Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Автоматизированная модульная Высокая пропускная способность экзополисахарида Скрининг платформа В сочетании с высокочувствительными анализа Углеводы отпечатков пальцев

Published: April 11, 2016 doi: 10.3791/53249
Automatic Translation
1, 1, 1
1Chair of Chemistry of Biogenic Resources, Technische Universität München

Abstract

Многие микроорганизмы способны производить и секретировать экзополисахариды (EPS), которые имеют важное значение в областях медицины, пищевой промышленности или в замене нефтегосударств на основе химических веществ. Опишем аналитическую платформу быть автоматизированы в системе обработки жидкости, что позволяет быстрый и надежный анализ вида и количества EPS, продуцируемых микроорганизмами. Это позволяет пользователю идентифицировать новые природные микробные производителей экзополисахарида и анализировать углеводный отпечаток соответствующих полимеров в течение одного дня в высокой пропускной способностью (HT). Используя эту платформу, коллекции штаммов, а также библиотеки вариантов деформаций, которые могут быть получены в инженерных подходов могут быть подвергнуты скринингу. Платформа имеет модульную установку, которая позволяет разделение протокола на две основные части. Во-первых, представляет собой автоматизированную систему скрининга, которая сочетает в себе различные модули обнаружения полисахарид: полуколичественный анализ viscositформирование у через стадии центрифугирования, анализ образования полимера путем осаждения спирта и определения общего содержания углеводов через фенол-сернокислотный трансформации. Здесь можно экранировать до 384 штаммов в перспективе. Во второй части дается подробный моносахаридную анализ для всех выбранных производителей EPS, указанных в первой части, объединив два основных модулей: анализ полного состава мономера с помощью ультра-высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с ультра-фиолетовых и электрораспылением ионизации обнаружения ионной ловушкой ( UHPLC-УФ-ESI-МС) и определение пирувата в качестве полимерного заместителя (наличие пирувата кеталь) путем окисления ферментативной, который связан с образованием цвета. Все аналитические модули этой скрининговой платформы могут быть объединены различными способами и регулировать с индивидуальными потребностями. Кроме того, все они могут быть обработаны вручную или выполнены с помощью системы обработки жидкости. Таким образом, скрининг PLAТГогт обеспечивает огромную гибкость для того, чтобы идентифицировать различные EPS.

Introduction

Микробные экзополисахариды (EPS) являются структурно весьма разнородную группу полимеров, которые выполняют различные биологические функции. Как правило, они построены из сложных повторяющихся единиц, которые отличаются различными типами мономеров (сахар, производные сахара, сахарные кислоты), связей между этими мономеров и их замен. Структурное разнообразие микробных полисахаридов придает весьма различные характеристики для членов этого класса молекул, что позволяет их применение в различных областях , таких как пища 1, косметика 2,3, строительная химия 4 или 5 обработки воды. В целях дальнейшего расширения сферы применения этих биооснове и таких устойчивых полимеров идентификация новых природных микробных полисахаридов, а также проектирование структурных вариантов представляет перспективные подходы. В любом случае, метод быстрого скрининга требуется быстро сканировать огромное количество штаммов микроорганизмов для Theiг образование полисахарид, и анализировать их продукцию. Поэтому в последнее время мы разработали 96-луночного платформу HT-скрининга для анализа микробного производства полисахарида из природных изолятов или сконструированных вариантов штамма , который включает в себя идентификацию мономерной композиции 6.

Применяя эту платформу для первого раунда скрининга ~ 500 природных изолятов позволило нам определить только приблизительно от 10 до 20% выделенных штаммов, как возможность получения EPS (данные не показаны). Это означает, что 80-90% анализируемых штаммов не производят EPS при условиях, применяемых, и, следовательно, дальнейший анализ подробного углеводного отпечатка пальца не было необходимости. Поскольку это весьма сложной идентификации мономерной композиции является трудоемким процессом, особенно для анализа данных, быстрый метод предварительного скрининга для выявления штаммов положительные в производстве EPS, приведет к резкому повышению эффективности. Кроме того, реагенты,расходные материалы и время измерения на UHPLC-UV-ESI-MS будет сокращено. Кроме того, различные аналитические модули, в то время как, с одной стороны делают метод высоконадежного, находятся с другой стороны, осложнившей ручную обработку более чем двух 96-луночных планшетах параллельно, и как таковой ограничивает потенциал этого метода. По этим причинам, мы решили разработать автоматизированную платформу скрининга. Таким образом, мы объединили модульный формат существующей методики углевод отпечатков пальцев с полностью автоматизированным способом быстрого обнаружения общего содержания сахаров, основанный на измерении оптической плотности.

Фенол-сернокислотный метод до сих пор представляет собой метод выбора для быстрого определения общего содержания углеводов в бактериальных и растительных полисахаридов 7,8. Этот метод был впервые описан Дюбуа и др. 9 и адаптированный для различных применений и размеров выборки, даже при малых масштабах в 96-луночные планшеты 10,11. фенилаланинанол-сернокислотный метод измеряет общее содержание углеводов по одному значению, Суммирование все мономерные, олигомерные и полимерные углеводы образцов.

Исходя из этих аспектов во внимание, выбор подходящей питательной среды имеет важное значение для применения этого метода. Сложные носители, содержащие олигомерные или полимерные углеводные соединения, как дрожжевой экстракт может привести к измененному содержание полимера и, следовательно, строго следует избегать. Кроме того, высокое количество сахара используют в качестве источника углерода для культивирования штаммов. Высокий уровень оставшихся углеводов из процесса культивирования может негативно влиять на измерения содержания EPS.

Таким образом, использование определенных и чистого сахара рекомендуется. В наших экспериментах мы использовали глюкозу для выращивания клеток. Оставшийся глюкозы после культивирования была снижена с помощью гель-фильтрации и определяли с помощью глюкозо-анализа. И, наконец, эквивалентная глюкозас полисахаридов рассчитывали путем вычитания оставшегося уровня глюкозы после гель-фильтрации от общего содержания углеводов, которые были обнаружены с фенолом-сернокислотный метод. Гель-фильтрацию и глюкозо-анализ в сочетании с фенол-сернокислотного метода обеспечивают надежные результаты и способны быть наш первый, полностью автоматизированная система обнаружения.

Две новые аналитические модули были включены в автоматизированную скринингового платформу для увеличения количества информации, полученной от системы EPS-обнаружения: осаждение и наблюдение за увеличения вязкости.

Много различных EPS - например , сукциногликан, ксантановая и ободочной кислота 12 - как сообщается, модифицированный неуглеводной пирувата кеталя на сахар позиции C4 и C6. Эти пирувата кетали (так же, как сукцинил полуэфиров и уроновых кислот) способствуют полианионная природе и, следовательно, к физическому Properties полимера, взаимодействуя с помощью двухвалентного катиона мостиков 13. Для того, чтобы определить те конкретные полимеры определение пирувата была создана в качестве еще одного дополнительного аналитического модуля. Это увеличивает информацию о полисахаридных заместителей и их потенциальных макроскопических свойств.

Объединение всех модулей позволяет идентифицировать различные EPS, а также быстрое и эффективное определение производителей EPS. К этому подходу экранирование платформа может быть разделена на две основные части (рисунок 1). В рамках автоматизированного скрининга (часть I) рабочий процесс происходит полностью автоматизированный (таблица 1) , чтобы быстро осуществить предварительный выбор САЭ штаммы. Анализ углеводного отпечатков пальцев (часть II) количественно определяет мономерный состав САЭ производства предварительно выбранных штаммов. Таким образом, анализ данных было сведено к минимуму с целью оптимизации скрининга больших коллекций деформации. Этапредлагает возможность анализировать 384 штаммов в одном автоматизированного скрининга перспективе и двумя отрезками, которые возможны в день 768 штаммов в день. Кроме того, анализ углеводов отпечатков пальцев дает еще более детальный обзор всех выявленных EPS. Это позволяет направленный анализ и определение лишь незначительно различающихся вариантов EPS или совершенно новых по сравнению с уже описанными химических структур EPS.

Protocol

1. Автоматизированная Скрининг

Примечание: Все жидкие шаги обработки выполняются с роботизированной системой обработки жидкости. Состав робота рабочей таблице представлена ​​на рисунке 2. Все расходные материалы хранятся в карусели для хранения, если не указано иное. Для всех автоматизированного скрининга шаги роботизированный манипулятор (RM) перемещает расходные материалы, (глубокий луночный планшет (ПРД); микро титр пластина (МТР), полимеразной цепной реакции пластины (ПЦР-пластины), и т.д.) между позициями карусельных (СР ) и Worktable позиции (WTP). Все шаги пипеток выполняются с 96-канальным-пипеткой-руки, за исключением случаев, если оно указано иное. Все этапы программируются и выполняются автоматически в формате 96-луночного.

  1. Штамм Культивирование (Задача 1 на рисунке 1)
    Примечание: Ручка инокуляции предполагаемыми EPS штаммы, продуцирующие и герметизацию Культивирование пластин в стерильных условиях (ламинарного потока). автоматизированнаябыстрый скрининг может обрабатывать четыре 96-луночных планшетов за раз. Различные штаммы нескольких родов уже были испытаны 6.
    1. Вручную инокуляции предварительной культуры (1 мл ЭПС-носитель в ДПР) с 96-контактным репликатора 96-луночного глицерине планшете. Закройте планшет с воздухопроницаемой уплотнительной пленкой, чтобы избежать испарения и позволить аэрации. Инкубируют при 30 ° С в течение 48 ч при 1000 оборотах в минуту на MTP-качалке.
    2. Привить основной-культуры (990 мкл EPS-носителя в ДПР) путем передачи 10 мкл предварительной культуры с использованием 50 мкл 12-канальный мульти-пипеткой и инкубировать при тех же условиях, что и предварительной культуры. Примите к сведению все штаммы, которые не растут.
  2. Подготовка робота Worktable и Storage Carousel
    1. Обеспечить все расходные материалы, перечисленные в материалах и оборудовании в правильное положение в карусели хранения. Добавить 990 мкл бидистиллированной воды (DDH 2 O) в каждую лунку ПРД для 1: 100 разбавлении для гое глюкозо-анализа (положение карусельного 4-1 4-4).
    2. Устройте 250 мл корыто , содержащий 150 мл DDH 2 O в Worktable положении (WTP) 11.
    3. Депозит объемом 250 мл корыто, содержащую 50 мл глюкозо-анализа для реагентов смесь (4 мл 500 мМ фосфат калия (рН 5,7), 1,5 мл 50 мМ 2,2-azinobis- (3ethylbenzthiazoline) -6-сульфоновой кислоты, 2 мл 100 U-оксидазы глюкозы, 10 мкл 1000 U пероксидаза хрена и 42,49 мл DDH 2 O) в положении WTP 1-2.
    4. Поместите две пустые фиктивные F-нижний MTPS в положении WTP 3-1 и 3-2.
    5. Удалите дышащий герметизирующей пленки, выделяют основные-культуры в позициях карусельных (КП) 1-1 до 1-4 и запустить автоматизированную роботизированную программу.
  3. Уравновешивание Гель-фильтровальных плит
    Примечание: фильтрующие пластины геля, которые используются во время этой проверки могут быть использованы повторно. Для этого, моют и центрифужные трижды , каждый раз 150 мкл DDH 2 O при 2000 х г в течение 2 мин при температуре 20 ° С. Затем, хранят при температуре 4° C с 75 мкл 20% этанола и накрыть крышкой кремния мат.
    1. Перемещение 250 мл корыто (CP 5-7) с 5 мМ ацетата аммония буфера (рН 5,6) до WTP 3-3.
    2. Перенесите гель-фильтрационные пластины (CP 1-6, 1-7, 2-6 и 2-7) от карусели к WTPs 4-1 4-4.
    3. Отберите по 150 мкл буферного раствора ацетата аммония с использованием 200 мкл советов и разлить в центре всех гель-фильтрационных пластин для уравновешивания.
    4. Перенесите гель-фильтрационные пластины в центрифуге (2000 мкг в течение 2 мин при 20 ° C).
    5. Перенесите пластины обратно к рабочему столу, повторите шаги, 1.3.3, 1.3.4 и 1.3.3. Не повторить центрифугирование, чтобы избежать обезвоживания геля-фильтровальных плит. Храните уравновешенного гель-фильтрации пластин обратно в карусели.
  4. Удаление клеток с помощью центрифугировани (Задача 1 на рисунке 1)
    Примечание: Для того, чтобы обеспечить низкий фон в рамках скринингового подхода, анализа бесклеточныхEPS, содержащие только супернатанты и удаляют клетки с помощью центрифугирования после культивирования.
    1. Перенести основной культуре DWP от карусельного (от 1-1 до 1-4) в центрифугу (4,300 мкг в течение 30 мин при 20 ° C).
    2. Подготовьте рабочую таблицу с помощью РМ для обработки основной культуры.
      Примечание: Для шагов 1.4.2 1.4.3.5 система всегда обрабатывает две пластины параллельно, а затем повторяет все действия со следующими двумя пластинами.
      1. Для осаждения перед фильтрацией перемещения MTP из CP 6-1 и 6-2 WTP 4-1 и 5-1. Перемещение MTPS рН-индикатора от CP 7-1 и 7-2 к WTP 4-2 и 5-2.
      2. Перенести фильтрации пластину вместе с коллекторной пластиной из CP 2-1 и 2-2 к WTP 4-3 и 5-3. Перенесите основной культуре DWP 1-1 и 1-2 из центрифуги в ГУР 4-4 и 5-4.
      3. Подготовка аналитических модулей.
        Примечание: Возьмите 200 мкл советы от хранения наконечника (позиция 2-1 до 2-4). Для того чтобы уменьшить расходные материалы, использовать один и тот же наводку набор для шага 1.4.3.1.
        1. Перенести 180 мкл основного культурального супернатанта на фильтровальной пластине. Вытяжку 150 мкл из основного супернатанта культуры и обойтись 50 мкл в МТР для осаждения перед фильтрацией и 100 мкл к рН-индикаторной пластины.
          Примечание: рН-определение не является существенным; Тем не менее, после добавления 12,5 мл раствора метилового красного индикатора (50 мг в 50 мл этанола) в каждую лунку с многостадийным капают это указывает на то штаммы, высокие кислотопродуцирующего. Эта информация может быть полезна , чтобы избежать ингибирования роста (при низком рН) для дальнейшей культивации, например , для второго скрининга с более высокой концентрацией буфера. Кроме того, низкое значение рН может также вызвать EPS производства, с тем чтобы защитить клетки от кислой среды.
        2. Повторите шаг 1.4.3.1 для второй главной культуры пластины. Используйте свежий наводку набор.
        3. Перемещение фильтровальных плит в центрифугу и удалите все остальные пластины из стола обратно в исходное положение в carousэль.
        4. Повторите шаги 1.4.2.1 к 1.4.3.3 для третьей и четвертой пластины основного культуры.
        5. Примите к сведению эти ферментационных бульонов, которые показывают оседание уменьшилось после центрифугирования основной культуры пластин, когда они передаются обратно в (контроль вязкости) карусельного типа.
  5. 96-луночного фильтрации для полного удаления клеток (Задача 2 на рисунке 1)
    Примечание: Для того, чтобы обеспечить удаление клеток из вязкого ферментативного бульона стадию фильтрации, входит в скрининге.
    1. Центрифуга фильтрующие пластины при 3000 мкг в течение 10 мин при 20 ° С и вернуть их к их карусельного исходное положение.
    2. Готовят гель-фильтрационные пластины.
      1. Перемещение уравновешенной гель-фильтрации пластины от карусельного к центрифуге и спина при 1000 х г в течение 2 мин при температуре 20 ° С.
      2. Перенесите гель-фильтрации пластины из центрифуги в WTP 4-1 до 44 лет.
      3. Переместить свежий гель-фильтрация коллекторные пластины из CP (3-1 3-4) до ВОС (5-1 до 5-4).
      4. Перенесите уравновешенные гель-фильтрации пластин (WTP 4-1 4-4) к новым коллекторных пластин (5-1 до 5-4).
      5. Очистите рабочую таблицу, за исключением позиции 5-1 и 5-2 и переместить позицию 5-1 в положение 4-1.
    3. Подготовьте рабочую таблицу с помощью РМ для обработки фильтратов.
      Примечание: Для шагов 1.5.3 на 1.6.3.5 система обрабатывает две пластины параллельно и повторяет все шаги со следующими двумя пластинами.
      1. Перемещение по 50 мкл советы от карусельного (4-6 и 4-7) до ВОС 3-3 и 3-4.
      2. Передача фильтровальных плит из СР 3-1 до 3-2 на рабочий стол (4-4 и 5-4).
      3. Relocate ПРД (разведение 1: 100) для обнаружения потребления глюкозы из CP 4-1 и 4-2 до 4-2 и WTP 5-1.
      4. Переместить MTP для второго осаждения после фильтрации из CP 8-1 и 8-2 к WTP и 5-3 4-3.
      5. Поднимите фильтровальные пластины из пластины коллектораs (WTP 4-4 и 5-4) и переместить их в ВОС 3-1 и 3-2.
    4. Подготовить аналитические модули после фильтрации. Для того чтобы уменьшить расходные материалы, использовать один и тот же наводку набор для шагов 1.5.4.1 и 1.5.4.3.
      1. Принимать по 50 мкл и советы пипеткой 10 мкл аликвоты фильтрата ПРД (разведение 1: 100) для глюкозо-анализа (потребление глюкозы).
      2. Пипетка 35 мкл фильтрата до центра уравновешенной для гель-фильтрации пластины и 50 мкл к МТР, который используется для осаждения.
      3. Повторите шаги 1.5.4.1 для 1.5.4.2 для второй фильтрации пластины.
      4. Перенесите гель-фильтрации пластины в центрифугу и переместить все остальные пластины из стола обратно в исходное положение в карусели.
      5. Повторите шаги 1.5.3.1 для 1.5.4.4 для третьей и четвертой пластины фильтрации.
      6. После хранения всех пластин обратно в карусельного принимают к сведению высоковязких супернатантах, как указано невязок в фильтрующей пластине (высокая обУправление iscosity после стадии фильтрации). Отсутствие фильтрата может привести к ложным отрицательным результатам в следующих аналитических модулей.
  6. Удаление Глюкозу с помощью 96-луночного гель-фильтрации (задача 3 на рисунке 1)
    1. Центрифуга гель-фильтрационные пластины при 1000 х г в течение 2 мин при температуре 20 ° С.
    2. Подготовить рабочую таблицу с помощью роботизированного манипулятора для обработки гель-фильтратов.
      1. Обеспечить 50 мкл советы от карусельного (5-3 и 5-4) до ВОС 3-3 и 3-4.
      2. Для определения оставшегося уровня глюкозы крови после гель-фильтрации переместили два MTPS из CP 9-1 и 9-2 в WTP 4-1 и 5-1.
      3. Для фенол-сернокислотный методом перемещения двух MTPS из CP 8-5 и 8-6 к WTP 4-2 и 5-2.
      4. Передача двух гель-фильтрации пластины из центрифуги в ВОС (4-3 и 5-3).
      5. Поднимите гель-фильтрационные пластины из пластины коллектора (4-3 и 5-3) и переместить их в ГУР 3-1 и 3-2.
    3. Подготовить рабочую таблицу с помощью роботизированного манипулятора для обработки гель-фильтратов.
      Примечание: Для того, чтобы уменьшить расходные материалы, использовать тот же наконечник-набор для шагов 1.6.3.1 и 1.6.3.2.
      1. Для обнаружения оставшегося глюкозы после гель-фильтрации (разведение 1:10) принимают по 50 мкл советы и передать 25 мкл DDH 2 O (WTP 1-1) к новому МТР. Вытяжку 20 мкл DDH 2 O (WTP 1-1), 5 мкл воздуха и 5 мкл гель-фильтрата и разлить в той же пластине.
      2. Для фенол-серной кислотой методом пипеткой 20 мкл гель-фильтрата в MTP.
      3. Повторите шаги 1.6.3.1 и 1.6.3.2 для второй гель-фильтрат пластины.
      4. Перенесите все пластины из стола обратно в исходное положение в их каруселью.
      5. Повторите шаги 1.6.2.1 к 1.6.3.4 для третьей и четвертой пластины гель-фильтрации.
  7. Модули глюкозо-анализа
    1. Подготовить рабочую таблицу, чтобы выполнить глюкозу, как с помощью роботизированного манипуляторасказать.
      1. Перенесите ДПР (разведение 1: 100) от CP 4-1 и 4-4 к WTP 5-1 и 5-4.
      2. Перемещение всех MTPS из CP 9-5 и 9-8 к WTP 4-1 и 4-4.
      3. Возьмите 200 мкл советы и смешать разведение аспирационных и дозирования в десять раз больше объема 180 мкл. Затем пипеткой 50 мкл аликвоты в МТР.
      4. Повторите шаги 1.7.1.2 и 1.7.1.3 для всех четырех двухъямных потенциалов (разведение 1: 100).
      5. Удалите все двухъямных потенциалов (5-1 до 5-4) от стола.
    2. Подготовить рабочую таблицу, чтобы начать глюкозо-анализа.
      1. Для определения оставшегося глюкозы после переноса гель-фильтрации все MTPS от CP (9-1 9-4) до ВОС (5-1 до 5-4).
      2. Перемещение глюкозо-анализа калибровочной пластины - содержащие три раза 50 мкл следующих концентраций глюкозы (90, 45, 18, 9, 4,5, 1,8, 0,9, 0,45 и 0 мг / л) - от CP 9-9 до WTP 3- 3.
      3. Возьмите 200 мкл советы и аспирацию 50 мкл глюкозо-анализа реагента-смеси из WТП 1-2, чтобы начать первый анализ. Перемещение MTPS в инкубатор (30 ° C при 150 оборотах в минуту в течение 30 мин).
      4. Установите расписание для запуска программы с 5 мин задержки в между пластинами.
      5. Через 30 мин инкубации перемещения пластины из инкубатора в MTP-ридера и абсорбцию при 418 и 480 нм.
      6. После измерения перемещения пластины в исходное положение в карусели.
  8. Подготовка осадков
    Примечание: Для того, чтобы оценить производство EPS выполнить осаждение супернатанта с 2-пропанола до и после первой стадии фильтрации. Кроме того, оценить адсорбцию полимера на мембранном фильтре путем наблюдения волокон и хлопьев в первый, но не во втором осаждении.
    Внимание: Ручка 2-пропанола в качестве горючей жидкости строго под вытяжкой.
    1. Удалите все осадкам пластины (CP 6-1 6-4 и 8-1 к 8-4) с каруселью. И добавитьвручную 150 мкл 2-пропанола, в каждую лунку с 12,5 мл многоступенчатом пипеткой.
    2. Накройте все MTPS с силиконовой крышкой мата и встряхивают при комнатной температуре (RT) (10 мин при 900 оборотах в минуту). Визуально наблюдать волокна или чешуйчатый образований после встряхивания, которые указывают на производство EPS.
  9. Фенол-сернокислотный метод
    Внимание: Ручка концентрированной серной-кислоты и фенола под вытяжкой. Фенол является коррозионное и мутагенным агентом.
    1. Для фенол-сернокислотный метод, удалите пластины (CP 8-5 до 8-8) с каруселью и поместить их в жидкую систему обработки (положение 4 до 8). Включите калибровочную пластину с 20 мкл различных концентраций глюкозы (10, 5, 2,5, 1, 0,5; 0,25; 0,1; 0,05; 0 г / л) в трех повторностях.
    2. Поместите контейнер для отходов в положении 1, наконечник коробку 200 мкл при положении 2 и 250 мл корыто с 110 мл фенол-сернокислотный (свежеприготовленного на льду with18.3 мл фенола 5% (вес / объем) в DDH 2 O и 91,7 мл конц. Sulfuric кислоты) в положении 3.
    3. Используйте пипетку 8-канала с 300 мкл наконечниками и передать 180 мкл фенол-сернокислотный в каждом ряду всех пластин.
    4. Накройте все MTPS с крышками, смешать их с помощью встряхивания (5 мин при 900 оборотах в минуту, RT) и инкубировать их в течение 35 мин при 80 ° С в печи для цветной реакции. После охлаждения под вытяжкой, измерения поглощения при длине волны 480 нм.
  10. Выбор EPS Положительный супернатантов (Задача 4 на рисунке 1)
    1. Для оценки производства EPS, выберите те штаммы, от автоматизированного скрининга, которые по крайней мере два из трех критериев, как позитивов (контроля вязкости 2.6.1 и 2.6.2, обнаружение полимера 2.6.3, глюкоза эквивалента 2.6.5). Перенесите оставшиеся фильтратов из положительных ударов в новый MTP для дальнейшей обработки.
      Примечание: Когда пластины покрыты герметизирующей пленки алюминия они могут храниться при температуре -20 ° С в течение не менее одной недели. В это время determinaции углеводной отпечатка пальца должна быть выполнена.

2. Углеводы отпечатков пальцев

Примечание: Все шаги для углеводной отпечатка пальца вручную выполняется.

  1. Гель-фильтрация положительного супернатантов (задача 5 на рисунке 1)
    Примечание: гель-фильтрации необходимо, так как там не осталось от автоматизированного скрининга фильтрата. Гель-фильтрация с объемом более 35 мкл приводит к снижению эффективности очистки.
    1. Готовят уравновешивание гель-фильтрационных пластин путем дозирования 150 мкл буферного раствора ацетата аммония во все лунки с помощью 12,5 мл многоступенчатом пипеткой.
    2. Переносят гель-фильтрационной пластины в центрифуге (2000 мкг в течение 2 мин при 20 ° C).
    3. Повторите шаги 2.1.1, 2.1.2 и 2.1.1 снова. Центрифуга для гель-фильтрации пластины при 1000 х г в течение 2 мин при 20 ° С до дальнейшего использования.
    4. Пипетка 35 мкл фильтрата вцентр для гель-фильтрации с использованием пластины 12-канальную 50 мкл пипетку.
    5. Центрифуга для гель-фильтрации пластины при 1000 х г в течение 2 мин при 20 ° С, а затем поднять его с коллекторной пластиной.
    6. Подготовьте глюкозо-анализа перед гидролизом: Выполните разведение 1:10, добавляя 45 мкл DDH 2 O и 5 мкл гель-фильтрата с пипеткой мкл 12-канальный 50 и покрывают MTPS с силиконовой крышкой мат.
      Примечание: Для правильного определения значения глюкозы полимера, измеряют содержание глюкозы до гидролиза и вычесть его из содержания глюкозы после количественно стадии гидролиза.
    7. Подготовка пируват-анализа перед гидролизом: Выполните разведение 1:20 с помощью 12-канального 200 мкл пипетку , чтобы добавить 95 мкл DDH 2 O, передачи 5 мкл гель-фильтрата в каждую лунку и запечатать MTP с крышкой кремния коврик ,
  2. 96-луночные Микро Гидролиз (Задача 6 на рисунке 1)
    Примечание: Нагрейтеинкубирование печи (в том числе песчаную баню) до 121 ° С в течение по меньшей мере 1,5 ч перед использованием. Специальное устройство зажима был разработан, чтобы избежать испарения во время небольшой масштабируемого стадии гидролиза.
    1. Возьмите новую ПЦР-тарелку и передать 20 мкл гель-фильтрата с пипеткой мкл 12-канальный 50.
      Внимание: Трифторуксусная кислота является коррозионное кислота и токсичны. Аммоний раствор едкий. Ручка как химикаты только под вытяжкой.
    2. Добавьте 20 мкл 4 М трифторуксусной кислоты с 1,25 мл многоступенчатом пипеткой в ​​каждую лунку. Затем накрыть PCR-пластину с термопластичный эластомер (TPE) кап мата и поместите ПЦР-пластину в специальном устройстве зажима.
    3. Смешайте решения с помощью переворачивания зажимного устройства в десять раз. Поместите PCR-пластины в центрифуге и спина при 2000 мкг в течение 2 мин, чтобы собрать всю жидкость на дне. Поместите PCR-пластину обратно зажимного устройства и закрепить устройство с помощью винтов.
    4. ПоместитеОбеспеченный зажимное устройство в песчаную баню предварительно нагретую и инкубировать в течение 90 мин при температуре 121 ° С.
    5. Снимите зажимное устройство из песчаной бани и дайте ему остыть до комнатной температуры.
    6. Снять винты и спина снова в центрифуге при 2000 мкг в течение 2 мин, чтобы собрать все конденсат на дне лунки и для предотвращения перекрестного загрязнения при снятии колпачка мата.
    7. Добавить 3,2% раствор аммиака для доведения рН до прибл. 8 с помощью 12-канального 200 мкл пипетки. Накройте PCR-пластину с TPE крышкой циновки и поколебать его вручную с помощью зажимного устройства.
    8. После нейтрализации центрифугировать PCR-пластины при 2000 х г в течение 2 мин.
  3. Высокопроизводительный-1-фенил-3-метил-5-пиразолона (HT-ПМП) -derivatization карбогидратов (Задача 7 на рисунке 1)
    1. Передача 25 мкл нейтрализованного гидролизата в свежей ПЦР-пластины с использованием 12-канальный 50 мкл пипетки.
      Примечание: После взятия аликвоты, проверьте нейтрзация оставшейся жидкости в гидролизной пластине с помощью добавления 12,5 мкл фенола красный индикатор (0,05 г фенола красного в 5 мл 20% этанола) с 1,25 мл многоступенчатого пипетки. Все скважины, которые не превращаются в розовый цвет (рН 8) не правильно дериватизации.
    2. Добавить 75 мкл реагента дериватизации-смесь (125 мг PMP, 7 мл метанола, 3,06 мл DDH 2 O и 438 мкл 3,2% раствора аммония) и покрывают пластину с TPE крышкой мат.
    3. После встряхивания PCR-пластины в центрифуге зажимном приспособлении пластины при 2000 х г в течение 2 мин, чтобы аккумулировать всю жидкость в нижней части.
    4. Для дериватизации место ПЦР-пластины в ПЦР-амплификатор при 70 ° С в течение 100 мин с последующим охлаждением до 20 ° C.
    5. Передача 20 мкл аликвоты в новый MTP с помощью 12-канального 50 мкл пипетки. Затем с помощью 12-канального 200 мкл пипетки и добавляют 130 мкл 19,23 мМ уксусную кислоту (0,962 мл DDH 1 М уксусной кислоты + 49.038 мл 2 O) в каждой строке. Смешайте непосредственно через aspiratИнг и дозирования (минимум шесть раз) и передать всю жидкость в фильтр 0,2 мкм пластиной с МТР коллекторной пластиной.
    6. Центрифуга пластина (1000 мкг в течение 5 мин), снимите пластину фильтра, уплотнение MTP с силиконовой крышкой циновки и поместите MTP в UHPLC-UV-ESI-MS для определения углеводной отпечатка пальца 14.
  4. Приготовление глюкозо-анализа
    1. Выполните разведение 1:10 с помощью добавления 45 мкл DDH 2 O и 5 мкл нейтрализованного гидролизата с помощью пипетки мкл 12-канальный 50 и покрывают MTPS с силиконовой крышкой мат. Добавить в три раза по 50 мкл различных стандартов глюкозы (500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2,5 и 0 мкМ) в новый MTP, используемого для калибровки.
    2. Добавляют 50 мкл глюкозо-анализа реагента-микс (рецепт step1.2.3) с помощью пипетки мкл 12-канальный 50. Затем покрывал пластины с силиконовым колпачком мата и инкубировать при 30 ° С и 400 оборотах в минуту в течение 30 мин в качестве MTP-инкубаторе.
  5. Приготовление пируват-пробирного
    1. Выполните разведение 1:20 с помощью 12-канального 200 мкл пипетки. Добавьте 95 мкл DDH 2 O и передачи 5 мкл нейтрализованного гидролизата в каждую лунку. Накройте MTP с крышкой кремния мат.
    2. Добавьте 100 мкл пируват-пробирного реагента-смеси (3 мл 1 мМ N - (карбоксиметиламин-карбонил) -4.4'-бис (диметиламино) дифениламин натриевая соль (DA-64), 300 мкл 10 мМ тиаминпирофосфат, 60 мкл 100 мМ хлорида магния гексагидрата, 2,4 мл 500 мМ фосфата калия скалозуба (рН 5,7), 30 мкл 100 ед пируват - оксидазы, 12 мкл 1000 ед пероксидазу хрена и 24.19 мл DDH 2 O) с использованием 12-канального 200 мкл пипеткой.
    3. Покрывал пластины с кремниевой крышкой мат Aй инкубировать при 37 ° С и 150 оборотах в минуту в течение 30 мин. Непосредственно после инкубации меры оптической плотности в качестве MTP-ридер при 727 и 540 нм.
  6. Оценка всех результатов автоматизированного скрининга и углевод Fingerprints.
    1. Обратите внимание на те образцы, которые показывают, снизилась оседания после основной культуры пластины были центрифугировали и хранили обратно в карусели (этап 1.4.1 контроля вязкости). Образцы, которые не показывают образование гранул положительны (критерий 1 для автоматизированного скрининга).
    2. Обратите внимание на высоковязких супернатантах, которые указаны с помощью невязок в фильтровальной пластине после стадии фильтрации (этап 1.5.4.6 управления с высокой вязкостью). Отсутствие фильтрата может привести к ложному отрицательному результату в следующих аналитических модулей. Образцы, которые поддерживают культуральных супернатантов в фильтр-лунок являются положительными (также критерий 1 для автоматизированного скрининга).
    3. Визуально наблюдать волокна или чешуйчатый образование после инкубации. Делайте заметки, как гоесть указывает на полисахаридами. не со скоростью не осадков с (-); низкое осаждение волокон или хлопьев с (+) и большое количество осадков с (++). Кроме того, обнаружение адсорбции полимера на мембранном фильтре с помощью наблюдения волокон и хлопьев в первом, но не во втором осаждении (критерий 2 для автоматизированного скрининга).
    4. Вычисление линейной калибровки для вычисления концентрации глюкозы.
      Уравнение 1
      Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого уравнения.
    5. Выполнить линейную калибровку (поглощение над концентрацией) от 5 до 0,1 г / л глюкозы. Расчет эквивалента глюкозы гидролизованных полимеров и оценивают по следующим параметрам: эквивалент глюкозы:> 700 мг / л = положительный; 300-700 мг / л = предполагаемый положительный; <300 мг / л = негатив в отношении формата EPSиона (критерий 3 для автоматизированного скрининга).
      Уравнение 2
      Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого уравнения.
    6. Количественно все углеводы определяют методом HT-PMP. Суммируем все величины и оценить следующим образом:> 300 мг / л (положительный); 150-300 мг / л (мнимый положительный) и <150 мг / л (отрицательный).
    7. Для расчета концентрации пирувата выполняют линейную калибровку (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5 и 0 мкМ). Для того, чтобы исключить оставшуюся пирувата в надосадочной жидкости, скорректировать содержание пирувата после гидролиза через содержание пирувата перед гидролизом.
      Уравнение 3
      Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого equatиона.

Representative Results

Валидация фенол-сернокислотный метод показал хорошие результаты с коэффициентом детерминации (r²) от 0,9998 (таблица 2). Для 5 г / концентрации L коэффициент вариации (CV) и точности показал хорошую производительность с 1,8% и 2,2% погрешности, но ниже производительность для 0,25 г L стандарта с 5,3% (CV) и 6,1% ошибки / ( Уклон).

Коэффициенты определения обоих пируватными-анализа калибровочных кривых (с матрицей и без нее ) были> 0,9999 в калибровочном диапазоне 150 мкМ (таблица 3). Коэффициенты вариации (CV) для самого высокого и самого низкого уровня калибровки были <4,6%, а точность показала очень хорошую производительность во всем диапазоне калибровки с менее чем 3,9% погрешности. Таким образом, матрица из стадии гидролиза не показали никакого влияния на ферментативного количественного анализа, который, следовательно, способным к тезЮр пирувата до и после гидролиза.

В таблице 4 приведены подробные результаты трех образцовых новых штаммов , как успешно идентифицированных с экранирующим платформой. Левая часть таблицы показывает результаты автоматизированного скрининга модулей по формированию вязкости, производство полимеров и эквивалент глюкозы из общего гидролиза, которые были использованы в качестве параметров оценки для детального анализа углеводного отпечатков пальцев. Углевод отпечатка пальца основаны на калиброванных сахаров, а также неизвестных сахаров, димеры и заместители приведены в правой части таблицы. При использовании этой информации мономерный состав можно рассчитать и по сравнению с уже известными полимерными структурами. Кроме того, целевой скрининг для интересных мономерных композиций и редких углеводов может быть выполнена.

Высокая производительность микроШкала гидролиза и HT-PMP-дериватизации были продемонстрированы в нашей предыдущей работе 14. Кроме того, проверка гель-фильтрации и углеводной отпечатков пальцев для различных родов были описаны в другой публикации 6. В целом, экранирующий платформа с модульной структурой легко могут быть модифицированы и адаптированы к индивидуальным требованиям пользователя. Автоматизированный скрининг платформы дает возможность восемь раз более высокую пропускную способность и дает надежные результаты. Новые аналитические модули, такие как пируват-анализа могут быть интегрированы, и в сочетании с анализом углевод отпечатка пальца они обеспечивают очень подробную информацию о выявленных EPS. Таким образом, скрининг платформа имеет важное значение при поиске обоих слегка модифицированных и совершенно новых вариантов EPS.

Рисунок 1
Рисунок 1: Общая схема модульного чIGH пропускная способность экзополисахарида скрининга платформы. Автоматизированный скрининг включает в себя первые три задачи. После того, как бактерии культивировали в 96-луночных планшетах, клетки удаляют центрифугированием (задача 1) и фильтрации в 96-луночный (задача 2). Затем остальные мономерные сахара, получаемые из питательной среды, удаляются с помощью фильтрации гель 96-луночного (задача 3). САЭ, содержащие образцы оцениваются в задаче 4. Углеводы отпечатка пальца экранирующего платформы содержит последние три задачи. Оставшийся фильтрат положительных попаданий из задачи 2 обеспечивает основу для гель-фильтрата в задаче 5. После гидролиза в задаче 6 углеводный отпечатка пальца может быть проанализирована с помощью метода HT-PMP (с высокой пропускной способностью 1-фенил-3-метил -5-пиразолона, задача 7). Все задачи сопровождаются различными аналитическими модулями и / или контроля вязкости. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 2: Робот установка Worktable для скрининга платформы Макеты обеих жидких обработки столам робота показаны:. (A) роботизированная система обработки жидкости и обработки станции (B) жидкость. (А) Установка состоит из носителя для микропланшетов с двумя позициями (позиции 1-1 до 1-2), носитель для одноразовыми наконечниками с четырьмя позициями (позиции 2-1 до 2-4) и трех несущих микропланшета с четырьмя позициями друг (позиции 3-1 на 3-4, 4-1 и 4-4 5-1 5-4). Кроме того, существует карусельного для хранения с пятью носителями отель (1 до 5), каждый в течение семи глубоких луночных планшетах (ПРД) и четырех несущих гостиничных (6-9) каждый в течение 21 микро-титр пластин. Аппаратное обеспечение, установленное на жидкостной обработки робот представляет собой 96-канальный пипетка-кронштейн для использования с одноразовыми наконечниками и роботизированного манипулятора (RM), который перемещает плиты / оборудование betweeп Worktable, карусель хранения, МТР-ридер, центрифуга и встряхивая-инкубатор. (B) Жидкость обработки станция оснащена жидкостной обработки руку и 8-канальный 300 мкл пипетки, контейнер для отходов в положении 1, адаптер наконечника 300 мкл наконечников (позиция 2), высота адаптера 30 с 250 мл желоб (позиция 3) и пять высотой адаптер 60 для ССП (позиция 4 до 8). Нумерация позиций упоминается в данном протоколе. Альтернативные рабочие столы также могут быть использованы , если имеются эквивалентные расстановок доступны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Пируват содержание 16 коммерчески доступных полимеров , определяемых с помощью пируват-анализа. После / л раствора полимера 1 гs гидролизуют и нейтрализуют, пируват-анализ проводили из разведения 1:10 (п = 3). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Блок - схема модульного высокопроизводительного скрининга платформы. Автоматизированная система скрининга, который сочетает в себе различные модули обнаружения полисахарид: анализ формирования вязкости, производства полимеров и определения общего содержания углеводов. Во второй части дается подробный анализ моносахаридную для всех выбранных производителей EPS, указанных в первой части. Все данные с автоматизированного скрининга и данные от углеводной отпечатка пальца через UHPLC-ESI-MS собраны в базе данных и позволяют простую идентификацию структурно родственных вариантов ALREady известный EPS или новые EPS и , следовательно, целевой скрининг. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Основной этап / Аналитический модуль Рабочий процесс Наблюдение / Описание
Культивирование штаммов 1 мл EPS-СРЕДНЕЙ
Предкультуры 48 ч, 30 ° С, 1000 оборотов в минуту
Главная культура 48 ч, 30 ° C, 1000 оборотов в минуту 		Производство EPS
Удаление клеток / вязкость Центрифугирование: 30 мин при 4,300 XG Нет гранул = повышенная вязкость = положительная
Обнаружение полимера: Осадки 50 мкл суpernatant + 150 мкл 2-пропанола б
Встряхивания в течение 10 мин при комнатной температуре и 900 оборотов в минуту б 		Визуальные: Волокна и хлопья = положительное осаждение полимера
Удаление клеток / высокая вязкость 180 мкл супернатанта из основного-культуры
Центрифугирование: 10 мин при 3000 XG
1,0 мкм мембрана из стекловолокна 		Без фильтра прохождения = высокая вязкость = положительная
Обнаружение полимера: Осадки 50 мкл фильтрата + 150 мкл 2-пропанола б
Встряхивания в течение 10 мин при комнатной температуре и 900 оборотов в минуту б 		Визуальные: Волокна и хлопья = положительное осаждение полимера
Глюкоза потребление:
Глюкоза-анализ 		Разбавление 1: 100:
10 мкл фильтрата + 990 мкл DDH 2 O
50 мкл аликвоты + 50 мкл КГНлор-микс
Инкубация 30 мин при 30 ° C в 150 оборотов в минуту
Измерение 418-480 нм 		Оставаясь глюкозу после культивирования
Гель-фильтрация Уравновешивание:
3 х 150 мкл NH 4 -acetat буфер рН 5,6
2 х 2 мин при 2000 XG
1 х 2 мин при 1000 XG
Гель-фильтрация:
35 мкл фильтрата, 2 мин при 1000 х г
Мойка:
3 х 150 мкл DDH 2 O, 2 мин при 2000 XG
75 мкл 20% -ного этилового спирта для хранения 		Очистка полимеров:
Удаление солей, пирувата, глюкозы и других сахаров мономеров от выращивания супернатанта
Оставаясь глюкозы после гель-фильтрации
Глюкоза-анализ 		Разбавление 1:10:
25 мкл DDH 2 O +
20 мкл DDH 2 O и 5 мкл фильтрата
+ 50 мкл реагента-микс Измерение 418-480 нм 		Вычитание оставшейся глюкозы после гель-фильтрации с фенолом-сернокислотный метод
Глюкоза эквивалент:
Фенол-сернокислотный метод C 		20 мкл гель-фильтрат + 180 мкл фенол-сернокислотный (30 мкл 5% (вес / объем) фенол в DDH 2 O + 150 мкл конц. H 2 SO 4 (ρ = 1,84 г / мл))
Встряхивания 5 мин при 900 оборотах в минуту
Инкубация 35 мин при 80 ° С
Измерение при длине волны 480 нм 		Глюкоза эквивалент:
Δ (фенол-сернокислотный значение - оставшееся после глюкозы гель-фильтрации)
<300 мг / л отрицательный
> 300 и <700 мг / л предполагаемую положительный
> 700 мг / л положительный
которая выполняется вручную в стерильных условиях (ламинарного потока).
б Горючая жидкость обрабатывается вручную под вытяжкой.
с Фенол-сернокислотный обрабатываются с Марка Liquid Handling Station (LHS) под вытяжкой.

Таблица 1:. Полный рабочий процесс автоматизированной предварительный скрининг с роботизированной системой обработки жидкости и жидкости обработки станции Обзор всех параметров для автоматизированных аналитических модулей.

линейность LOD ПКО
r² склонированный компенсировало мг / л мг / л
0,9998 0,0007 -0,021 50 100
стандарт Среднее значение б Точность б Точность б
мг / л мг / л РЕЗЮМЕ% Уклон (% ошибок)
5000 5112 1.8 2.2
250 265 5.3 6.1
в среднем восьми измерений, калибровка с шестью уровнями глюкозы от 0,1 до 5 г / л
б Выполняется с Т-тест Стьюдента (а = 0,05; п = 8).
LOD: предел определения, ПКО: предел количественного определения, CV: коэффициент вариации.

Таблица 2:Введение в действие фенол-сернокислотный методом проводили с жидкостной обработки станции. Линейность была рассчитана на основе калибровки по шесть точек (п = 8). Среднее, точность и точность двух иллюстративно выбранных концентраций глюкозы приведены здесь.

линейность ПКО
r² склонированный компенсировало мкМ
без матрицы 0,99999 0,0223 -0,0019 1
Разводили 1:10 матрица 0,99999 0,0221 -0,0011 1
стандарт Среднее значение б Точность б Точность б
мкМ мкМ РЕЗЮМЕ% Уклон (% ошибок)
без матрицы 50 49.96 3,05 -0,09
1 1,04 2,95 3,86
Разводили 1:10 матрица 50 49.98 0,44 -0,04
1 1,00 4,58 0,33
средним из трех измерений, калибровка с шестью концентрациями пирувата от 1 до 50 мкМ.
б (п = 3)
ПКО: предел количественного определения, CV: коэффициент вариации.

Таблица 3:. Проверка пирувата-анализа с использованием и без 1:10 разбавленного нейтрализованного трифторуксусной кислоты-матрицы Два шесть точечных калибровок (п = 3) с и без проводили оценку матричных влияний. были вычислены среднее, высокая точность и двух иллюстративно выбранных концентраций пирувата с и без эффектов разведения 1:10.

Таблица 4
Таблица 4:.. Результаты трех типичных штаммов скринингу с платформой Данные , собранные с автоматизированного скрининга и углеводной отпечатка пальца Пожалуйста слизать здесь, чтобы загрузить эту таблицу в виде файла Microsoft Excel.

углевод Поглощение макс [нм] Поглощение при 480 нм среднее ± SD Абсорбция по отношению к глюкозе [%]
диутан резинка 470 0,342 ± 0,010 187
Геллан резинка 472 0,334 ± 0,002 183
Гуаровая камедь 478 0,387 ± 0,017 212
Gummi арабский 476 0.393 ± 0,034 215
Гиалуроновая кислота 484 0,231 ± 0,011 126
карайи 478 0,455 ± 0.023 249
Аморфофаллус резинка 480 0,297 ± 0,009 163
Лиственница резинка 480 0,337 ± 0,032 185
Камедь плодов рожкового дерева 478 0,354 ± 0,033 194
склероглюкан 484 0,168 ± 0,010 92
сукциногликан 482 0,168 ± 0,005 92
Тара жевательной резинки 480 0,318 ± 0,016 174
трагаканта 478 0.513 ± 0.003 281
велановая смола 472 0,226 ± 0,016 124
Ксилан 472 0.567 ± 0,007 311
ксантановая камедь 482 0.245 ± 0,021 134
глюкоза 484 0,191 ± 0,014 100
SD: стандартное отклонение

Таблица 5:. Результаты, полученный методом фенол-сернокислотный в течение 16 коммерчески доступных полимеров и глюкозы Максимальное поглощение и поглощение при 480 нм , 16 коммерчески доступных полимеров (1 г / л), а также глюкоза (1 г / л ) измеряли применением фенол-сернокислотный метод. вычисляли оптическую плотность по сравнению с глюкозой всех полимеров.

стандарт Имею в виду Точность Точность
мг / л мг / л РЕЗЮМЕ% Уклон (% ошибок)
разведение 1:10 450 460 1.01 2.14
45 44,7 1,41 -0,70
Разведение 1: 100 4.500 5026 1,19 11,6
450 471 1.16 4,55
б Выполняется с Т-тест Стьюдента (а = 0,05; п = 8).
CV: коэффициент вариации.

Таблица 6: Разбавление для глюкозо-анализа после культивирования (1: 100) Проверка автоматического разбавления для глюкозо-анализа и после того, как гель-фильтрации (1:10) были подтверждены.. Две концентрации глюкозы (N = 8) разбавляли с помощью системы обработки жидкости и оценены. были вычислены среднее, точность и точность.

Теоретическое значение глюкозы Покрытый силиконовой крышкой мата Тест испарения (непокрытый)
означает Точность Точность означает Точность Точность а </ Сильный> выпаривание
мг / л мг / л РЕЗЮМЕ % Уклон (% ошибок) мг / л РЕЗЮМЕ % Уклон (% ошибок) %ошибка
45,0 45,2 0,69 0,44 46,0 0,66 2,05 1,60
18,0 17,7 0,80 -1,68 18,0 0,72 -0,01 1,69
9.0 8,74 1.20 -2,98 8,92 0,81 -0,95 2,09
4.5 4,50 1,26 -0,04 4,58 1,57 1,76 1,80
1.8 1,85 0,74 2,90 2,01 2,82 11,6 8,48
0,9 1,03 1,43 14.1 1.16 3,52 28,3 12.4
(п = 4)
CV: коэффициент вариации.

Таблица 7:. Оценка испарения эффекта покрытые и непокрытые МТР шести различных стандартов глюкозы (п = 4) были сохранены в карусели в течение 3,5 ч при комнатной температуре. Эффект испарения оценивали с помощью непокрытой, а также покрыты (циновка кремния) стандартных образцов. были вычислены среднее, точность, точность и испарение в% погрешности.

Перед тем как гель-фильтрации <TD> 25,1
После того, как гель-фильтрации Оставаясь глюкозы после гель-фильтрации
означает SD означает SD
мг / л мг / л мг / л мг / л %
1 8647 110 259 121 3.00
2 5108 56 116 37 2,27
3 +2014 12 50,8 14 2,52
4 1,015 12 8.1 2,47
5 510 4.9 12,8 4.3 2,51
6 223 8.6 6.6 1.5 2,94
7 122 5.6 4.3 0,9 3,48
8 75 6.0 3.1 0,3 4,18
(п = 8)
SD: стандартное отклонение

Таблица 8:. Результаты эффективности для гель-фильтрации Восемь различных стандартов глюкозы определяли до и после того, как гель-фильтрации , чтобы оценить эффективность гель-фильтрации. Среднее значение, стандартное отклонение и остающийся глюкозы после гель-фильтрации в% рассчитывали.

Discussion

Обнаружение полисахарид с фенолом-сернокислотный метод: Различные моносахариды показаны разные максимумы поглощения и молярные коэффициенты экстинкции при помощи этого метода 9. Это приводит к появлению различных максимумов поглощения полимеров, которые содержат несколько сахаров в различных количествах. Различные длины волн максимумов поглощения для 16 различных коммерчески доступных полимеров, приведены в таблице 5. Полимеры растворяют (1 г / л) в DDH 2 O, перемешивают (150 оборотов в минуту) в течение ночи и измеряли с помощью фенол-сернокислотный-методом , Диутан камедь показал самый низкий максимум поглощения при 470 нм и склероглюкан и гиалуроновой кислоты максимальным при 484 нм. На основании этих результатов было выбрано 480 нм для этого скрининга платформы. Относительное поглощение полимеров рассчитывали на основании оптической плотности, полученной с 1 г / л глюкозы (за 100%). Самые низкие результаты были получены с склероглюкан и сукциногликан, и с 92%. Это было ехрected потому что склероглюкан содержит только глюкозу и сукциногликан содержит глюкозу и галактозу в соотношении 7: 1. Как коммерческие полимеры имеют разные потери сушки и различным содержанием золы, это является причиной, почему не была достигнута теоретическая величина ~ 110%. Ксилан показал самую высокую относительную оптическую плотность при 311%. Причиной этого является высокий коэффициент молярной экстинкции достигается из ксилозы из-за более доминантной фуранозной формы. На уровне 0,1 г / л глюкозы, при достижении предела количественного определения, а также предел обнаружения при концентрации <0,05 г / л. Тем не менее, предел обнаружения для положительных штаммов в скрининге, выше, чем 0,7 г / л и, следовательно, анализ показал хорошую производительность. Для того чтобы получить достоверные результаты, оставшиеся после того, как глюкоза гель-фильтрации определяли с помощью глюкозо-анализа, и это значение вычитают из значений из фенол-сернокислотный метод.

Автоматизированная глюкозо-анализ разбавления: Производительностьиз определения уровня глюкозы крови после культивирования (разведение 1: 100) исследовалась. Для этого 10 мкл супернатанта переносили в 990 мкл DDH 2 O в глубокой тарелке так и смешанные через десять раз аспирационных и диспергирующими 180 мкл из этого раствора. Вторым важным шагом было правильным пипеткой только 5 мкл аликвоты для разведения 1:10 из глюкозо-анализа после гель-фильтрации. Для того , чтобы генерировать разбавление 25 мкл DDH 2 O переносили с 50 мкл кончика первой, после этого 20 мкл DDH 2 O и 5 мкл гель-фильтрата отсасывали вместе. Это обеспечивает лучшее удаление 5 мкл аликвоты из кончика. Оба шага разведения были проверены с различными стандартами глюкозы через глюкозо-анализа. Результаты для двух типичных концентраций приведены в таблице 6 : 1:. 100 разбавления для определения содержания глюкозы после культивирования показали высокую точность для обоих стандартов с CV & #60; 1,2%. В то же время, точность для более высокого стандарта была до 11,6% (погрешность). Тем не менее, это можно пренебречь, поскольку определение глюкозы представляет собой лишь остаточное содержание глюкозы после культивирования и поэтому, не важно для обнаружения полимера. Разведение 1:10 для оставшейся глюкозы после гель-фильтрации показали очень надежные результаты с CV <1,4% и точностью <2,1% ошибок.

Рассмотрение испарения: Скрининг требует 3,5 ч от первого шага до первого глюкозо-анализа. Для того, чтобы выяснить, есть ли на этот раз кадр влияние на раскрытый хранения МТР, 50 мкл глюкозо-анализа калибровочных стандартов были сохранены с и без крышки в течение 3,5 ч в роботе карусели. В калибровочном диапазоне (от 45 до 4,5 мг / л) концентрация образца, практически не увеличивается. Увеличение - в результате испарения - был ниже 2,1% и только для двух самых низких концентрациях (1,8 и 0,9 мг / л) она доходила до 12,4% (

Гель-фильтрация: Высокое количество не-метаболизируется глюкозы нарушают количественного определения глюкозы из гидролизованного полимера. Таким образом, шаг гель-фильтрации требовалось для удаления оставшейся глюкозы после культивирования. Кроме того, гель-фильтрации очищает полимер, содержащий супернатант из солей и мономерной углеводных соединений, другие, чем глюкоза, чтобы свести к минимуму аналитического фона в анализе мономера. На стадии для гель-фильтрации 35 мкл фильтрата помещают в центре скважины. Для проверки робастности гель-фильтрации в автоматизированной системе, восемь калибровочных стандартов от 0,045 до 9 г / л глюкозы были фильтруется (п = 8). Глюкоза каждой концентрации всегда была снижена более чем на 95% от исходного значения (таблица 8). При этом гель-фильтрации показали очень хорошие результаты при различных концентрациях глюкозы. Кроме того, оставшаяся глюкоза после гель-Filtration также определяли с помощью глюкозо-анализа и вычитают из определения фенола-сернокислотный получить правильное количество эквивалента глюкозы для гидролизованного полимера.

Пируват-анализ: Во-первых, это было исследовано мешает ли нейтрализованы и разводили (1:10) ТФУ-матрица из стадии гидролиза с ферментативной реакции. Таким образом, полный анализ проводили дважды, один раз с и один раз без матрицы и показал надежные результаты. И, наконец, содержание пирувата из 16 коммерчески доступных полимеров успешно измерена и показана на рисунке 3. В общем известно , что из этих 16 полимеров только сукциногликан и ксантан , естественно , содержат пируват. С нашей пируват-анализе оба этих полимеров были правильно идентифицированы. В склероглюкан, велановую смолу и ксилана пируват был также обнаружен в значительных количествах. В целом, способность подхода была подтверждена и пируват-анализа сhowed высокую производительность. Оказалось, чтобы иметь возможность обнаружить пирувата в различных полимеров после гидролиза.

Углеводы отпечатков пальцев: После выполнения всех аналитических модулей в автоматизированном скрининга, потенциальные производители EPS были отобраны для анализа отпечатков пальцев содержанием углеводов. Для этого были применены несколько критериев: 1) Положительный наблюдение вязкости после центрифугирования и / или после фильтрации. 2) Осадки до и после фильтрации. Наблюдаемые волокна и чешуйки были оценены как положительные. 3) Глюкоза эквивалентное значение из фенольной-сернокислотный метод. Значения> 700 мг / л были оценены как положительные и значения в диапазоне от 300 до 700 мг / л были оценены как производителями предположительные EPS. Когда два или три критерия были оценены как положительные, штаммы были выбраны для дальнейшего углеводного анализа отпечатков пальцев. Критерии могут быть настроены по отношению к индивидуальной цели скрининга EPS (например , EPS с низкой вязкостью). Наш подход нацелен на поиск efficiлор EPS производителей. При поиске штаммов, которые производят только небольшое количество EPS предел оценки эквивалента глюкозы должна быть уменьшена.

Технические выгоды и будущих приложений: Одной из интересных особенностей этого протокола является модульный характер шагов и различных аналитических модулей. Их можно комбинировать по-разному, с поправкой на индивидуальные требования и новые модули могут быть легко реализованы. Кроме того, аналитические модули могут быть использованы по отдельности, например , модуль гидролиза в сочетании с модулем HT-РМР-дериватизации способен выполнять мономерный анализ состава из различных растворов полимеров (1 г / л) в 96-луночном формате. Для лабораторий, не имея доступа к жидкой системе обработки полный скрининг может быть обработан вручную, без каких-либо изменений в схеме пипетирования. Тем не менее, используя систему обработки жидкости увеличивает пропускную способность до 768 штаммов (вместо если это screene 192 штаммовd вручную) в день. Протокол , который описан здесь способен скрининг для различных родов и , следовательно, для скрининга больших коллекций штаммов с целью выявления производителей новые EPS и анализировать их углеводный отпечаток пальца в одном подходе (рисунок 4). Кроме того, целевой скрининг полисахаридов, содержащих редкие сахара, как фукозы, уроновой кислоты или даже неизвестные сахара могут быть выполнены с помощью детального анализа моносахаридов. Кроме того, различные комбинации сахара в определенных соотношениях могут быть обнаружены. Это дает возможность простой идентификации структурно родственных вариантов уже известных EPS или новых EPS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well deep well plate 2.0 ml (DWP) Greiner Bio-One 780271 Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990 µl of ddH2O
Breathable Sealing Film Axygen BF-400-S Incubation film for pre- and main-culture DWP
Aluminum Sealing Film Axygen PCR-AS-200 -80 °C storage film for glycerol-stock plates
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl TECAN 30038619 Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)
A/B glass-filter-plate 1 µm Pall Corporation PN 8031 Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well micro titer plate V-Bottom Greiner Bio-One 651201 Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well SpinColumn G-25 Harvard Apparatus 74-5612 Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)
96-well micro titer plate V-Bottom Nunc 249944 Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips TECAN 30038609 Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)
Trough 250 ml Axygen Res-SW96-HP Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetate buffer pH 5.6 (CP 5-7)
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP) Greiner Bio-One 655101 precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)
96-well silicon cap mat  Whatmann 7704-0105 Cover mat for MTP
200 µl pipette tips Sarstedt 70.760.002 For manually handling
1,000 µl pipette tips Sarstedt 70.762 For manually handling
96-well-PCR micro titer plate  Brand 781350 Hydrolysis, PMP-derivatisation
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat  Brand 781405 Hydrolysis, PMP-derivatisation
Filter plate 0.2 µm Supor Pall Corporation PN 8019 Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate
Pipette Tips LHS 5-300 µl Brand 732150 Brand LHS system
Glucose oxidase  Sigma-Aldrich G2133 Glucose-assay
Horseradish peroxidase  Sigma-Aldrich P6782 Glucose-assay, pyruvat-assay
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt) Wako Chemicals GmbH 043-22351 Pyruvat-assay
Pyruvate oxidase  Sigma-Aldrich P4591 Pyruvat-assay
Potassium phosphate dibasic Carl-Roth P749.3 Pyruvat- and glucose-assay
Potassium phosphate monobasic Carl-Roth 3904.3 Pyruvat- and glucose-assay
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754 Pyruvat-assay
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 31413 Pyruvat-assay
2-Propanol VWR 20922.466 Precipitation
Phenol VWR 20599.231 Phenol-sulfuric-acid method
Sulfuric acid Carl-Roth 4623.4 Phenol-sulfuric-acid method
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508 Hydrolysis
Ammonium solution Carl-Roth P093.1 Hydrolysis, PMP-derivatization
Ethanol absolut VWR 20821.321 Hydrolysis, PMP-derivatization
Phenol red  Alfa Aesar B21710 Hydrolysis, PMP-derivatization
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone Sigma-Aldrich M70800 PMP-derivatization
Methanol LC-MS VWR 83638.320 PMP-derivatization
Acetonitril LC-MS VWR 83040.320 PMP-derivatization
Acetic acid Sigma-Aldrich 338826 PMP-derivatization
Ethanol absolut VWR 20821.321 PMP-derivatization
Methyl red Alfa Aesar 36667 pH-value
Robotic liquid handling system  Tecan Freedom EVO Worktable setup in Figure 2
Liquid handling station LHS Brand 709400 Worktable setup in Figure 2
Tip-Adapter Brand 709434 Worktable setup in Figure 2
Liquid Ends MC 20-300 µl Brand 709416 Worktable setup in Figure 2
Adapter 60 mm Brand 709430 Worktable setup in Figure 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Milani, J., Maleki, G. Ch. 2, Hydrocolloids in Food Industry. Food Industrial Processes - Methods and Equipment. Valdez, B. 2, InTech. (2012).
  2. Thibodeau, A. Protecting the skin from environmental stresses with an exopolysaccharide formulation. Cosmet Toiletries. 120 (12), 81-90 (2005).
  3. Prajapati, V. D., Jani, G. K., Zala, B. S., Khutliwala, T. A. An insight into the emerging exopolysaccharide gellan gum as a novel polymer. Carbohydr Polym. 93 (2), 670-678 (2013).
  4. Schmidt, W., Brouwers, H. J. H., Kuehne, H. C., Meng, B. The working mechanism of starch and diutan gum in cementitious and limestone dispersions in presence of polycarboxylate ether superplasticizers. Appl. Rheol. 23 (5), 52903 (2013).
  5. Srinivasan, R. Natural Polysaccharides as Treatment Agents for Wastewater. Green Materials for Sustainable Water Remediation and Treatment. , The Royal Society of Chemistry. 51-81 (2013).
  6. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. High throughput exopolysaccharide screening platform: From strain cultivation to monosaccharide composition and carbohydrate fingerprinting in one day. Carbohydr Polym. 122, 212-220 (2015).
  7. Ortega-Morales, B. O., et al. Characterization of extracellular polymers synthesized by tropical intertidal biofilm bacteria. J Appl Microbiol. 102 (1), 254-264 (2007).
  8. Xu, R., Ma, S., Wang, Y., Liu, L., Li, P. Screening identification and statistic optimization of a novel exopolysaccharide producing Lactobacillus paracasei HCT. Afr. J. Microbiol. Res. 4 (9), 783-795 (2010).
  9. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28 (3), 350-356 (1956).
  10. Masuko, T., et al. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).
  11. Geater, C. W., Fehr, W. R., Wilson, L. A., Robyt, J. F. A more rapid method of total sugar analysis for soybean seed. Crop Sci. 41 (1), 250-252 (2001).
  12. Sutherland, I. W. Ch 16, Microbial Exopolysaccharides. Polysaccharides Structural Diversity and Functional Versatility. Dumitriu, S. , Marcel Dekker. 431-457 (2005).
  13. Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances?. Microbial extracellular polymeric substances: characterization, structure and function. Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. , Springer. 258 (1999).
  14. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Fast carbohydrate analysis via liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection in 96-well format. J. Chromatogr. A. 1350, 44-50 (2014).

Tags

Медицина выпуск 110 экзополисахарида автоматизированные модульные скрининг платформа с высокой пропускной способностью разные роды углеводный отпечатков пальцев.
Автоматизированная модульная Высокая пропускная способность экзополисахарида Скрининг платформа В сочетании с высокочувствительными анализа Углеводы отпечатков пальцев
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rühmann, B., Schmid, J.,… More

Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis. J. Vis. Exp. (110), e53249, doi:10.3791/53249 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter