De immunmodulerende egenskaper av humane stamceller (MSC) synes stadig mer relevant for klinisk anvendelse. Ved hjelp av en co-kultur system av MSC og perifere blodleukocytter pre-farget med fluorescerende fargestoff karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE), beskriver vi in vitro vurdering av MSC immunmodulering på effektor leukocytter spredning og spesifikke subpopulasjoner.
The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.
Humane stamceller (MSC) er somatiske stamceller som kan differensiere til den paraksiale mesodermal linjer av ben, brusk, og fettvev 1-4, så vel som til et par extramesodermal linjene 5. Først isolert fra voksen benmarg, har disse multilineage stamfedre nå blitt funnet i en rekke vev 6-8 og uventet, vist seg å ha sterke immunmodulerende egenskaper som synes svært mottagelig for klinisk anvendelse 9-12. Detalj mekanismene som er involvert i immunmodulerende effekter er aktivt under etterforskning for effektiv anvendelse av spesifikke sykdoms enheter. En av de enkleste måtene å vurdere immunmodulering er ved å vurdere for undertrykkelse av effektor leukocytter spredning 13. De fleste effektorfunksjoner leukocytter som T-lymfocytter og monocytter sprer prodigiously når stimulert eller aktivert. Immunmodulerende funksjon kan vurderes når undertrykkelse avspredning er dokumentert.
Tradisjonelt har effektor leukocytt proliferasjon blitt evaluert ved påvisning av [3H] tymidin inkorporering i DNA. Imidlertid har denne metoden betydelige ulemper på grunn av bekymringer for stråling og etter bruk disposisjon, så vel som komplekset utstyr som er nødvendig. Mens det er ikke-radioaktive prøver for å vurdere celleproliferasjon, har karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE) assay andre fordeler som muliggjør identifikasjon av spesifikke cellepopulasjoner, som er spesielt nyttig i ko-kultur-eksperimenter som involverer flere celletyper. CFSE er et fluorescerende fargestoff cellulær som kan vurderes ved strømningscytometrisk analyse. Som celler deler, er intensiteten av denne cellulære etiketten redusert proporsjonalt; Dette ikke bare muliggjør bestemmelse av den samlede cellevekst, men også gjør det mulig for vurdering av antall celledelinger opp til 8 avdelinger før fluorescensen blir vanskelig å DETect mot bakgrunnssignal. Videre er stabiliteten av den fluorescerende CFSE muliggjør in vivo sporing av merkede celler slik som celler kan visualiseres opptil flere måneder 14.
Denne analysen kan også bli variert for å vurdere bestemte typer effektor leukocytter eller immunmodulerende funksjon av spesifikke populasjoner av MSC-indusert immunmodulerende leukocytter, for eksempel interleukin-10 (IL-10) som produserer CD14 + monocytter 15 ved å utføre magnetiske kuler overflatemarkør utvalg cellepopulasjoner av interesse før eller etter ko-kultur etter behov. Vår protokollen beskriver den grunnleggende analyse for å vurdere immunmodulerende effekter av MSC på effektor-leukocytter (flytdiagrammet vist på figur 1), og en variant av denne grunnleggende analyse for vurdering av MSC-indusert leukocytt immunmodulering på allogene CD4 + effektor T-lymfocytter (Flytdiagrammet i figur 4).
Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.
One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by grants from NHRI (CS-104-PP-06 to B.L.Y.).
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells,etc. |
autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
15 mL centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |