Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

Published: April 11, 2016 doi: 10.3791/53249
Automatic Translation
1, 1, 1
1Chair of Chemistry of Biogenic Resources, Technische Universität München

Abstract

מיקרואורגניזמים רבים מסוגלים לייצר ומפריש exopolysaccharides (EPS), אשר יש השלכות חשובות בתחומים רפואיים, יישומי מזון או החלפת כימיקלים מבוססים פטרו. אנו מתארים פלטפורמה אנליטית כדי להיות אוטומטי על מערכת טיפול הנוזל המאפשר ניתוח מהיר ואמין של סוג וכמות EPS המיוצר על ידי מיקרואורגניזמים. זה מאפשר למשתמש לזהות מפיקי exopolysaccharide חיידקים טבעיים רומן לנתח את טביעת אצבע הפחמימות של פולימרים המקבילה תוך יום אחד תפוקה גבוהה (HT). באמצעות פלטפורמה זו, אוספים זן וכן ספריות של וריאנטים זן שעשוי להתקבל כתוצאה גישות הנדסה יכול להיות מוקרן. הפלטפורמה יש התקנה מודולרית, המאפשרת פרדה של הפרוטוקול לשני חלקים עיקריים. ראשית, קיימת מערכת סינון אוטומטית, המשלבת מודולים זיהוי פוליסכריד שונים: ניתוח וכמותיות של viscosity היווצרות באמצעות צעד צנטריפוגה, ניתוח של היווצרות פולימר באמצעות משקעי אלכוהול וקביעת תוכן הפחמימות באמצעות טרנספורמציה פנול-גופרתי החומצה. הנה, אפשר להקרין עד 384 זנים לכל ריצה. החלק השני מספק ניתוח monosaccharide מפורט לכל מפיקי EPS שנבחרו מזוהה החלק הראשון על ידי שילוב של שני מודולים חיוניים: הניתוח של רכב מונומר המלא באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם אולטרה סגול וזיהוי מלכודת יוני יינון electrospray ( UHPLC-UV-ESI-MS) וקביעת פירובט בתור substituent פולימר (בנוכחות ketal פירובט) באמצעות חמצון אנזימטי כי מצמידים במערך צבע. כל המודולים אנליטי של פלטפורמת סינון זה ניתן לשלב בדרכים שונות ומותאמים לדרישות פרט. בנוסף, הם יכולים להיות מטופלים באופן ידני או בצעו עם מערכת טיפול נוזל. ובכך, PLA ההקרנהtform מאפשר גמישות עצומה כדי לזהות EPS השונה.

Introduction

exopolysaccharides מיקרוביאלית (EPS) הם קבוצה מגוונת מבחינה מבנית ביותר של פולימרים הממלאים תפקודים ביולוגיים שונים. הם בנויים בדרך כלל של יחידות חוזרות מורכבות, הנבדלות ביניהם סוגים שונים של מונומרים (סוכר, נגזר סוכר, חומצות סוכר), את הקשר בין מונומרים אלה וההחלפות שלהם. המגוון המבני של סוכרי מיקרוביאלי מקנה מאפיינים שונים למדי לחברי כיתת מולקולה זו, המאפשרת היישום שלהם בתחומים שונים כמו מזון 1, קוסמטיקת 2,3, כימית בניית 4 או מי טיפול 5. כדי להרחיב עוד יותר את השדה של יישום של ביו המבוסס אלה וכאלה פולימרי קיימא לזיהוי סוכרי חיידקים טבעיים רומן וכן ההנדסה של וריאנטים מבניים מייצג גישות מבטיחות. כך או כך, שיטת הקרנה מהירה נדרשת כדי לסרוק מספר עצום של זנים של חיידקים במהירות their היווצרות פוליסכריד, ולנתח את מוצריהם. לכן, פיתחנו לאחרונה פלטפורמה 96-היטב HT-ההקרנה לניתוח ייצור פוליסכריד חיידקים מן מבודד טבעי או גרסאות זן מהונדס הכוללת את הזיהוי של הרכב monomeric 6.

החלת פלטפורמה זו לסיבוב הקרנה ראשון של בידודים טבעיים ~ 500 אפשרה לנו לזהות רק כ -10 עד 20% של הזנים הבודדים כמו להיות מסוגל לייצר EPS (מידע לא מוצג). משמעות הדבר היא כי 80-90% של הזנים נתחו לא לייצר EPS בתנאים המיושמים, ולכן, ניתוח נוסף של טביעת אצבע פחמימות המפורטת לא היה נחוץ. כמו זיהוי משוכלל זה של רכב monomeric הוא תהליך גוזל זמן, במיוחד לניתוח נתונים, שיטה מראש הקרנה מהר כדי לזהות את הזן חיובי בייצור EPS, תגדיל את היעילות באופן דרסטי. יתר על כן, חומרים כימיים,מתכלים זמן המדידה על יוקטנו UHPLC-UV-ESI-MS. בנוסף, מודולים אנליטיים השונים, בעוד מצד אחד להפוך את השיטה אמינה, הם מצד השניים שמסבכים את הטיפול הידני של יותר משני לוחות 96-גם במקביל, וככזה להגביל את מלוא הפוטנציאל של השיטה. מסיבות אלה, החלטנו לפתח פלטפורמת הקרנה אוטומטית. לכן, שלבנו את הפורמט מודולרי של טכניקת טביעת אצבע פחמימות הקיימת עם שיטת זיהוי המהיר אוטומטית לחלוטין של תכולת הסוכר הכולל, המבוסס על מדידה ספיגה.

שיטת פנול-גופרתי החומצה עדיין מייצגת את שיטת הבחירה של הקביעה המהירה של תכולת פחמימות כוללת של סוכרי חיידקי צמח 7,8. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי דובואה et al. 9 ומותאמת עבור יישומים שונים וגדל מדגם, אפילו בקנה מידה קטנה 96-גם צלחות 10,11. Pheשיטת nol-גופרתי חומצה מודדת את תכולת פחמימות הכוללת לפי ערך אחד בלבד, summating כל monomeric, oligomeric והפחמימות הפולימרי של הדגימות.

אם ייקח ההיבטים הללו בחשבון, הבחירה של מדיום גידול מתאים חיונית ליישם את השיטה. מדיה מורכבת המכילה oligomeric או תרכובות פחמימות פולימריים כמו תמצית שמרים עלולה להוביל תוכן פולימר שינה ולכן, יש להימנע לחלוטין. יתר על כן, כמויות גדולות של סוכרים משמשים C-מקור לגידול של זנים. רמות גבוהות של פחמימות הנותרות מתהליך הטיפוח עלולות להפריע שלילית עם המדידה של תוכן EPS.

לכן, השימוש של סוכרים מוגדרים וטהורים מומלץ. בניסויים שלנו השתמשנו גלוקוז לגידול של תאים. גלוקוז הנותרת לאחר הטיפוח הופחתה באמצעות סינון ג'ל וקבעה באמצעות assay-גלוקוז. לבסוף, המקבילה גלוקוזהים של הסוכרים חושב על ידי הפחתת גלוקוז הנותרת לאחר סינון ג'ל מתוכן הפחמימות כי אותר בשיטת פנול-גופרתי החומצה. ג'ל סינון-assay גלוקוז בשילוב עם שיטת גופרתית חומצה-פנול להבטיח תוצאות אמינות ומסוגלים להיות, הראשון שלנו מערכת זיהוי אוטומטי לחלוטין.

שני מודולים אנליטיים חדשים נכללו במצע ההקרנה אוטומטית כדי להגדיל את הכמות של מידע ממערכת EPS-זיהוי: משקעים ואת התצפית של גידול צמיג.

EPS השונה רב - למשל succinoglycan, xanthan וחומצה גס 12 - מדווחים להיות שונה עם ketal פירובט שאינם פחמימות על עמדות סוכר C4 ו- C6. אלה ketals פירובט (בדיוק כמו אסטרים חצי succinyl וחומצות uronic) לתרום לאופי polyanionic ולכן, אל prope הפיזיrties של הפולימר על ידי אינטראקציה באמצעות גשרים קטיון divalent 13. על מנת לזהות את אותם פולימרים בפרט קביעת פירובט הוקמה מודול אנליטי נוסף אחר. זה מגדיל את המידע על מתמירים פוליסכריד ומאפייני מקרוסקופית הפוטנציאל שלהם.

שילוב כל המודולים מאפשר זיהוי של EPS השונה וכן קביעה מהירה ויעילה של יצרני EPS. לפי הגישה כי פלטפורמת ההקרנה ניתן לחלק לשני חלקים עיקריים (איור 1). בתוך ההקרנה אוטומטיות (חלק א) העבודה מתרחשת אוטומטי לחלוטין (טבלה 1) כדי ומיון קפדני EPS במהירות לייצר זנים. הניתוח טביעת אצבע פחמימות (חלק ב ') כמותית קובע את ההרכב מונומר של EPS המיוצר על ידי זנים שנבחרו מראש. ובכך, ניתוח הנתונים צומצם כדי לייעל את הקרנת אוספי זן גדולים. זֶהמציע את האפשרות לנתח 384 זנים בטווח הקרנה יחיד אוטומטי אחד ועם שתי ריצות שהן אפשריות ליום של 768 זנים ליום. בנוסף, ניתוח טביעות אצבעות פחמימות נותן סקירה מפורטת עוד יותר של כל EPS המזוהה. זה מאפשר לנתח ביים זיהוי של וריאנטים EPS שונים במקצת בלבד או חדש לגמרי לעומת המבנים הכימיים תארו כבר של EPS.

Protocol

1. הקרנה אוטומטית

הערה: כל צעדי טיפול הנוזל נעשים עם מערכת טיפול נוזל רובוטית. הרכב שולחן העבודה הרובוט מוצג באיור 2. כל החומרים המתכלים מאוחסנים קרוסלה אחסון, אלא אם כן צוין אחרת. עבור כל ההקרנה האוטומטית צעדי מניפולטור רובוטי (RM) מעביר את המתכלים, (צלחת באר עמוקה (DWP); צלחת כייל מייקרו (MTP); צלחת תגובת שרשרת פולימראז (צלחת PCR) וכן הלאה) בין עמדות הקרוסלה (CP ) ואת עמדות שולחן העבודה (WTP). כל השלבים פיפטה מבוצעים עם 96 ערוצים פיפטה-יד, אלא אם כן היא מוזכרת אחרת. כל הצעדים מתוכנתים ו נעשים באופן אוטומטי בפורמט 96-היטב.

  1. טיפוח זנים (משימה 1 באיור 1)
    הערה: טפלו חיסון של EPS המשוערת לייצר זנים ואת האיטום של צלחות הטיפוח בתנאים סטריליים (זרימה למינרית). אוטומטיהקרנה מהר יכולה להתמודד עם ארבע צלחות 96-היטב לכל ריצה. זנים שונים של כמה סוגים כבר נבדקו 6.
    1. ידני ולחסן את התרבות מראש (1 מיליליטר EPS-מדיה בתוך DWP) עם משכפל 96 פינים מצלחת מניות גליצרול 96-היטב. מכסה את הצלחת עם סרט איטום לנשימה כדי למנוע אידוי לאפשר אוורור. לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות ב -1,000 סל"ד על-שייקר MTP.
    2. לחסן את התרבות הראשית (990 EPS-מדיה μl בתוך DWP) על ידי העברת 10 μl של התרבות מראש באמצעות 50 μl 12 ערוצים רבת פיפטה הדגירה באותם תנאים כמו-התרבות מראש. קח פתק של כל הזנים שאינם גדל.
  2. הכנת רובוט שולחן העבודה ואת הקרוסלה החפצה
    1. לספק את כל החומרים המתכלים מפורטים חומרים וציוד אל המיקום הנכון בקרוסלת האחסון. להוסיף 990 μl של מים מזוקקים כפול (DDH 2 O) בכל טוב של DWP עבור 1: 100 דילולים עבור הגלוקוז-assay דואר (מיקום קרוסלה 4-1 4-4).
    2. מסדרים שוקת 250 מ"ל המכיל 150 מ"ל של DDH 2 O במיקום שולחן העבודה (WTP) 11.
    3. להפקיד שוקת 250 מ"ל המכיל 50 מ"ל תערובת מגיב גלוקוז-assay (4 מ"ל 500 פוספט אשלגן מ"מ (pH 5.7), 1.5 מ"ל 50 2.2-azinobis- מ"מ (3ethylbenzthiazoline) חומצה -6-sulfonic, 2 מ"ל 100 גלוקוז אוקסידאז U, 10 μl 1,000 peroxidase חזרת U ו- 42.49 מ"ל DDH 2 O) במיקום WTP 1-2.
    4. מניחים שתי MTPs F-התחתון דמה ריק במיקום WTP 3-1 3-2.
    5. הסר את הסרט איטום לנשימה, להקצות את תרבויות העיקרי בעמדות קרוסלה (CP) 1-1 כדי 1-4 ולהתחיל בתוכנית רובוטיות אוטומטיות.
  3. איזון של צלחות ג'ל סינון
    הערה: צלחות סינון ג'ל המשמשות במהלך הקרנה זה ניתן לעשות שימוש חוזר. לשם כך, לשטוף צנטריפוגות שלוש פעמים כל אחד עם 150 μl של DDH 2 O XG ב 2000 עבור 2 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לאחסן ב 4° C עם 75 μl של אתנול 20% ומכסים מחצלת כובע סיליקון.
    1. הזז את 250 מ"ל שוקת (CP 5-7) עם 5 חיץ אמוניום אצטט מ"מ (pH 5.6) על 3-3 WTP.
    2. מעבירים את צלחות ג'ל-סינון (CP 1-6, 1-7, 2-6 ו 2-7) מהמסוע אל WTPs 4-1 4-4.
    3. לשאוב 150 μl של חיץ אמוניום אצטט באמצעות 200 טיפים μl ולחלק למרכז כל הצלחות ג'ל-סינון עבור איזון.
    4. מעבירים את צלחות ג'ל-סינון לתוך צנטריפוגה (2,000 XG עבור 2 דקות ב 20 מעלות צלזיוס).
    5. מעבירים את הצלחות בחזרה אל שולחן העבודה, חזור על השלבים 1.3.3, 1.3.4 ו 1.3.3. אין לחזור על שלב צנטריפוגה כדי למנוע התייבשות של הצלחות ג'ל-סינון. אחסן את צלחות ג'ל-סינון equilibrated בחזרה בתוך הקרוסלה.
  4. הסרת תאים באמצעות צנטריפוגה (משימה 1 באיור 1)
    הערה: כדי להבטיח רקע נמוך בתוך גישת ההקרנה, לנתח תא חינםEPS המכיל supernatants רק ולהסיר תאים באמצעות צנטריפוגה לאחר הטיפוח.
    1. מעביר את DWP-התרבות הראשית מהמסוע (1-1 כדי 1-4) לתוך צנטריפוגה (4,300 XG 30 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס).
    2. מכינים את שולחן העבודה באמצעות RM לעבד את התרבות העיקרית.
      הערה: צעדים 1.4.2 ל 1.4.3.5 המערכת תמיד מטפלת שתי צלחות במקבילות ואחר כך חוזרת על כל השלבים עם שתי הצלחות הבאות.
      1. עבור משקעים לפני סינון להזיז את MTP מ CP 6-1 ו 6-2 כדי WTP 4-1 ו 5-1. הזז את MTPs pH-מחוון מ CP 7-1 ו 7-2 כדי WTP 4-2 5-2.
      2. מעבירים את צלחת סינון יחד עם צלחת אספן מהמחסום 2-1 ו 2-2 כדי WTP 4-3 ו 5-3. מקם מחדש את 1-1 ו 1-2 מתוך צנטריפוגה-התרבות הראשית DWP כדי WTP 4-4 ו 5-4.
      3. הכן את מודולים אנליטיים.
        הערה: קח 200 טיפי μl מאחסון הקצה (מיקום 2-1 2-4). על מנת להקטין מתכלים, להשתמש באותו סט טיפ צעד 1.4.3.1.
        1. העבר 180 μl של supernatant התרבות הראשית לצלחת הסינון. לשאוב 150 μl מן supernatant העיקרי-תרבות לוותר 50 μl לתוך MTP עבור משקעים לפני סינון ו -100 μl לצלחת pH-אינדיקטור.
          הערה: להגדרת pH אינה הכרחית; עם זאת, לאחר הוספת חיווי אדום 12.5 מיליליטר מתיל (50 מ"ג ב 50 אתנול מיליליטר) בכל טוב עם טפטפת רב שלבים הוא מציין זני חומצה-ייצור גבוה. מידע זה יכול להיות שימושי כדי למנוע עיכוב צמיחה (ב- pH הנמוך) עבור cultivations נוספת, למשל להקרנה שנייה עם ריכוז חיץ גבוה. יתר על כן, pH הנמוך עלול גם לגרום ייצור EPS כדי להגן על התא מפני הסביבה חומצית.
        2. חזור על שלב 1.4.3.1 עבור הצלחת עיקרית התרבות השנייה. השתמש טיפ-סט טרי.
        3. הזז את צלחות סינון בצנטריפוגה ולהסיר את כל לוחות אחרים מהעמוד בו שולחן העבודה בחזרה לעמדות בביתם carousאל.
        4. חזור על 1.4.2.1 צעדי 1.4.3.3 עבור הצלחת עיקרית התרבות השלישית ורביעית.
        5. קח פתק של אלה broths התסיסה, אשר מראים ירידת שקיעה לאחר צנטריפוגה של צלחות התרבית העיקריות, כאשר הם מועברים בחזרה אל (השליטה הצמיגה) הקרוסלה.
  5. סינון 96-גם עבור הסרת Cell Complete (משימה 2 באיור 1)
    הערה: כדי להבטיח תא הסרת מרק תסיסה צמיג צעד סינון כלול ההקרנה.
    1. צנטריפוגה צלחות הסינון ב 3000 XG במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ולהביא אותם חזרה לעמדת מוצא הקרוסלה שלהם.
    2. הכן את צלחות ג'ל-סינון.
      1. הזז את צלחות ג'ל-סינון equilibrated מהמסוע אל בצנטריפוגה ספין XG ב 1000 עבור 2 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
      2. מעבירים את צלחות ג'ל-סינון מן צנטריפוגות כדי WTP 4-1 ל -44.
      3. הזז את ג'ל הטריאספן -filtration הצלחות מן CP (3-1 3-4) כדי WTP (5-1 כדי 5-4).
      4. מעבירים את צלחות ג'ל-סינון equilibrated (WTP 4-1 4-4) צלחות אספן טריים (5-1 כדי 5-4).
      5. לנקות את שולחן העבודה למעט עמדות 5-1 ו 5-2 ולעבור בעמדה 5-1 למקם 4-1.
    3. מכינים את שולחן העבודה באמצעות RM לעבד את filtrates.
      הערה: צעדים 1.5.3 ל 1.6.3.5 המערכת מטפלת שתי צלחות במקבילות וחוזר כל השלבים עם שתי הצלחות הבאות.
      1. הזז 50 טיפים μl מהמסוע (4-6 ו 4-7) כדי WTP 3-3 ו 3-4.
      2. מעבירים את צלחות סינון מ CP 3-1 3-2 על שולחן העבודה (4-4 ו 5-4).
      3. מקמו מחדש את DWP (דילול 1: 100) לצורך זיהוי של צריכת גלוקוז מהמחסום 4-1 ו 4-2 WTP 4-2 5-1.
      4. הזז את MTP עבור הממטרים השניים לאחר סינון מ CP 8-1 ו 8-2 כדי WTP 4-3 ו 5-3.
      5. הרם את צלחות סינון מצלחת האספןs (WTP 4-4 ו 5-4) ולהעביר אותם WTP 3-1 3-2.
    4. הכן את מודולים אנליטיים לאחר סינון. על מנת להקטין מתכלים, להשתמש באותו סט טיפ צעדים 1.5.4.1 ו 1.5.4.3.
      1. קח 50 טיפים μl ו פיפטה aliquot 10 μl של תסנין אל DWP (1: 100 דילול) עבור assay-גלוקוז (צריכת גלוקוז).
      2. פיפטה 35 μl של תסנין במרכז הצלחת ג'ל-סינון equilibrated ו -50 μl אל MTP המשמש משקעים.
      3. חזור על שלבי 1.5.4.1 כדי 1.5.4.2 עבור הצלחת הסינון השנייה.
      4. הזז את צלחות ג'ל-סינון בצנטריפוגה להעביר את כל הצלחות אחרות מהעמוד בו שולחן העבודה בחזרה לעמדות הביתה הקרוסלה.
      5. חזור על שלבי 1.5.3.1 כדי 1.5.4.4 עבור הצלחת הסינון השלישית ורביעית.
      6. לאחר אחסון של כל הצלחות בחזרה בביאור לקחת קרוסלה של supernatants צמיגה מאוד, כפי שצוין על ידי שאריות בצלחת מסנן (נ גבוההשליטת iscosity לאחר שלב הסינון). חוסר התסנין יכול להוביל לתוצאות שליליות שגויות במודולים אנליטיים הבאים.
  6. הסרת גלוקוז באמצעות 96-גם ג'ל סינון (משימה 3 באיור 1)
    1. צנטריפוגה צלחות ג'ל-סינון XG ב 1000 עבור 2 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
    2. מכינים את שולחן העבודה באמצעות מניפולטור רובוטי לעבד את-filtrates ג'ל.
      1. לספק 50 טיפים μl מהמסוע (5-3 ו 5-4) כדי WTP 3-3 ו 3-4.
      2. לקביעת גלוקוז הנותרת לאחר סינון ג'ל לנוע שתי MTPs מ CP 9-1 ו 9-2 כדי WTP 4-1 ו 5-1.
      3. לקבלת השיטה פנול-גופרתית חומצה לנוע שתי MTPs מ CP 8-5 ו 8-6 כדי WTP 4-2 5-2.
      4. העבר שתי צלחות ג'ל-סינון מן צנטריפוגות כדי WTP (4-3 ו 5-3).
      5. הרם את צלחות ג'ל-סינון מצלחת האספן (4-3 ו 5-3) ולהעביר אותם WTP 3-1 3-2.
    3. מכינים את שולחן העבודה באמצעות מניפולטור רובוטי לעבד את-filtrates ג'ל.
      הערה: על מנת להקטין מתכלים, השתמש באותה עצה שנקבע לצעדים 1.6.3.1 ו 1.6.3.2.
      1. על מנת לקלוט את הגלוקוז שנותר לאחר סינון ג'ל (01:10 דילול) לקחת 50 טיפים μl ולהעביר 25 μl של DDH 2 O (WTP 1-1) על MTP טריים. לשאוב 20 μl של DDH 2 O (WTP 1-1), 5 μl של אוויר ו -5 μl של תסנין ג'ל ולחלק אותו לתוך הצלחת.
      2. עבור פיפטה פנול-גופרתית חומצה-השיטה 20 μl של תסנין ג'ל אל MTP.
      3. חזור על שלבים 1.6.3.1 ו 1.6.3.2 עבור הצלחת ג'ל-תסנין השני.
      4. להעביר את כל הצלחות מן שולחן העבודה בחזרה לעמדות הביתה הקרוסלה שלהם.
      5. חזור על 1.6.2.1 צעדים 1.6.3.4 עבור הצלחת ג'ל-סינון השלישי והרביעי.
  7. מודולים גלוקוז-assay
    1. מכינים את שולחן העבודה באמצעות מניפולטור רובוטי לבצע את הגלוקוז-כמולומר.
      1. מקמו מחדש את DWP (1: 100 דילול) מ CP 4-1 ו 4-4 כדי WTP 5-1 ו 5-4.
      2. להעביר את כל MTPs מ CP 9-5 ו 9-8 כדי WTP 4-1 ו 4-4.
      3. קח 200 טיפים μl ומערבבים דילול ידי aspirating מחלק עשר פעמים את נפח של 180 μl. ואז פיפטה aliquot 50 μl אל MTP.
      4. חזור על שלבים 1.7.1.2 ו 1.7.1.3 עבור כל ארבעת DWPs (1: 100 דילול).
      5. הסר את כל DWPs (5-1 כדי 5-4) מן שולחן העבודה.
    2. מכינים את שולחן העבודה כדי להפעיל את-assay גלוקוז.
      1. לקביעת גלוקוז הנותרת לאחר העברת ג'ל-סינון כל MTPs מ CP (9-1 כדי 9-4) כדי WTP (5-1 כדי 5-4).
      2. הזז את צלחת כיול גלוקוז-assay - המכיל שלוש פעמים 50 μl של ריכוזי גלוקוז הבאים (90, 45, 18, 9, 4.5, 1.8, 0.9, 0.45 ו 0 מ"ג / L) - מ CP 9-9 כדי WTP 3- 3.
      3. קח 200 טיפים μl ואת לשאוב 50 μl של תערובת מגיב גלוקוז-assay מ WTP 1-2, כדי להפעיל את assay הראשון. הזז את MTPs לתוך החממה (30 מעלות צלזיוס ב 150 סל"ד במשך 30 דקות).
      4. הגדר את לוח הזמנים כדי להפעיל את התכנית עם 5 עיכוב דקות בין הלוחות.
      5. לאחר 30 דקות של הדגירה להזיז את הצלחות מן החממה עד MTP-הקורא ספיגת שיא 418 ו -480 ננומטר.
      6. לאחר המדידה להזיז את הצלחות לעמדת המוצא שלהם הקרוסלה.
  8. הכנת הרטיבות
    הערה: על מנת להעריך את הייצור EPS לבצע ממטרים של supernatant עם 2-פרופנול לפני ואחרי שלב הסינון הראשון. יתר על כן, להעריך את הספיחה של הפולימר על קרום המסנן ידי תצפית של סיבים פתיתי במקום הראשון, אך לא הממטרים השניים.
    זהירות: טפל 2-propanol כנוזל דליק אך ורק תחת במנדף.
    1. הסר את כל הצלחות ממטר (CP 6-1 כדי 6-4 ו 8-1 כדי 8-4) מהמסוע. ולהוסיףבאופן ידני 150 μl של 2-propanol היטב כל עם טפטפת רב שלבי 12.5 מ"ל.
    2. מכסים את כל MTPs עם מחצלת סיליקון שווי ולנער בטמפרטורת החדר (RT) (10 דק 'ב 900 סל"ד). ראייה להתבונן תצורות סיבים או פתית לאחר שלחץ מצייני ייצור EPS.
  9. שיטת פנול-גופרתי חומצה
    זהירות: טפל גופרתי חומצה מרוכזת פנול מתחת למכסת מנוע קטר. פנול הוא סוכן מאכל מוטגנים.
    1. לקבלת השיטה פנול-גופרתית חומצה, להסיר את הצלחות (CP 8-5 כדי 8-8) מהמסוע ולהכניס אותם לתוך מערכת טיפול הנוזל (מיקום 4 עד 8). כלול את צלחת כיול עם 20 μl של ריכוזי גלוקוז שונים (10; 5; 2.5; 1; 0.5; 0.25; 0.1; 0.05; 0 g / L) ב triplicates.
    2. מניחים מיכל פסולת במיקום 1, תיבת טיפ 200 μl במיקום 2 ו שוקת 250 מ"ל עם 110 מ"ל חומצה פנול-גופרתית (מוכן טרי על פנול מ"ל with18.3 קרח 5% (w / v) ב DDH 2 O ו 91.7 מ"ל של קונצרט כלשהו. sulfuric חומצה) במיקום 3.
    3. השתמש פיפטה 8 ערוצים עם 300 טיפי μl ולהעביר 180 μl של חומצת פנול-גופרתית לתוך כל שורה של כל הצלחות.
    4. מכסים את כל MTPs עם מכסים, מערבבים אותם בטלטול (5 דק 'ב 900 סל"ד, RT) דגירה אותם במשך 35 דקות ב 80 מעלות צלזיוס בתנור במשך תגובת צבע. לאחר הרגעות מתחת למכסה מנוע קטר, למדוד את ההכחדה ב 480 ננומטר.
  10. מבחר EPS חיובי Supernatants (משימה 4 באיור 1)
    1. לצורך ההערכה של הייצור EPS, בחר זנים אלה מההקרנה אוטומטי למלא לפחות שניים מתוך שלושת הקריטריונים כפי חיוביות (צמיגות מלאה 2.6.1 ו 2.6.2, זיהוי של פולימר 2.6.3, 2.6.5 שווה ערך גלוקוז). מעביר את filtrates שנותר מן הלהיטים החיוביים על MTP חדש לעיבוד נוסף.
      הערה: כאשר הצלחות מכוסות סרט איטום אלומיניום הם יכולים להיות מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס במשך שבוע אחד לפחות. בתוך אותו זמן determination של טביעת אצבע הפחמימות לבצעו.

2. טביעות אצבע פחמימות

הערה: כל השלבים עבור טביעת אצבע הפחמימות מבוצעים באופן ידני.

  1. ג'ל סינון של חיובי Supernatants (משימה 5 באיור 1)
    הערה: ג'ל סינון הכרחי שכן אין תסנין עזב מההקרנה האוטומטית. ג'ל סינון עם נפח של יותר מ -35 תוצאות μl ב יעילות טיהור ירד.
    1. הכן איזון של הצלחות ג'ל-סינון על ידי מחלק 150 μl של חיץ אמוניום אצטט לתוך כל הבארות באמצעות פיפטה רב שלבי 12.5 מ"ל.
    2. מעבירים את צלחת ג'ל-סינון לתוך צנטריפוגה (2,000 XG עבור 2 דקות ב 20 מעלות צלזיוס).
    3. חזור על שלבים 2.1.1, 2.1.2 ושוב 2.1.1. צנטריפוגה את הצלחת ג'ל-סינון XG ב 1000 עבור 2 דקות ב 20 מעלות צלזיוס לפני שימוש נוסף.
    4. פיפטה 35 μl של תסנין לתוךבמרכז הצלחת ג'ל-סינון בעזרת פיפטה 12 ערוצים 50 μl.
    5. צנטריפוגה את צלחת ג'ל-סינון XG ב 1000 עבור 2 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ואז להרים אותו מצלחת האספן.
    6. הכן את-assay גלוקוז לפני הידרוליזה: בצע 1:10 דילול ידי הוספת 45 μl של DDH 2 O ו -5 μl של תסנין ג'ל עם טפטפת μl 12 ערוצים 50 ו לכסות את MTPs עם מחצלת כובע סיליקון.
      הערה: הקביעה הנכונה של ערך גלוקוז של הפולימר, למדוד את תכולת הסוכר לפני הידרוליזה ולחסר אותו מתוכן גלוקוז לכמת לאחר השלב הידרוליזה.
    7. הכן את assay-פירובט לפני הידרוליזה: ביצוע דילול 1:20 בעזרת פיפטה 12 ערוצים 200 μl להוסיף 95 μl של DDH 2 O, העברת 5 μl של תסנין ג'ל זה טוב לאטום את MTP עם מחצלת כובע סיליקון .
  2. 96-גם הידרוליזה מיקרו (משימה 6 באיור 1)
    הערה: חממובתנור הדגירה (כולל אמבט חול) עד ​​121 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות לפחות לפני השימוש. תקן הידוק מיוחד פותחתה כדי למנוע אידוי במהלך השלב הידרוליזה בקנה המידה הקטן.
    1. קחו PCR-צלחת חדשה ולהעביר 20 μl של תסנין ג'ל עם טפטפת μl 12 ערוצים 50.
      זהירות: חומצת trifluoroacetic היא חומצת מאכל רעילה. פתרון אמוניום הוא מאכל. לטפל בשני כימיקלים רק מתחת למכסה המנוע קטר.
    2. הוסף 20 μl של 4 M חומצה trifluoroacetic עם טפטפת 1.25 מ"ל רב שלבי היטב כל אחד. ואז לכסות את הצלחת ה- PCR עם אלסטומר תרמופלסטי (TPE) מחצלת כובע והמקום צלחת PCR במכשיר ההידוק מיוחד.
    3. מערבבים את פתרונות באמצעות היפוך המכשיר ההידוק עשר פעמים. שים את צלחת PCR בצנטריפוגה ספין XG ב 2000 למשך 2 דקות כדי לאסוף את כל הנוזל על הקרקעית. שים את צלחת PCR בחזרה להתקן ההידוק ולאבטח את המכשיר עם ברגים.
    4. מניחים אתמכשיר clamping מאובטח באמבטית החול המחוממת מראש דגירה במשך 90 דקות ב 121 מעלות.
    5. הסר את התקן ההידוק מאמבטית החול ולתת לו להתקרר RT.
    6. הסר את ברגי ספין שוב בצנטריפוגה XG ב 2000 למשך 2 דקות כדי לאסוף את כל המעובה בתחתית הבארות וכדי למנוע זיהום צולב במהלך ההסרה של מזרן הכובע.
    7. הוסף פתרון אמוניה 3.2% כדי להתאים את ה- pH ל כ. 8 בעזרת פיפטה 12 ערוצים 200 μl. מכסים את צלחת PCR עם מחצלת כובע TPE ולנער אותו באמצעות מכשיר מהדק ידני.
    8. לאחר נטרול בצנטריפוגה צלחת PCR XG ב 2000 למשך 2 דקות.
  3. תפוקה גבוהה-1-פניל-3-מתיל-5-pyrazolone (-PMP HT) -derivatization של פחמימות (משימה 7 באיור 1)
    1. העברת 25 μl של hydrolyzate מנוטרל בתוך PCR-צלחת טרי בעזרת פיפטה 12 ערוצים 50 μl.
      הערה: לאחר נטילת aliquot, לבדוק את neutralization של הנוזל הנותר בצלחת הידרוליזה באמצעות הוספת 12.5 חיווי אדום μl פנול (פנול אדום 0.05 גרם באתנול 5 מיליליטר 20%) עם טפטפת רב שלב 1.25 מיליליטר. כל בארות שאינם הופכים צבע ורוד (pH 8) אינם derivatized כראוי.
    2. הוסף 75 μl derivatization-תערובת מגיב (125 מ"ג PMP, 7 מ"ל מתנול, 3.06 מ"ל DDH 2 O, ו 438 μl 3.2% פתרון אמוניום) ולכסות את הצלחת עם מחצלת כובע TPE.
    3. אחרי שלחצתי את הצלחת ה- PCR בצנטריפוגה מכשיר מהדק את צלחת XG ב 2000 למשך 2 דקות כדי לצבור את כל נוזל בתחתית.
    4. לקבלת מקום derivatization PCR-צלחת-Cycler PCR ב 70 מעלות צלזיוס למשך 100 דקות ולאחריה הרגעות ל -20 מעלות צלזיוס.
    5. העברת aliquot 20 μl לתוך MTP חדש בעזרת פיפטה 12 ערוצים 50 μl. לאחר מכן השתמש פיפטה 12 ערוצים 200 μl ולהוסיף 130 μl 19.23 מ"מ חומצה אצטית (0.962 מ"ל 1 M חומצה אצטית + 49.038 מ"ל DDH 2 O) לכל קו. מערבבים ישירות דרך aspirating מחלק (שש פעמים לפחות) ולהעביר את כל הנוזל לצלחת 0.2 מיקרומטר מסנן עם צלחת אספן MTP.
    6. צנטריפוגה את הצלחת (1,000 XG במשך 5 דקות), להסיר את הצלחת לסנן, לאטום את MTP עם מחצלת סיליקון כובע ומקום MTP לתוך UHPLC-UV-ESI-MS לקביעת טביעת אצבע פחמימות 14.
  4. הכנה-assay גלוקוז
    1. בצע דילול 1:10 באמצעות הוספת 45 μl של DDH 2 O ו -5 μl של hydrolyzate מנוטרל בעזרת פיפטה 12 ערוצים 50 μl ולכסות את MTPs עם מחצלת כובע סיליקון. מוסיפים שלוש פעמים 50 μl של סטנדרטים גלוקוז שונים (500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2.5 ו 0 מיקרומטר) על MTP חדש המשמש לכיול.
    2. הוסף 50 μl של תערובת מגיב assay-גלוקוז (step1.2.3 מתכון) בעזרת פיפטה 12 ערוצים 50 μl. ואז לכסות את הצלחות עם מחצלת כובע סיליקון לדגור על 30 מעלות צלזיוס, 400 סל"ד במשך 30 דקות בתוך חממת MTP.
  5. הכנה-assay פירובט
    1. בצע דילול 01:20 בעזרת פיפטה 12 ערוצים 200 μl. להוסיף 95 μl של DDH 2 O ולהעביר 5 μl של hydrolyzate מנוטרל היטב כל אחד. מכסים את MTP עם מחצלת כובע סיליקון.
    2. הוספת 100 μl של תערובת-מגיב assay-פירובט (3 מ"ל 1 מ"מ N - (carboxymethylamino-קרבוניל) -4.4'-bis (dimethylamino) מלח נתרן -diphenylamine (DA-64), 300 μl 10 מ"מ pyrophosphate תיאמין, 60 μl 100 מגנזיום כלוריד מ"מ hexahydrate, 2.4 מ"ל המשאף פוספט אשלגן 500 מ"מ (pH 5.7), 30 μl 100 מונואמין פירובט U, 12 μl 1,000 peroxidase חזרת U ו- 24.19 מ"ל DDH 2 O) בעזרת פיפטה 12 ערוצים 200 μl.
    3. מכסים את הצלחות עם מחצלת כובע סיליקוןnd לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו 150 סל"ד במשך 30 דקות. מייד לאחר ספיגת מידת הדגירה קורא-MTP ב ננומטר 727 ו -540.
  6. הערכת כל התוצאות של ההקרנה האוטומטית ואת טביעות אצבעות הפחמימות.
    1. שים לב אלה דגימות המציגים ירד שקיעה לאחר צלחות התרבות הראשיות כבר centrifuged ומאוחסנות חזרה הקרוסלה (השלב ​​מלא צמיגות 1.4.1). דוגמאות שאינן מראות היווצרות גלולה הן חיוביות (קריטריון 1 להקרנה אוטומטית).
    2. שימו לב supernatants צמיגה מאוד, אשר מסומנים על ידי שאריות בצלחת המסנן לאחר הצעד סינון (שלב מלאה צמיגות גבוהה 1.5.4.6). חוסר התסנין יכול להוביל לתוצאה שלילית שגויה במודולים אנליטיים הבאים. דוגמאות מקיים supernatants התרבות-הבארות המסננות הן חיוביות (גם קריטריון 1 להקרנה אוטומטית).
    3. מבחינה ויזואלית לצפות היווצרות סיבים או פתית לאחר דגירה. לרשום הערות כמו הכלומר מציין סוכרים. דרג שום משקעים עם (-); ממטרים נמוכים של סיבים או פתיתים עם (+) ואת משקעים גבוהים עם (++). יתר על כן, לזהות ספיחה של הפולימר על הממברנה הסינון באמצעות תצפית של סיבים פתיתי במקום הראשון, אך לא הממטרים השניים (קריטריון 2 להקרנה אוטומטית).
    4. בצע כיול ליניארית לחישוב ריכוז הגלוקוז.
      משוואה 1
      אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של המשוואה הזו.
    5. בצעו את הכיול הליניארית (קליטה על ריכוז) בין 5 ל גלוקוז 0.1 גר '/ ל. חישוב המקבילה גלוקוז של פולימרים הידרוליזה ולהעריך על ידי הפרמטרים הבאים: שווה ערך גלוקוז:> 700 mg / L = חיובי; 300-700 מ"ג / L = משוער חיובי; <300 מ"ג / L = שלילי בהקשר של פורמט EPSיון (קריטריון 3 להקרנה אוטומטית).
      משוואה 2
      אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של המשוואה הזו.
    6. לכמת כל הפחמימות שנקבעו עם שיטת HT-PMP. לסיכום כל כמויות ולהעריך כדלקמן:> 300 mg / L (חיובי); 150-300 מ"ג / L (חיובית משוערת) ו- <150 מ"ג / L (שלילית).
    7. לצורך חישוב ריכוז פירובט לבצע כיול ליניארית (100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5 ו 0 מיקרומטר). כדי לא לכלול את פירובט שנותר supernatant, לתקן את תוכן פירובט לאחר הידרוליזה דרך תוכן פירובט לפני הידרוליזה.
      משוואה 3
      אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של equat זהיוֹן.

Representative Results

התיקוף של השיטה פנול-גופרתי החומצה הראה תוצאות טובות עם מקדם הסבר (r²) של 0.9998 (טבלה 2). עבור ריכוז 5 גר '/ ל מקדם השונות (CV) ואת הדיוק הראו ביצועים טובים עם 1.8% ו -2.2 שגיאה%, אך ביצועים נמוכים עבור תקן 0.25 g / L 5.3% (CV) 6.1 שגיאה% ( הֲטָיָה).

המקדמים של קביעה היא עקומות כיול assay-פירובט (עם ובלי מטריקס) היו> 0.9999 במגוון כיול של 150 מיקרומטר (לוח 3). המקדמים של ההשתנות (CV) עבור רמת הכיול העליונה לעשירונים התחתונים היו <4.6% ואת הדיוק הראה ביצועים טובים מאוד על פני טווח הכיול להשלים עם פחות שגיאות 3.9%. לכן, המטריצה ​​משלב הידרוליזה לא הראתה השפעה על assay האנזימטית, שהוא כן מסוגל MEAsפירובט יור לפני ואחרי הידרוליזה.

לוח 4 מציג את התוצאות המפורטות של שלושה זני רומן מופת כפי שזוהו בהצלחה עם פלטפורמת ההקרנה. החלק השמאלי של הטבלה מציג את תוצאות מודולים ההקרנה האוטומטיות בדבר היווצרות צמיגה, לייצור פולימרים ומקביל גלוקוז מן הידרוליזה הכולל אשר שמשו כפרמטרי הערכה לניתוח טביעת אצבע פחמימות מפורטים. טביעת האצבע של הפחמימות המבוססת על סוכרים מכוילים כמו גם סוכרים ידועים, הדימרים ו מתמירים ניתנת בחלק הימני של הטבלה. על ידי שימוש במידע זה רכב monomeric ניתן לחשב ולעומת מבני פולימר ידועים כבר. יתר על כן, הקרנה ממוקדת עבור יצירות monomeric מעניינות ופחמימות נדירות יכולה להתבצע.

הביצועים הגבוהים של מיקרוהידרוליזה בקנה מידה ואת-derivatization HT-PMP הודגמו העבודה הקודמת שלנו 14. יתר על כן, האימות של סינון ג'ל ואת טביעת אצבע הפחמימות עבור סוגים שונים תוארה אחר פרסום 6. סיכומו של דבר, פלטפורמת ההקרנה עם המבנה מודולרי שלה ניתן לשנות בקלות תוך התאמה לדרישות פרט של המשתמש. ההקרנה האוטומטית של הפלטפורמה המאפשרת פעמים שמונה תפוקה גבוהה יותר ונותנת תוצאות אמינות. מודולים אנליטיים רומן כמו-assay פירובט ניתן לשלב בשילוב עם ניתוח טביעת אצבע פחמימות הם מספקים מידע מפורט מאוד על EPS המזוהה. ובכך, פלטפורמת ההקרנה היא חיונית כאשר מחפשים שניהם השונות מעט רומן לחלוטין גרסות EPS.

איור 1
איור 1: תכנית כוללת של h מודולרי igh תפוקת exopolysaccharide הקרנת פלטפורמה. ההקרנה האוטומטית כוללת את השלוש המשימות הראשונות. לאחר חיידקים מעובדות צלחות 96-היטב, תאים יוסרו על ידי צנטריפוגה (משימה 1) וכן סינון 96-היטב (משימה 2). לאחר מכן, סוכרי monomeric הנותרים מתקשורת הצמיחה יוסרו באמצעות סינון ג'ל 96-היטב (משימה 3). EPS המכיל דגימות מוערכים במשימה 4. טביעת האצבע של הפחמימה של פלטפורמת ההקרנה מכילה את שלוש המשימות האחרונות. התסנין הנותר של הלהיטים החיוביים ממשימה 2 מספק את הבסיס-תסנין ג'ל במשימה 5. לאחר hydrolyzation במשימה 6 טביעת אצבע הפחמימות ניתן לנתח באמצעות שיטת HT-PMP (תפוקה גבוהה 1-פניל-3-מתיל -5-pyrazolone, משימה 7). כל המשימות מלוות מודולים אנליטיים שונים ו / או שליטה צמיגה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ילדה = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 2
איור 2: הגדרת שולחן עבודת רובוט עבור פלטפורמת הקרנת פריסות של שני שולחנות העבודה, רובוט לטיפול הנוזלי מוצגות:. (א) מערכת טיפול נוזל רובוטית ו (ב) תחנת טיפול נוזל. (א) ההתקנה כוללת נשאית microplate עם שתי עמדות (עמדות 1-1 1-2), כנשא טיפים חד פעמיים עם ארבע עמדות (עמדות 2-1 2-4) ושלושה ספקים microplate עם ארבע עמדות כל (עמדות 3-1 ל 3-4, 4-1 4-4 ו 5-1 כדי 5-4). בנוסף, יש קרוסלה אחסון עם חמישה נשאים מלון (1 עד 5) כל שבע צלחות באר עמוקה (DWP) וארבעה נושאי מלון (6-9) עבור כל 21 מיקרו-כייל-הצלחות. החומרה המותקנת על רובוט טיפול הנוזל היא 96 ערוצי פיפטה הזרוע לשימוש עם טיפים חד פעמים מניפולטור רובוטי (RM) שזז צלחות / ציוד between שולחן העבודה, קרוסלת האחסון, MTP-הקורא, בצנטריפוגה ואת-החממה הרועדת. (ב) תחנת טיפול הנוזל מצוידת בזרוע טיפול נוזלת פיפטה 8 ערוצים 300 μl, מיכל פסולת במיקום 1, מתאם קצה עם 300 טיפי μl (מיקום 2), מתאם גובה 30 עם 250 מיליליטר שוקת (מיקום 3) וחמישה גובה מתאם 60 עבור MTPs (מיקום 4 עד 8). המספור של העמדות מכונה בכל פרוטוקול זה. שולחנות עבודה אלטרנטיביים יכולים לשמש גם אם יש setups המקבילה זמינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: תוכן פירובט של 16 פולימרים זמינים מסחרית נקבע באמצעות פירובט-assay. לאחר פתרון פולימר 1 גר '/ להים היה הידרוליזה ונטרל, את assay פירובט בוצע מן דילול 1:10 (n = 3). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: תרשים זרימה של פלטפורמת הקרנת תפוקה גבוהה מודולרי. מערכת הסינון האוטומטית, משלב מודולים זיהוי פוליסכריד שונים: הניתוח של היווצרות צמיגה, לייצור פולימרים ונחישות של תכולת הפחמימות הכוללת. החלק השני מספק ניתוח monosaccharide מפורט לכל מפיקי EPS שנבחרו מזוהים בחלק הראשון. כל הנתונים מההקרנה האוטומטית נתוני טביעות אצבע הפחמימות באמצעות UHPLC-ESI-MS נאספים במסד נתונים ולאפשר זיהוי הפשוט של וריאנטים הקשורים המבני של ALReady ידוע EPS או EPS רומן ולכן, הקרנה ממוקדת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

צעד ראשי / מודול אנליטית Workflow תצפית / תיאור
טיפוח של זנים 1 מ"ל EPS-בינוני
טרום תרבות 48 שעות, 30 ° C, סל"ד 1,000
48 hr-התרבות ראשית, 30 ° C, סל"ד 1,000 		הפקה של EPS
Cell הסרה / צמיגות צנטריפוגה: 30 דקות ב 4,300 XG אין גלולה = צמיגות מוגברת = חיובי
איתור של פולימרים: רטיבות 50 μl supernatant + 150 ב 2-propanol μl
טלטול 10 דקות ב RT ו- b סל"ד 900 		חזותיים: סיבים ופתיתים = ממטרים חיוביים של פולימר
Cell הסרה / צמיגות גבוהה 180 supernatant μl של התרבות הראשית
צנטריפוגה: 10 דק 'ב -3,000 XG
1.0 מיקרומטר קרום סיבי זכוכית 		לא חולף מסנן = צמיגות גבוהה = חיובי
איתור של פולימרים: רטיבות 50 μl תסנין + 150 μl 2-propanol ב
טלטול 10 דקות ב RT ו- b סל"ד 900 		חזותיים: סיבים ופתיתים = ממטרים חיוביים של פולימר
צריכת גלוקוז:
גלוקוז-assay 		דילול 1: 100:
10 μl תסנין + 990 μl DDH 2 O
50 μl aliquot + 50 μl reagאף אוזן גרון-mix
דגירה 30 דק 'ב 30 ° C 150 סל"ד
מדידת 418-480 ננומטר 		הנותרים הגלוקוז לאחר הטיפוח
ג'ל סינון איזון:
3 x 150 μl NH 4 -acetat חיץ pH 5.6
2 x 2 דקות XG ב 2000
1 x 2 דקות XG ב 1000
ג'ל סינון:
35 תסנין μl, 2 דקות XG ב 1000
כְּבָסִים:
3 x 150 μl DDH 2 O, 2 דקות XG ב 2000
75 μl 20% אתנול לאחסון 		טיהור פולימר:
הסרת מלחים, פירובט, גלוקוזה מונומרים סוכר אחרים מהעמוד supernatant טיפוח
הגלוקוז שנותר לאחר סינון ג'ל
גלוקוז-assay 		דילול 1:10:
25 μl DDH 2 O +
20 μl DDH 2 O ו -5 μl תסנין
+ 50 μl לערבב מגיב
מדידת 418-480 ננומטר 		חיסור של גלוקוז הנותרת לאחר סינון ג'ל משיטת פנול-גופרתית חומצה
שווה ערך גלוקוז:
ג שיטת פנול-גופרתי חומצה 		20 μl ג'ל-תסנין + 180 μl פנול-חומצה גופרתית (30 μl 5% (w / v) פנול DDH 2 O + 150 μl קונצרט כלשהו. H 2 SO 4 (ρ = 1.84 גר '/ מ"ל))
טלטול 5 דקות ב 900 סל"ד
דגירה 35 דקות ב 80 מעלות צלזיוס
מדידה ב 480 ננומטר 		שווה ערך גלוקוז:
Δ (פנול-גופרתי חומצת ערך - גלוקוז הנותרת לאחר סינון ג'ל)
<300 מ"ג / L שלילית
> 300 <700 מ"ג / L המשוערת חיובית
> 700 mg / L חיובי
יטפל באופן ידני בתנאים סטריליים (זרימה למינרית).
ב טיפל באופן ידני תחת במנדף.
ג פנול-גופרתית חומצה מטופלים עם מותג נוזלי טיפול תחנת (LHS) מתחת למכסה המנוע קטר.

טבלת 1:. עבודה שלמה של prescreening האוטומטית עם מערכת טיפול נוזל רובוטית ותחנת טיפול נוזל סקירה של כל הפרמטרים עבור מודולים אנליטיים אוטומטיים.

ליניאריות לוד LOQ
r² מדרון לקזז מ"ג / L מ"ג / L
.9998 .0007 -0.021 50 100
תֶקֶן ממוצע ב ב Precision ב דיוק
מ"ג / L מ"ג / L קו"ח% הטיה (שגיאה%)
5,000 5,112 1.8 2.2
250 265 5.3 6.1
ממוצע של שמונה מדידות, כיול עם גלוקוז שש רמות של 0.1 ל- 5 גרם / L
ב נערך עם מבחן t (α = 0.05; n = 8).
לוד: הגבלת מספר הנחישות, LOQ: הגבלת מספר כימות, CV: מקדם שונה.

טבלה 2:אימות של שיטת פנול-גופרתי החומצה בוצעה עם תחנת טיפול הנוזל. הליניאריות חושבה על בסיס כיול שש נקודות (n = 8). Mean, דיוק ודיוק של שני ריכוזי גלוקוז נבחר exemplarily מקבלים כאן.

ליניאריות LOQ
r² מדרון לקזז מיקרומטר
ללא מטריקס .99999 .0223 -.0019 1
מטריקס 01:10 מדולל .99999 .0221 -.0011 1
תֶקֶן ממוצע ב ב Precision ב דיוק
מיקרומטר מיקרומטר קו"ח% הטיה (שגיאה%)
ללא מטריקס 50 49.96 3.05 -0.09
1 1.04 2.95 3.86
מטריקס 01:10 מדולל 50 49.98 0.44 -0.04
1 1.00 4.58 0.33
ממוצע של שלוש מדידות, כיול עם שישה ריכוזים של פירובט בין 1 ל 50 מיקרומטר.
ב (n = 3)
LOQ: הגבלת מספר כימות, CV: מקדם שונה.

טבלה 3:. תיקוף-assay פירובט עם ובלי trifluoroacetic-חומצה-מטריקס 01:10 המדולל לנטרל שניים שישה כיולים נקודים (n = 3) עם ובלי הערכה של שפעות מטריקס בוצעה. Mean, דיוק ודיוק של שני ריכוזים פירובט נבחר exemplarily עם ובלי תופעות של דילול 1:10 חושבו.

טבלה 4
לוח 4:.. תוצאות של שלושה זנים למופת הוקרנו עם פלטפורמת נתונים שנאספו מההקרנה האוטומטית ואת טביעת אצבע הפחמימות אנא גללקק כאן כדי להוריד את הטבלה כקובץ אקסל של מיקרוסופט.

פַּחמֵימָה מקסימום קליט ​​[nm] קליטה ב 480 ננומטר ממוצע ± סטיית תקן ביחס ספיגת גלוקוז [%]
מסטיק Diutan 470 .342 ± 0.010 187
מסטיק Gellan 472 .334 ± 0.002 183
מסטיק גואר 478 .387 ± 0.017 212
Gummi ערבית 476 .393 ± 0.034 215
חומצה היאלורונית 484 .231 ± 0.011 126
מסטיק קראייה 478 .455 ± 0.023 249
מסטיק konjac 480 .297 ± 0.009 163
מסטיק לארץ ' 480 .337 ± 0.032 185
מסטיק שעועית ארבה 478 0.354 ± 0.033 194
Scleroglucan 484 0.168 ± 0010 92
Succinoglycan 482 0.168 ± 0.005 92
טארה מסטיק 480 .318 ± 0.016 174
tragacanth 478 .513 ± 0.003 281
מסטיק Welan 472 .226 ± 0.016 124
xylan 472 .567 ± 0.007 311
קסנטן 482 0.245 ± 0.021 134
גלוקוז 484 .191 ± 0.014 100
SD: סטיית התקן

לוח 5:. תוצאות כפי שמתקבלים בשיטת פנול-גופרתי חומצה במשך 16 פולימרים זמינים מסחרי וגלוקוז המקסימום הקליט והספיג ב 480 ננומטר של 16 פולימרים זמינים מסחרי (1 גר '/ ל) וכן גלוקוז (1 גר' / ל ) נמדדו יישום השיטה גופרתי חומצה-פנול. קרוב המשפחה ספיגת גלוקוז של כל פולימרים חושבה.

תֶקֶן מְמוּצָע p> דיוק דיוק
מ"ג / L מ"ג / L קו"ח% הטיה (שגיאה%)
דילול 1:10 450 460 1.01 2.14
45 44.7 1.41 -0.70
דילול של 1: 100 4,500 5026 1.19 11.6
450 471 1.16 4.55
ב נערך עם מבחן t (α = 0.05; n = 8).
קורות חיים: מקדם שונה.

גיל = "1"> לוח 6:. אימות של הדילול האוטומטי עבור-assay גלוקוז הדילול עבור גלוקוז-assay לאחר הטיפוח (1: 100) ואחרי סינון ג'ל (1:10) אושש. שני ריכוזי הגלוקוז (n = 8) דוללו באמצעות מערכת טיפול נוזל ומוערך. דיוק ודיוק Mean, חושבו.

ערך גלוקוז תיאורטית מכוסה מחצלת כובע סיליקון מבחן של אידוי (חשף)
מתכוון דיוק דיוק מתכוון דיוק דיוק a </ Strong> אידוי
מ"ג / L מ"ג / L קו"ח % הטיה (שגיאה%) מ"ג / L קו"ח % הטיה (שגיאה%) %שְׁגִיאָה
45.0 45.2 0.69 0.44 46.0 0.66 2.05 1.60
18.0 17.7 0.80 -1.68 18.0 0.72 -0.01 1.69
9.0 8.74 1.20 -2.98 8.92 0.81 -0.95 2.09
4.5 4.50 1.26 -0.04 4.58 1.57 1.76 1.80
1.8 1.85 0.74 2.90 2.01 2.82 11.6 8.48
0.9 1.03 1.43 14.1 1.16 3.52 28.3 12.4
(n = 4)
קורות חיים: מקדם שונה.

לוח 7:. בכדי להעריך את השפעתו של אידוי וכיסו אותו, ושוב MTP שישה תקנים גלוקוז שונים (n = 4) אוחסנו קרוסלה עבור 3.5 שעות בטמפרטורת החדר. השפעת האידוי הוערכה באמצעות חשף וכן מכוסה (מחצלת סיליקון) ודגימות תקניות. Mean, דיוק, דיוק ואת האידוי בטעות% חושבו.

לפני ג'ל-סינון <td> 25.1
לאחר סינון ג'ל הגלוקוז שנותר לאחר סינון ג'ל
מתכוון SD מתכוון SD
מ"ג / L מ"ג / L מ"ג / L מ"ג / L %
1 8647 110 259 121 3.00
2 5108 56 116 37 2.27
3 2,014 12 50.8 14 2.52
4 1,015 12 8.1 2.47
5 510 4.9 12.8 4.3 2.51
6 223 8.6 6.6 1.5 2.94
7 122 5.6 4.3 0.9 3.48
8 75 6.0 3.1 0.3 4.18
(n = 8)
SD: סטיית התקן

לוח 8:. תוצאות של יעילות הג'ל סינון שמונה תקנים גלוקוז שונים נקבעו לפני ואחרי סינון ג'ל על מנת להעריך את היעילות של סינון ג'ל. ממוצע, סטיית התקן גלוקוז הנותרת לאחר סינון ג'ל% חושבו.

Discussion

זיהוי פוליסכריד עם שיטת פנול-הגופרתית חומצה: מונוסכרידים שונים להראות מקסימום קליט ​​שונה ומקדמי הכחדה טוחנים על ידי שימוש בשיטה זו 9. התוצאה היא מקסימום קליטה שונים של פולימרים, אשר מכילים סוכרים כמה בכמויות שונות. אורכי הגל השונים של מקסימום קליט ​​16 פולימרים שונים זמינים מסחרי מובאים בטבלה 5. הפולימרים היו מומסים (1 גר '/ ל) ב DDH 2 O, בחש (150 סל"ד) לילה ונמדד בשיטת פנול-גופרתי החומצה . מסטיק Diutan הראה לו את המקסימום הקליט הנמוך ביותר ב 470 ננומטר scleroglucan ו היאלורונית חומצה הגבוהה ביותר ב 484 ננומטר. בהתבסס על תוצאות אלו 480 ננומטר נבחר עבור פלטפורמת סינון זה. הספיגה היחסית של הפולימרים חושבה על הספיגה שהושגה עם גלוקוז 1 גר '/ ל (כפי שנקבע 100%). התוצאות הנמוכות ביותר התקבלו עם scleroglucan ו succinoglycan, הוא עם 92%. זה היה expected כי scleroglucan רק מכיל גלוקוז succinoglycan מכיל גלוקוז וגלקטוז על יחס של 7: 1. שני הפולימרים המסחריים יש הפסדים שונים של ייבוש ותכני אפר שונים, וזו הסיבה מדוע הערך התיאורטי של ~ 110% לא הושג. Xylan הראה את הספיגה היחסית הגבוהה ביותר עם 311%. הסיבה לכך היא מקדמת הכחדה הגבוהה הטוחנת שהושג קסילוז בשל בצורת furanose הדומיננטית יותר. ברמה של גלוקוז 0.1 גר '/ ל מגבלת כימות הושגה, כמו גם את גבול הגילוי בריכוז <0.05 g / L. עם זאת, את גבול הגילוי של זנים חיובים ההקרנה גבוהה מ 0.7 גר '/ ל ולכן, assay הראה ביצועים טובים. על מנת לקבל תוצאות אמינות, גלוקוז הנותרת לאחר סינון ג'ל נקבעה עם assay-גלוקוז וערך זה מפחית את ערך משיטת פנול-גופרתי החומצה.

דילול גלוקוז-assay אוטומטית: ביצועיםשל נחישות הגלוקוז לאחר הטיפוח (דילול 1: 100) נחקר. לשם כך, 10 μl של supernatant הועברו 990 μl של DDH 2 O בצלחת גם עמוק מעורבב באמצעות עשר פעמים aspirating מחלק 180 μl מתוך דילול זה. השלב הקריטי השני היה pipetting הנכון של רק 5 aliquot μl עבור 1:10 הדילול מן assay-גלוקוז לאחר סינון ג'ל. על מנת ליצור את הדילול של 25 μl של DDH 2 O הועברו עם טיפ μl-50 הראשון, לאחר מכן 20 μl של DDH 2 O ו -5 μl-תסנין ג'ל היו aspirated יחד. הדבר מבטיח הסרה טובה יותר של aliquot 5 μl מתוך הקצה. שני צעדים דילול אומתו לתקני גלוקוז שונים באמצעות assay-גלוקוז. התוצאות עבור שני ריכוזים למופת מובאות בטבלה 6 1:. דילול 100 לקביעת התוכן הגלוקוז לאחר הטיפוח הראה דיוק גבוה עבור הסטנדרטים הוא עם CV & #60; 1.2%. במקביל, את הדיוק של הסטנדרט הגבוה יותר היה עד 11.6 (שגיאת%). עם זאת, זה זניח מכיוון נחישות גלוקוז מייצגת רק את התוכן הגלוקוז שנותר לאחר טיפוח ולכן, הוא לא חשוב לצורך זיהוי הפולימר. דילול 1:10 עבור גלוקוז הנותרת לאחר סינון ג'ל הראה תוצאות אמינות מאוד עם CV <1.4% ועל דיוק <שגיאה 2.1%.

תמורה של אידוי: ההקרנה דורשת 3.5 שעות מהשלב הראשון ועד גלוקוז-assay הראשון. על מנת לברר, אם מסגרת זמן זו יש השפעה על אחסון MTP לא אטום, 50 μl של סטנדרטי כיול-assay גלוקוז אוחסנו עם ובלי כיסוי 3.5 שעות בקרוסלת הרובוט. בטווח הכיול (45 עד 4.5 מ"ג / L) ריכוז המדגם גדל בקושי. גידול - נגרם על ידי אידוי - היה מתחת 2.1% ורק לשני הריכוזים הנמוכים ביותר (1.8 ו -0.9 מ"ג / L) הוא הגיע עד 12.4% (

ג'ל סינון: כמויות גבוהות של גלוקוז שאינם מטבוליזם להפריע לגילוי כמותי של גלוקוז מן הפולימר הידרוליזה. לכן, צעד ג'ל-סינון נדרש להסיר את הגלוקוז שנותר לאחר טיפוח. בנוסף, סינון ג'ל מטהר הפולימר המכיל supernatant מלחי ותרכובות פחמימות monomeric, אחרים מאשר גלוקוז, כדי למזער את הרקע אנליטי בניתוח מונומר. בצעד ג'ל-סינון 35 μl של תסנין הוצב במרכז הבאר. עבור אימות על חוסנו של סינון ג'ל במערכת האוטומטית, שמונה סטנדרטי כיול 0.045 עד 9 גלוקוז g / L היו מסוננים (n = 8). גלוקוז של כל ריכוז תמיד הופחת על ידי יותר מ 95% מהשווי הראשוני (לוח 8). בעשותו כן, את סינון ג'ל הראה תוצאות טובות מאוד עבור ריכוזים שונים של גלוקוז. בנוסף, גלוקוז הנותרת לאחר ג'ל-filtration כן נקבע עם assay-גלוקוז ונוכה נחישות פנול-גופרתי חומצה לקבל את הסכום הנכון של שווה ערך גלוקוז עבור הפולימר הידרוליזה.

פירובט-assay: קודם כל, זה נחקר אם לנטרל ומדולל (1:10) TFA-מטריקס מהשלב הידרוליזה מפריע התגובה האנזימטית. לכן, assay המלא בוצע פעמים, פעם אחת עם ופעם אחת בלי מטריקס והראה תוצאות אמינות. לבסוף, התוכן פירובט של 16 פולימרים זמינים מסחרי נמדד בהצלחה מתוארת באיור 3. זה ידוע כי בדרך כלל מתוך 16 אלו פולימרים רק succinoglycan ו קסאנטן באופן טבעי מכיל פירובט. עם-assay פירובט שלנו הוא של פולימרים אלו זוהו כהלכה. בשנת scleroglucan, מסטיק welan ו פירובט xylan זוהה גם בכמויות משמעותיות. בסך הכל, את היכולת של הגישה הייתה תוקפת ואת ים assay-פירובטhowed בעל ביצועים גבוהים. זה הוכיח את עצמו מסוגל לזהות פירובט פולימרים שונים לאחר הידרוליזה.

טביעת אצבע פחמימות: לאחר ביצוע כל המודולים אנליטיות ההקרנה האוטומטית, יצרני EPS פוטנציאל נבחרו לניתוח טביעת אצבע פחמימות. לשם כך, מספר קריטריונים יושמו: 1) תצפית חיובית של צמיגות לאחר צנטריפוגה ו / או לאחר סינון. 2) רטיבות לפני ואחרי סינון. סיבים פתיתי נצפים הוערכו כחיובי. 3) שווה ערך גלוקוז משייטת פנול-גופרתי החומצה. ערכים> 700 mg / L דורגו חיובי וערכי בין 300 ל -700 מ"ג / ל 'דורג יצרני EPS המשוערת. כאשר שניים או שלושה קריטריונים הוערכו כחיובי, הזנים נבחרו לניתוח טביעת אצבע פחמימה נוסף. הקריטריונים יכולים להיות מותאמים אישית כלפי המטרה אישית לבן הקרנת EPS (למשל EPS צמיגות הנמוך). הגישה שלנו ולשם מציאת efficiאף אוזן גרון EPS מפיקה. כאשר מחפשים זנים שרק לייצר כמויות קטנות של EPS מגבלת ההערכה המקבילה גלוקוז צריכה להיות מופחתת.

יתרון טכני יישומים עתידיים: אחת תכונות מעניינות של פרוטוקול זה הוא הדמות המודולרי של צעדים ואת מודולים אנליטיים השונים. הם יכולים להיות משולבים בדרכים שונות, מותאם לדרישות פרט ומודולים רומן יכולים להיות מיושמים בקלות. יתר על כן, מודולים אנליטיים יכול לשמש בנפרד, למשל מודול הידרוליזה בשילוב עם מודול HT-PMP-derivatization הוא מסוגל לבצע ניתוח הרכב monomeric מפתרונות פולימר שונים (1 גר '/ ל') בפורמט 96-היטב. למעבדות מבלי גישה למערכת טיפול נוזל ההקרנה המלאה ניתן לטפל באופן ידני ללא כל תיקונים בתכנית pipetting. עם זאת, באמצעות מערכת טיפול נוזל מגביר את התפוקה של עד 768 זנים (במקום 192 זנים אם Screeneד ידני) ליום. הפרוטוקול מתואר כאן הוא מסוגל הקרנה עבור סוגים שונים ולכן, עבור הקרנת אוספי זן גדולים לזהות מפיקי EPS הרומן ולנתח טביעות אצבע הפחמימות שלהם בגישה אחד (איור 4). יתר על כן, הקרנה ממוקדת עבור סוכרים המכילים סוכרים נדירים כמו פוקוז, חומצות uronic או אפילו סוכרים ידועים יכולה להתבצע באמצעות ניתוח monosaccharide המפורט. כמו כן, שילובי סוכר שונים ביחסים מוגדרים ניתן לאתר. זה מאפשר זיהוי פשוט של וריאנטים הקשורים מבנית של EPS ידוע כבר או EPS הרומן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well deep well plate 2.0 ml (DWP) Greiner Bio-One 780271 Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990 µl of ddH2O
Breathable Sealing Film Axygen BF-400-S Incubation film for pre- and main-culture DWP
Aluminum Sealing Film Axygen PCR-AS-200 -80 °C storage film for glycerol-stock plates
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl TECAN 30038619 Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)
A/B glass-filter-plate 1 µm Pall Corporation PN 8031 Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well micro titer plate V-Bottom Greiner Bio-One 651201 Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well SpinColumn G-25 Harvard Apparatus 74-5612 Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)
96-well micro titer plate V-Bottom Nunc 249944 Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips TECAN 30038609 Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)
Trough 250 ml Axygen Res-SW96-HP Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetate buffer pH 5.6 (CP 5-7)
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP) Greiner Bio-One 655101 precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)
96-well silicon cap mat  Whatmann 7704-0105 Cover mat for MTP
200 µl pipette tips Sarstedt 70.760.002 For manually handling
1,000 µl pipette tips Sarstedt 70.762 For manually handling
96-well-PCR micro titer plate  Brand 781350 Hydrolysis, PMP-derivatisation
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat  Brand 781405 Hydrolysis, PMP-derivatisation
Filter plate 0.2 µm Supor Pall Corporation PN 8019 Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate
Pipette Tips LHS 5-300 µl Brand 732150 Brand LHS system
Glucose oxidase  Sigma-Aldrich G2133 Glucose-assay
Horseradish peroxidase  Sigma-Aldrich P6782 Glucose-assay, pyruvat-assay
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt) Wako Chemicals GmbH 043-22351 Pyruvat-assay
Pyruvate oxidase  Sigma-Aldrich P4591 Pyruvat-assay
Potassium phosphate dibasic Carl-Roth P749.3 Pyruvat- and glucose-assay
Potassium phosphate monobasic Carl-Roth 3904.3 Pyruvat- and glucose-assay
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754 Pyruvat-assay
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 31413 Pyruvat-assay
2-Propanol VWR 20922.466 Precipitation
Phenol VWR 20599.231 Phenol-sulfuric-acid method
Sulfuric acid Carl-Roth 4623.4 Phenol-sulfuric-acid method
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508 Hydrolysis
Ammonium solution Carl-Roth P093.1 Hydrolysis, PMP-derivatization
Ethanol absolut VWR 20821.321 Hydrolysis, PMP-derivatization
Phenol red  Alfa Aesar B21710 Hydrolysis, PMP-derivatization
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone Sigma-Aldrich M70800 PMP-derivatization
Methanol LC-MS VWR 83638.320 PMP-derivatization
Acetonitril LC-MS VWR 83040.320 PMP-derivatization
Acetic acid Sigma-Aldrich 338826 PMP-derivatization
Ethanol absolut VWR 20821.321 PMP-derivatization
Methyl red Alfa Aesar 36667 pH-value
Robotic liquid handling system  Tecan Freedom EVO Worktable setup in Figure 2
Liquid handling station LHS Brand 709400 Worktable setup in Figure 2
Tip-Adapter Brand 709434 Worktable setup in Figure 2
Liquid Ends MC 20-300 µl Brand 709416 Worktable setup in Figure 2
Adapter 60 mm Brand 709430 Worktable setup in Figure 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Milani, J., Maleki, G. Ch. 2, Hydrocolloids in Food Industry. Food Industrial Processes - Methods and Equipment. Valdez, B. 2, InTech. (2012).
  2. Thibodeau, A. Protecting the skin from environmental stresses with an exopolysaccharide formulation. Cosmet Toiletries. 120 (12), 81-90 (2005).
  3. Prajapati, V. D., Jani, G. K., Zala, B. S., Khutliwala, T. A. An insight into the emerging exopolysaccharide gellan gum as a novel polymer. Carbohydr Polym. 93 (2), 670-678 (2013).
  4. Schmidt, W., Brouwers, H. J. H., Kuehne, H. C., Meng, B. The working mechanism of starch and diutan gum in cementitious and limestone dispersions in presence of polycarboxylate ether superplasticizers. Appl. Rheol. 23 (5), 52903 (2013).
  5. Srinivasan, R. Natural Polysaccharides as Treatment Agents for Wastewater. Green Materials for Sustainable Water Remediation and Treatment. , The Royal Society of Chemistry. 51-81 (2013).
  6. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. High throughput exopolysaccharide screening platform: From strain cultivation to monosaccharide composition and carbohydrate fingerprinting in one day. Carbohydr Polym. 122, 212-220 (2015).
  7. Ortega-Morales, B. O., et al. Characterization of extracellular polymers synthesized by tropical intertidal biofilm bacteria. J Appl Microbiol. 102 (1), 254-264 (2007).
  8. Xu, R., Ma, S., Wang, Y., Liu, L., Li, P. Screening identification and statistic optimization of a novel exopolysaccharide producing Lactobacillus paracasei HCT. Afr. J. Microbiol. Res. 4 (9), 783-795 (2010).
  9. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28 (3), 350-356 (1956).
  10. Masuko, T., et al. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).
  11. Geater, C. W., Fehr, W. R., Wilson, L. A., Robyt, J. F. A more rapid method of total sugar analysis for soybean seed. Crop Sci. 41 (1), 250-252 (2001).
  12. Sutherland, I. W. Ch 16, Microbial Exopolysaccharides. Polysaccharides Structural Diversity and Functional Versatility. Dumitriu, S. , Marcel Dekker. 431-457 (2005).
  13. Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances?. Microbial extracellular polymeric substances: characterization, structure and function. Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. , Springer. 258 (1999).
  14. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Fast carbohydrate analysis via liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection in 96-well format. J. Chromatogr. A. 1350, 44-50 (2014).

Tags

רפואה גיליון 110 Exopolysaccharide אוטומטית מודולרית הקרנה פלטפורמה תפוקה גבוהה סוגים שונים טביעת אצבע פחמימות.
פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rühmann, B., Schmid, J.,… More

Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis. J. Vis. Exp. (110), e53249, doi:10.3791/53249 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter