Summary
תכונות המערכת החיסונית של תאים האנושיים mesenchymal גזע (MSC) מופיעות רלוונטיות יותר ויותר ליישום קליני. באמצעות מערכת שיתוף התרבות של תאי גזע ולויקוציטים דם ההיקפי מראש צבעונית עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein צבע הניאון (CFSE), אנו מתארים את ההערכה במבחנה של תפקוד מערכת חיסון MSC על התפשטות יקוציט מפעיל ותת-אוכלוסיות ספציפיות.
Introduction
תאים אנושיים גזע mesenchymal (MSCs) הם אבות גופניים שיכול להתמיין שושלות mesodermal הפרקסיאלית של עצם, סחוס, ורקמת שומן 1-4, כמו גם לכמה שושלות extramesodermal 5. בודד לראשונה ממח העצם המבוגר, אבות multilineage אלה עכשיו נמצאו במספר רב של רקמות 6-8 ו, באופן בלתי צפוי, הראה את תכונות המערכת החיסונית חזקות שמופיעות נוח מאוד ליישום קליני 9-12. מנגנונים מפורטים המעורבים בהשפעות המערכת החיסונית באופן פעיל נחקרים על יישום יעיל בגופים מחלה ספציפיים. אחת הדרכים פשוטות ביותר להערכת תפקוד מערכת חיסון הוא על ידי הערכה לדיכוי התפשטות יקוציט מפעיל 13. רוב לויקוציטים מפעיל כגון לימפוציטים מסוג T ומונוציטים להתרבות להפליא כאשר מגורה או הופעל. פונקצית המערכת החיסונית ניתן להעריך מתי דיכויעדות לכך היא התפשטות.
באופן מסורתי, התפשטות יקוציט מפעיל הוערכה על ידי איתור של [3 H] התאגדות thymidine לתוך ה- DNA. עם זאת, בשיטה זו יש חסרונות משמעותיים עקב החששות של קרינה ורשות דואר לשימוש, כמו גם הציוד המורכב דרוש. אמנם יש מבחני לא רדיואקטיבי להעריך התפשטות תאים, יש assay succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE) יתרונות אחרים כגון המאפשר זיהוי של אוכלוסיות סלולריות ספציפיות, שהוא שימושי במיוחד בניסויי שיתוף התרבות מעורבים סוגי תאים מרובים. CFSE הוא צבע סלולארי ניאון שניתן להעריך על ידי ניתוח התזרים cytometric. כתאים מתחלקים, עוצמת תווית סלולרית זה היא ירד באופן יחסי; זה לא רק מאפשר קביעת התפשטות תאים כוללת, אלא גם מאפשר להערכה על מספר חלוקות תא עד 8 חטיבות לפני הקרינה הופכת להיות קשה Detect נגד אות רקע. יתר על כן, יציבות CFSE הניאון מאפשרת מעקב in vivo של תאים שכותרתו כך שניתן דמיינו את תאים לחודשים רבים 14.
assay זה יכול גם להיות מגוון כדי להעריך סוגים מסוימים של כדוריות דם לבנות מפעיל או פונקצית המערכת החיסונית של אוכלוסיות ספציפיות של MSC-induced לויקוציטים-כגון המערכת החיסונית כinterleukin-10 (IL-10) בהפקת CD14 + מונוציטים 15 על ידי ביצוע בחירת סמן משטח מגנטי חרוז של אוכלוסיות תאים של עניין לפני או אחרי שיתוף תרבות כמתאים. הפרוטוקול שלנו מתאר את assay הבסיסי של הערכת השפעות המערכת החיסונית של תאי גזע בלויקוציטים מפעיל (תרשים זרימה שמוצג באיור 1) ווריאציה על assay הבסיסי זה להערכת תפקוד מערכת חיסון יקוציט מושרה MSC בלימפוציטים מסוג T מסוג CD4 + מפעיל אלוגנאית (מוצג תרשים זרימה באיור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הסכמת המטופל הודיעה כפי שאושרו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי יש לקבל לשימוש בתאים אנושיים.
1. בידוד צפיפות צבע של תאים ההיקפיים אדם הדם mononuclear (PBMCs)
- הוסף 25 מיליליטר heparinized כל דם לתוך צינור 50 מיליליטר על ידי פיפטה 25 מיליליטר.
- לדלל תאים עם 25 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS).
- להוסיף 15 מיליליטר של שיפוע צפיפות Ficoll-Paque לתוך צינור 50 מיליליטר חדש, ותוך הטיית הצינור, מאוד לאט ובזהירות להוסיף 25 מיליליטר בהשעית התא המדולל מעל שיפוע הצפיפות כך שאין ערבוב של כל הדם עם שיפוע הצפיפות, כלומר., אין הפרעה של ממשק שיפוע דם בצפיפות.
- צנטריפוגה ההשעיה מהצעד 1.2 בז × 400 במשך 30 עד 40 דקות בהרוטור מתנדנד-דלי טמפרטורה מבוקרת ללא בלם ב 20 ° C.
שים לב: שלוש שכבות נפרדות צריכה להיות ברורות לאחר צנטריפוגה: הדואר פלזמה יצור שכבה העליונה; השכבה התחתונה ברורה ששיפוע צפיפות Ficoll-Paque; ושכבה דקה, בינונית סלולרית להיות PBMCs - לשאוב ולזרוק את השכבה העליונה על ידי שאיבה עם פיפטה פסטר, בזהירות שלא להפריע את שכבת הביניים של תאי mononuclear (כלומר, לימפוציטים, מונוציטים, וטסיות דם).
- לאסוף בזהירות שכבת תאי mononuclear זה עם פיפטה 10 מיליליטר לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש.
- מלא את הצינור עם 20 מיליליטר של PBS, מערבב היטב, וצנטריפוגות ב g × 300 עבור 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לחלוטין לאחר צנטריפוגה.
- Resuspend התא גלולה ב 20 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 10-15 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לחלוטין לאחר צנטריפוגה.
הערה: צעד זה מסיר את טסיות הדם-שהם לא רצויים-בPBMCs; ניתן לחזור על שלב זה כדי להבטיח הסרת מלאה טסיות הדם. - אם אין בחירה של אוכלוסיות ספציפיות היארצוי, resuspend תא גלולה במדיום מלא לויקוציטים (10% בסרום שור עוברי (FBS), 1% L- גלוטמין, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין במדיום RPMI-1640) עבור culturing לאחר ביצוע ספירת תאי 16 להשעות 1 מיליליטר של בינוני לכל 10 7 PBMCs לפני שתמשיך לשלב הבא.
2. תיוג מגנטי של אוכלוסיות יקוציט (דלג לשלב 4 אם אין בחירה של אוכלוסיות ספציפיות נדרש)
- ההשעיה צנטריפוגה PBMC בז × 300 במשך 10 דקות ולשאוב supernatant לחלוטין.
- גלולה תא הגלול ב 80 μl של PBS לכל 10 7 תאים כולל.
- הוסף 20 μl של חרוזים מגנטיים שצוינו (כלומר, חרוזים מגנטיים CD14 לבידוד של מונוציטים, חרוזים מגנטיים CD4 לבידוד של לימפוציטים מסוג T) לכל 10 7 תאים כולל.
- מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות ב2 עד 8 מעלות צלזיוס במקרר.
- להוסיף 1-2 מיליליטר של PBS לכל 10 7 תאים לשטוף, ו צנטריפוגותבז × 300 במשך 10 דקות.
- לשאוב supernatant לחלוטין וresuspend עד 10 8 תאים ב500 μl של PBS.
3. בחירה מגנטית של אוכלוסיות יקוציט
הערה: מגוון רחב של מפרידי חרוז מגנטיים ועמודות זמינים לבידודה של אוכלוסייה הספציפית של לויקוציטים ידי סמן תא שטח ממספר היצרנים. בידוד יכול להיות על ידי בחירה חיובית המבוססת על סמנים אחד או כמה חיוביים או על ידי בחירה שלילית לאחר הדלדול של אוכלוסיות לא רצויות. גישה כללית של ביצוע סלקציה חיובית באמצעות סמן אחד (כלומר, מסוג CD4 לימפוציטים T מסייע, או CD14 למונוציטים) מפורטת להלן.
- הכן ומפריד מגנטי ראש כולל טור הפרדה על פי הוראות יצרן.
- החל צינור המכיל המדגם של PBMCs שכותרת. לספק שני 15 מיליליטר צינורות צנטריפוגה לאיסוף וסר התווית שכותרתו חיוביתשברים אד תא, הבאים הוראות יצרן.
- ספירת תאי מספר 15 וresuspend לויקוציטים חיובי שנבחר (כלומר, לימפוציטים מסוג CD4 + T או CD14 + תאים) במדיום מלא לויקוציטים, באמצעות 1 מיליליטר של מדיום לכל 10 7 תאים.
4. CFSE הכתמה של לויקוציטים להערכה של הפצת נשק
הערה: CFSE כבר בשימוש נרחב בחקירות חיסוניות, לשניהם in vivo ובניסויים במבחנה. הפרוטוקול שלנו כבר מותאם למחקר במבחנה של MSC / PBMC (או לויקוציטים אחרים) אינטראקציות. בעוד מעורבים בניהול במבחנה תיוג CFSE הצעדים הכלליים דומים, שעשוי להיות הבדלים במינון ובעיתוי הספציפיים של הפרוטוקול 14. זה יכול להיות בגלל מספר הגורמים, כלומר, סוג תא המסוים בשימוש, מספרים סלולריים המשומשים שסביר יכול להשפיע על עוצמת אות ניאון CFSE.
5. עמית תרבות Mמאמנים עם לויקוציטים והפעלה של לויקוציטים
- בינוני MSC טרום החם מלא (10% FBS (שנבדק מראש לצמיחה אופטימלית MSC), 1% L- גלוטמין, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין במדיום גלוקוז DMEM נמוך) עד 37 מעלות צלזיוס במשך לא יותר מ -30 דקות.
- MSCs זרע ב50,000 תאים ב 1 מיליליטר של מדיום מלא MSC בלוחות 24 גם (צפיפות MSC: 25,000 תאים / 2 סנטימטר) לO המצורף / N בחממה 37 ° C, המאפשרים לתאי הגזע כדי להגיע למפגש 80%.
- בינוני לשאוב, ומבוסס על מספרי MSC זרע, להוסיף PBMCs כותרת CFSE (שכותרתו בבקשה בעבר מתייחס לשלב פרוטוקול 4 לעיל) לתאי גזע בתרבית (שנזרע ביום הקודם בלוחות 24 גם) ב 1 מיליליטר של מדיום מלא לויקוציטים ב 01:10 (יחס תא) יחס שיתוף תרבות של תאי גזע לPBMCs.
- הוסף את phytohemagglutinin mitogen (PHA), activator יקוציט שאינו ספציפי, לריכוז סופי של 10 מיליליטר / ק"ג בנפח כולל של מדיום מלא יקוציט 1 מיליליטר לכל טוב.
- Alternativאיליי, כדי לעורר להפעלה של לימפוציטים מסוג T במיוחד: להשתמש α-CD3 / 28 microbeads ולהוסיף לשיתוף תרבות שני התאים כדי להשיג יחס הלימפוציטים חרוז לT של 1: 1.
- לביקורת שלילית, צלחת 500,000 PBMCs / טובה (או אוכלוסיית יקוציט מפעיל מסוימת; צפיפות תאים: 250,000 לויקוציטים / 2 סנטימטר) בצלחת 24 גם עם בינוני מלא יקוציט רק 1 מיליליטר; לביקורת חיובית, בנוסף לציפוי אותו המספר של PBMCs / טוב, להוסיף PHA לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
- ב -3 ויום 5 בניסוי שיתוף התרבות, להעריך התפשטות של לויקוציטים כותרת CFSE (ממוקם בצינורות עגולים התחתון) על ידי ניתוח התזרים cytometric 17 עם מסנני 488 עירור ננומטר ופליטה מתאימים להעמסה.
הערה: מכתים ציטוקינים תאיים לניתוח התזרים cytometric יכול להתבצע גם לויקוציטים כותרת CFSE אלה בשלב זה להעריך לשינויים בפרופיל ביטוי ציטוקינים יקוציט כמוdulated ידי MSCs. מאז CFSE מוערך עם מסנן מתאים להעמסה, הנוגדנים שנבחרו להעריך ציטוקינים שונים צריכים להיות מצומדת לfluorochromes האחר מאשר העמסה או ספקטרום דומה (כלומר, Phycoerythrin, peridinin מורכב חלבון כלורופיל (PerCP)).
6. וריאציה: מגנטי Assay דיכוי מפעיל חרוזים נבחר, MSC-induced המערכת החיסוני Leukocytes על הופעל תאי מפעיל CD4 + T שכותרת CFSE
- MSCs זרע ב250,000 תאים ב 3 מיליליטר של מדיום שלם MSC ב6-גם צלחות (צפיפות MSC: 25,000 תאים / 2 סנטימטר) לO המצורף / N בחממה 37 ° C, המאפשרים לתאי הגזע כדי להגיע למפגש 80%. לפחות 3 6-גם צלחות נחוצות כדי להבטיח PBMCs MSC-cocultured מספיק לבחירה תת-אוכלוסייה.
- בינוני לשאוב, ולהוסיף PBMCs מופרד לפי שלב 1 אבל ב6-גם צלחות על 2.5 x 10 6 תאים / טוב (צפיפות תאים: 250,000 leukocytes / 2 סנטימטר) עם 3 מיליליטר של מדיום מלא לויקוציטים. שיתוף תרבות ל48-72 שעות בחממה 37 ° C.
- מגנטי חרוז-לבחור אוכלוסייה ספציפית של לויקוציטים המושרה MSC המערכת החיסונית (כלומר, CD14 + תאים) לפי סעיפים 2-3.
הערות: מכתים ציטוקינים תאיים לניתוח התזרים cytometric יכולות להתבצע בשלב זה להעריך לשינויים בפרופיל ציטוקינים יקוציט ביטוי, כלומר, ביטוי של interleukin-10-כמווסת על ידי MSCs. - הוסף כותרת CFSE תאי CD4 + T אלוגנאית שנוצרו כאמור בסעיף 2-4 בלוחות 24 גם ב 1 מיליליטר של (צפיפות תאי T: 250,000 תאים / 2 סנטימטר) יקוציט שלמה בינוניים לויקוציטים המושרה MSC-נבחר חרוז ביחסים שונים , כלומר, 01:10, 1: 5, 1: 2, ו- 1: 1 (תא לתא) יחסים.
- כדי לעורר תאי CD4 + T, להוסיף α-CD3 / 28 microbeads מצומדות לקבל יחס חרוז אל התא של 1: 1.
- לביקורת שלילית, צלחת 500,000 תאי CD4 + T / גם ב( צפיפות תאי T: 250,000 תאים / 2 סנטימטר) 24 גם צלחת עם בינוני מלא יקוציט רק 1 מיליליטר; לביקורת חיובית, בנוסף לציפוי אותו המספר של תאי CD4 + T / טוב, להוסיף α-CD3 / 28 microbeads מצומדות לקבל יחס חרוז אל התא של 1: 1.
- ביום 3 בשיתוף התרבות, להעריך התפשטות של תאי שכותרתו CFSE CD4 + T (ממוקמים בצינורות עגולים התחתון) על ידי ניתוח cytometric זרימה 16 עם מסנני 488 עירור ננומטר ופליטה מתאימים להעמסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציין את הסכימה הכוללת של הניסוי, ואיור 2 מדגים את המראה של תנאי תרבית תאים השונים כמו דמיינו ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך. MSCs הם תאים חסיד עם fibroblastic, מורפולוגיה דמוית כישור, ואילו PBMCs ולויקוציטים הם תאים שאינם חסיד עגולים קטנים. שני סוגי התאים שונים מורפולוגית אלה ניתן לראות בבירור בשיתוף התרבות. בסופו של assay, כאשר PBMCs (או leuckotyes) הם להישאף לתזרים cytometric ניתוחים, גם אם MSCs חסיד כלולים בטעות (כלומר, בשל עיקול או ליפה על ידי שאיפה נמרצת עניים), לא אמור להיות בעיות עם ההערכה חלק / יקוציט PBMC מאז תאים אלה יהיה שכותרתו עם CFSE. כאשר אין הפצה, תוצאות ההיסטוגרמה עבור תאים שכותרתו-CFSE נתפסות כשיא חיובי וחד ביותר; עם זאת, כאשר ההפעלה התרחשה, ההתפשטות תהיה ברורה כמו ב באו לידי ביטויפסגות y מרובות קטנות יותר עם אובדן ושמאל משמרת של עוצמת הקרינה (איור 3). כאשר דיכוי ההתפשטות התרחש, כלומר., עם התרבות המשותפת של תאי גזע, הפסגות קטנות מרובות תקטן עם עלייה נלווית של עוצמת ניאון כפי שמעידות על ידי ההסטה של הפסגות לימין והעלייה בחדות של ימין . רוב השיא המייצג את התאים הלא-חלוקת איור 4 מציין את הסכימה הכוללת של וריאציה אחת של הניסוי: הערכת דיכוי מפעיל של לויקוציטים המערכת החיסונית הנגרם על-MSC על מפעיל אלוגנאית מופעל תאי CD4 + T. התוצאות כגון וריאציה על הניסוי דומות לassay המקורי, עם המידע נוסף של דיכוי תלוי מינון של התפשטות ראתה (איור 5).
תרשים זרימה באיור 1. להערכה של השפעות המערכת החיסונית של תאי גזע mesenchymal (MSCs) על כדוריות דם לבנות מפעיל אלוגנאית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מורפולוגיה נייד של תאי גזע, כדוריות דם לבנות, ושיתוף תרבות של שתי אוכלוסיות תאים. צילומים מיקרוסקופי שלב בניגוד לתרבות תא הבודד של תאי גזע או כדוריות דם לבנות, ושיתוף תרבות MSC-יקוציט. בר סולם, 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דְמוּת 3. השפעות מדכאות על MSC מתרבים לויקוציטים. זרימת היסטוגרמה cytometric של succinimidyl אסתר carboxyfluorescein התפשטות יקוציט -labeled (ב) שיתוף תרבות תרבותית לבד unstimulated, עם תאי גזע (), (ג) בתרבית עם אנטי CD3-/ microbead CD28 (CFSE) גירוי (α-CD3 / CD28) לבד, (ד) ועם MSCs. האחוזים מוצגים בהיסטוגרמות לציין שיעור של לויקוציטים מתרבים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תרשים זרימת איור 4. להערכה של תפקוד מערכת חיסון יקוציט מושרה MSC בCD4 + אלוגנאית מפעיל לימפוציטים מסוג T.להעלות / 53,265 53265fig4large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. יכולת מדכאת של מונוציטים CD14 MSC-שיתוף תרבותי על מתרבים לימפוציטים מסוג CD4. מפזרים עלילה וזרימת היסטוגרמה cytometric של הקיבולת מדכאת של CD14 + מונוציטים MSC-שיתוף תרבותי (M-CD14 +) על אנטי-CD3 / microbead CD28 , לימפוציטים מסוג T מסוג CD4 + מפעיל כותרת CFSE -stimulated (S-CD4 +). יחס שיתוף התרבות של S-CD4 + ל- M-CD14 + מוצג. לימפוציטים מסוג CD4 + T היו מגודר (R1) והעריכו לעצמת CFSE. האחוזים מוצגים בהיסטוגרמות לציין שיעור מתרבים תאים מסוג CD4 + T. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של ההוא דמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
References
- Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).
- Yen, B. L., et al. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 23, 3-9 (2005).
- Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).
- Chang, C. J., et al. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).
- Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells. J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).
- Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. Curr Protoc Immunol. , Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Chen, P. M., et al. Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2. J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).
- Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. Curr Protoc Toxicol. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).
- Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. Curr Protoc Cytom. Robinson, J. P., et al. , Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).
- Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 371, 1579-1586 (2008).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307, 1169-1177 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).
- Li, X. Y., et al. Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells. Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).
- Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties? Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).
- Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells. Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).
