette er ubetydelig glucosen bestemmelse kun udgør den resterende glucoseindhold efter dyrkning og derfor er ikke vigtigt for polymeren detektion. Den 1:10 fortynding for de resterende glucose efter gelfiltrering viste meget pålidelige resultater med en CV <1,4% og en nøjagtighed <2,1% fejl.

Behandling af fordampning: Screeningen kræver 3,5 timer fra det første skridt til den første glukose-assay. For at finde ud af, om denne tidsramme har en indflydelse på reducerede MTP opbevaring blev 50 pi glucose-assay kalibreringsstandarder lagret med og uden låg i 3,5 timer i robotten karrusellen. I kalibreringen interval (45 til 4,5 mg / l) koncentrationen prøve næppe steget. En stigning - forårsaget af fordampning - var under 2,1%, og kun for de to laveste koncentrationer (1,8 og 0,9 mg / l) nåede op til 12,4% (

Gelfiltrering: Høje mængder af ikke-metaboliseret glucose forstyrrer kvantitativ påvisning af glucose fra den hydrolyserede polymer. Derfor blev en gel-filtreringstrin kræves for at fjerne det resterende glucose efter dyrkning. Derudover gelfiltrering renser polymer indeholdende supernatant fra salte og monomere kulhydrat forbindelser, andre end glucose, for at minimere den analytiske baggrund i monomeren analyse. Ved gel-filtreringstrin 35 pi filtrat blev anbragt i centrum af brønden. For validering af robustheden af ​​gel-filtrering i det automatiserede system blev otte kalibreringsstandarder fra 0,045 op til 9 g / l glukose filtreres (n = 8). Glucosen af hver koncentration blev altid reduceret med mere end 95% af den oprindelige værdi (tabel 8). Herved viste gelfiltrering meget gode resultater for forskellige koncentrationer af glucose. Derudover resterende glucose efter gel-filtration blev også bestemt med en glucose-assay og trækkes fra den phenol-svovlsyre-syre vilje til at modtage den korrekte mængde glukose ækvivalent til den hydrolyserede polymer.

Pyruvat-assay: Først og fremmest blev det undersøgt, om den neutraliserede og fortyndet (1:10) TFA-matrix fra hydrolysetrinnet forstyrrer den enzymatiske reaktion. Derfor blev den komplette assay udført to gange, én gang med og én gang uden matrix og viste pålidelige resultater. Endelig blev pyruvatindhold af 16 kommercielt tilgængelige polymerer med held målt og er afbildet i figur 3. Det er almindeligt kendt, at ud af de 16 polymerer kun succinoglycan og xanthan naturligt indeholder pyruvat. Med vores pyruvat-assay begge disse polymerer blev korrekt identificeret. I scleroglucan, blev welangummi og xylan pyruvat også påvist i betydelige mængder. Samlet blev evne tilgang valideret og pyruvat-assay showed en høj ydeevne. Det viste sig at være i stand til at detektere pyruvat i forskellige polymerer efter hydrolyse.

Kulhydrat fingeraftryk: Efter at have udført alle analytiske moduler i automatiserede screening, blev potentielle EPS producenter udvalgt til kulhydrat fingeraftryk analyse. Til dette blev flere kriterier anvendt: 1) Positive observation af viskositet efter centrifugering og / eller efter filtrering. 2) Udfældning før og efter filtrering. Observerede fibre og flager blev evalueret som positive. 3) Glucose tilsvarende værdi fra phenol-svovlsyre-syre metode. Værdier> 700 mg / L blev bedømt som positive og værdier mellem 300 og 700 mg / l blev bedømt som formodede EPS producenter. Når to eller tre kriterier blev evalueret som positive, blev stammerne udvalgt til yderligere kulhydrat fingeraftryk analyse. Kriterierne kan tilpasses mod den enkelte formål med EPS screening (f.eks EPS lav viskositet). Vores tilgang til formål at finde efficient EPS-producenter. Når der søges efter stammer, der kun producerer små mængder af EPS bør reduceres evalueringen grænse af glucose tilsvarende.

Teknisk gavn og fremtidige applikationer: Et interessant træk ved denne protokol er den modulære karakter af trinene og de forskellige analytiske moduler. De kan kombineres på forskellige måder, justeret til individuelle behov og nye moduler kan nemt implementeres. Endvidere kan de analytiske moduler anvendes separat, fx hydrolysen modul i kombination med HT-PMP-derivatisering modul kan udføre en monomer analyse præparat fra forskellige polymeropløsninger (1 g / l) i 96-brønds format. For laboratorier uden at have adgang til et flydende håndteringssystem den komplette screening kan håndteres manuelt uden ændringer i pipettering ordningen. Men anvendelse af et væskehåndteringssystem øger, gennemløbet til op til 768 stammer (i stedet for 192 påvirkninger Hvis screened manuelt) per dag. Den protokol, der er beskrevet her er i stand til en screening for forskellige slægter og derfor til screening af store strain samlinger for at identificere hidtil ukendte EPS producenter og analysere deres kulhydrat fingeraftryk i én tilgang (figur 4). Endvidere kan en målrettet screening for polysaccharider indeholdende sjældne sukkerarter såsom fucose, uronsyrer eller endda ukendte sukre udføres via detaljerede monosaccharid analyse. Også, kan påvises forskellige sukker kombinationer i definerede nøgletal. Dette muliggør simpel identifikation af strukturelt beslægtede varianter af allerede kendte EPS eller nye EPS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well deep well plate 2.0 ml (DWP)	Greiner Bio-One	780271	Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990 µl of ddH2O
Breathable Sealing Film	Axygen	BF-400-S	Incubation film for pre- and main-culture DWP
Aluminum Sealing Film	Axygen	PCR-AS-200	-80 °C storage film for glycerol-stock plates
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl	TECAN	30038619	Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)
A/B glass-filter-plate 1 µm	Pall Corporation	PN 8031	Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well micro titer plate V-Bottom	Greiner Bio-One	651201	Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well SpinColumn G-25	Harvard Apparatus	74-5612	Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)
96-well micro titer plate V-Bottom	Nunc	249944	Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips	TECAN	30038609	Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)
Trough 250 ml	Axygen	Res-SW96-HP	Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetate buffer pH 5.6 (CP 5-7)
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP)	Greiner Bio-One	655101	precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)
96-well silicon cap mat	Whatmann	7704-0105	Cover mat for MTP
200 µl pipette tips	Sarstedt	70.760.002	For manually handling
1,000 µl pipette tips	Sarstedt	70.762	For manually handling
96-well-PCR micro titer plate	Brand	781350	Hydrolysis, PMP-derivatisation
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat	Brand	781405	Hydrolysis, PMP-derivatisation
Filter plate 0.2 µm Supor	Pall Corporation	PN 8019	Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate
Pipette Tips LHS 5-300 µl	Brand	732150	Brand LHS system
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133	Glucose-assay
Horseradish peroxidase	Sigma-Aldrich	P6782	Glucose-assay, pyruvat-assay
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt)	Wako Chemicals GmbH	043-22351	Pyruvat-assay
Pyruvate oxidase	Sigma-Aldrich	P4591	Pyruvat-assay
Potassium phosphate dibasic	Carl-Roth	P749.3	Pyruvat- and glucose-assay
Potassium phosphate monobasic	Carl-Roth	3904.3	Pyruvat- and glucose-assay
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Pyruvat-assay
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	31413	Pyruvat-assay
2-Propanol	VWR	20922.466	Precipitation
Phenol	VWR	20599.231	Phenol-sulfuric-acid method
Sulfuric acid	Carl-Roth	4623.4	Phenol-sulfuric-acid method
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508	Hydrolysis
Ammonium solution	Carl-Roth	P093.1	Hydrolysis, PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	Hydrolysis, PMP-derivatization
Phenol red	Alfa Aesar	B21710	Hydrolysis, PMP-derivatization
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone	Sigma-Aldrich	M70800	PMP-derivatization
Methanol LC-MS	VWR	83638.320	PMP-derivatization
Acetonitril LC-MS	VWR	83040.320	PMP-derivatization
Acetic acid	Sigma-Aldrich	338826	PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	PMP-derivatization
Methyl red	Alfa Aesar	36667	pH-value
Robotic liquid handling system	Tecan	Freedom EVO	Worktable setup in Figure 2
Liquid handling station LHS	Brand	709400	Worktable setup in Figure 2
Tip-Adapter	Brand	709434	Worktable setup in Figure 2
Liquid Ends MC 20-300 µl	Brand	709416	Worktable setup in Figure 2
Adapter 60 mm	Brand	709430	Worktable setup in Figure 2