Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Генерация генетически модифицированных культур Органотипической кожи Использование нежизнеспособных Human дермы

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53280
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Dermatology, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego

Abstract

Органотипической культуры позволяют воссоздание 3D-среде критическим для контактных клетка-клетка и клетка-матрикс взаимодействий, которые имитирует функции и физиологию их в естественных условиях коллегами ткани. Это подтверждается органотипических культур кожи, которые верой и правдой повторяет дифференциации эпидермиса и стратификации программу. Первичные кератиноциты эпидермиса человека генетически манипулировать через ретровирусов, где гены могут быть легко сверхэкспрессированный или сбил. Эти генетически модифицированные кератиноциты могут быть использованы для восстановления эпидермиса человека в органотипических культур кожи, обеспечивающие мощную модель для изучения генетических путей, влияющих рост, дифференцировку эпидермиса и прогрессирование заболевания. Протоколы, представленные здесь, описывают способы получения девитальных человека дермы, а также генетически манипулировать первичных кератиноцитов человека для того, чтобы генерировать органотипической культур кожи. Регенерированный человеческую кожу можно использовать в downstrEAM приложений, таких как экспрессии генов профилирования, иммуноокрашивания и хроматина иммунопреципитации с последующим высокой пропускной секвенирования. Таким образом, поколение этих генетически модифицированных культур органотипических кожи позволит определить гены, которые имеют решающее значение для поддержания гомеостаза кожи.

Introduction

Эпидермис человека является многослойный эпителий, который подключается к подлежащей дерме через внеклеточный матрикс, известный как базальной мембраны эпидермиса zone.The не только служит в качестве непроницаемого барьера для предотвращения потери влаги, но и в качестве первой линии обороны, чтобы защитить Тело от иностранных и токсичных веществ 1. Базальный слой, который является глубокий слой эпидермиса, содержит эпидермальный стволовых и прогениторных клеток, которые приводят к дифференцированной потомство, которые образуют остальные эпидермиса 2. Как клетки-предшественники эпидермальные дифференциации они мигрируют наверх, чтобы сформировать первый слой дифференцированных клеток, известных как остистые слоя 3. В остистые слоя, клетки включить экспрессии кератинов 1 и 10, которые затем обеспечивают прочность, чтобы выдерживать физические нагрузки для дифференцированных слоев эпидермиса. Как остистые клетки слой дальнейшей дифференциации, они двигаются вверх в эпидермисе в течением зернистом слое, который характеризуется образованием кератогиалиновых и пластинчатых гранул, а также структурные белки, которые собраны ниже в плазматической мембране. Как клетки действовать в процессе дифференцировки в белки под плазматической мембраны поперечно связаны друг с другом в то время как пластинчатые гранулы экструдируют из клеток с образованием богатой липидами барьер под названием роговой слой 4.

Болезни, которые связаны изменения в росте и дифференциации эпидермиса воздействия ~ 20% населения 5. Таким образом, понимание механизмов этого процесса имеет большое значение. С проявлением многих из этих заболеваний является зависит от клетки к клетке или клеточной матрицы контакта, органотипической культуры, где эпидермис человека восстановленные в 3D-среде были созданы 6-10. Эти методы обычно включают использование первичных или трансформированных кератиноцитов, посеянных на внеклеточного матрикса, таких как нежизнеспособных человекадермы, Матригель или коллагена.

Чтобы понять генные регуляторные механизмы, которые важны в росте и дифференциации эпидермиса, кератиноциты может быть генетически манипулировать через ретровирусных векторов нокдаун или гиперэкспрессией генов в 2D культуре, а затем восстанавливали в 3D. Эти методы широко используются для характеристики гены, участвующие в эпидермиса стебля и клеток-предшественников самообновлению и дифференцировке, а также прогрессирования новообразования 11-21. Здесь протокол углубленной о том, как изменить экспрессию гена в эпидермальных органотипических культур за счет использования ретровирусов обеспечивается.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол кожи человека проводили в соответствии с руководящими принципами университета Калифорнии, Комитета по этике исследований в Сан-Диего. Кожа человека может быть получена из выброшенных хирургических образцов или купили у банков кожи (банк кожа перечислены в Материал / оборудование таблице). Место, где кожа является производным от возраста или донора не является критическим для эксперимента тех пор, пока белки базальной мембраны зоны (коллаген / ламинина) в дерме, не деградируют.

1. Подготовка нежизнеспособных человека дермы

  1. При получении человеческую кожу, поместите ткань в капот культуры ткани оттаивать (~ 3-5 мин). В зависимости от размера кожи, разместить талой ткани в стерильной одноразовой 50 мл коническую пробирку емкостью 125 мл или бутылки. Типичный размер кожи от банка кожи 0,75 кв.
  2. Заполните контейнер на 75% с 4-кратным пенициллина и стрептомицина (ручка / стрептококк) в 1x PBS. Встряхивать для5 мин и распоряжаться жидкости. Повторите этот шаг еще 3 раза.
  3. После последней промывки, передать ткань новой трубки / бутылки и добавить свежие 4x пера / стрептококк / PBS, чтобы заполнить 75% емкости. Инкубируйте эту смесь в инкубаторе тканевых культур при 37 ° С в течение 2 недель, чтобы позволить разделение дермы из эпидермиса.
  4. В стерильных условиях, использовать пинцет, чтобы очистить от эпидермис от дермы. Дерма полностью белым цветом, а эпидермис будет окраску в зависимости от расы донора (рис 1А). Откажитесь от эпидермиса в соответствии с протоколом учреждения для борьбы с человеческой тканью.
  5. Поместите дермы в трубку или бутылку и промыть его в 4-кратным ручка / стрептококк, разведенного в PBS 1x с энергичного встряхивания (5 мин моет в 4 раза). После последней промывки, не передавать дермы в новую пробирку / бутылка в 4-кратным ручка / стрептококк, разведенного в PBS 1x и хранить при температуре 4 ° С до готовности к использованию. Дерма можно хранить при 4 ° С в течение до одного года.
    6. 2. Генетически Изменение первичных человеческих кератиноцитов

    Примечание: использование амфотропный Phoenix клетки, выращенные в полной среде DMEM средах [DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) + ручка / стрептококк] для получения вирусов инфицировать первичные кератиноциты человека. Вирусные гены, которые кодируют упаковки белки, такие как затычки-Pol и конверт стабильно интегрирована в геном клетки Феникс, который позволяет для производства вируса при трансфекции ретровирусного вектора. Phoenix клетки могут быть трансфицированы с высокой эффективностью позволяет высокой вирусной производства титра. Вирус получают из этой упаковочной линии может также инфицировать большое разнообразие клеток млекопитающих, включая человека.

    1. День 1: За день до трансфекции, семена Phoenix клеток в 6-луночный планшет при плотности 800000 клеток на лунку в полной среде DMEM средств массовой информации.
    2. День 2: В день трансфекции, использовать 3 мкг ретровирусных векторов на лунку. Аликвоты 3 мкг ретровирусного вектора в 1,5 мл пробирку. Используйте смесь М 100; л DMEM плюс 6 мкл реагента для трансфекции для каждого 3 мкг вектора. Смешайте 6 мкл реагента для трансфекции с 100 мкл DMEM в 1,5 мл пробирку. (В ретровирусные векторы, которые используются, перечислены в таблице оборудование / Материалы).
      1. Инкубировать в течение 5 мин и добавляют 106 мкл смеси в предварительно аликвоты пробирку, содержащую 3 мкг ретровирусного вектора. Смешайте и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавить весь этот каплям смесь в каждую лунку Феникса клеток.
    3. День 3: На следующий день после трансфекции, удалить носитель из Феникса клеток и добавить 2 мл свежей полной DMEM средств массовой информации. В тот же день, семена первичных кератиноцитов человека в 6-луночных планшетах при плотности 75000 клеток на лунку. Поддержание кератиноцитов в свободной среде кератиноцитов в сыворотке крови (KCSFM) с антибиотиками (ручка / стрептококк).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные кератиноциты человека были приобретены. Клетки могут быть приобретены из различных поставщиков (перечисленных в таблице материалов / оборудования).
    4. День 4: Харжилет СМИ из трансфицированных феникс клеток, которые в настоящее время содержит вирусные частицы. Пропустите через средства массовой информации 0,45 мкм фильтр, используя шприц (для удаления каких-либо загрязняющих феникса клетки) и поместите 2 мл на кератиноциты (металлизированные на 75000 клеток / лунку в предыдущий день: см шаг 2,3). Добавить hexadimethrine бромид (5 мкг / мл) в средствах массовой информации, чтобы помочь посредником инфекционного процесса. Вирусные титры ~ 1 х 10 7 ТУ / мл.
      1. Спин 6-луночных планшетах с в центрифуге при 200 х г в течение 1 ч при комнатной температуре. После спина, удалить средах, содержащих вирус и мыть клетки один раз PBS 1x, прежде чем добавлять KCSFM.
    5. День 5: заразить же партию кератиноцитов снова, как в шаге 2.4.
      Примечание: Выбор кератиноцитов с помощью препарата, если есть селектируемый маркер на ретровирусного вектора и расширить для использования в последующей анализа или заявок, таких как органотипических культур.

    3. Настройка Органотипической культур кожи

    1. Строитьорганотипической кассета из распространенных материалов, найденных в лаборатории или кассет может быть выполнена на заказ через металл изготовления магазине (2А - F). Чтобы сделать эти кассеты с 3,5 см планшета для культуры ткани, использовать прижигание удалить 1,0 см х 1,0 см квадрат от центра крышке 3,5 см чашку (2А-В). Сделайте это в стерильных условиях.
      1. Приложить кв штифты в нижней части кассеты (крышка 3.5 см чашку) с использованием четкой лак для ногтей (фиг.2с). Разрешить 5 мин для ногтей, чтобы высушить и перевернуть кассету так, что она лежит на квадратные штифтов (рис 2D). Поместите кассету в 6 см блюдо.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Площадь колышки можно приобрести из различных искусств и ремесел магазинов.
    2. Подготовьте среду роста кератиноцитов (KGM) состоит из 66% DMEM, 22% F12 Хэма, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10% FBS, 2,67 мкг / мл аденина, 40 нг / мл гидрокортизона, 10 нг / мл холерного токсина, 4,94 мкг / мл инсулина, 5 мкг / мл трансферрина, 1,36 нг / мл Трийод-L-тиронин, 10 нг / мл EGF, и 10 мкг / мл ципрофлоксацин гидрохлорид. Не фильтр СМИ через фильтр и хранят 0,22 мкм при 4 ° С до готовности к использованию.
    3. Возьмите дермы из 4-кратным ручка / стрептококк + решения PBS и мыть 2 раза в КГМ, а затем инкубировать в КГМ при 37 ° С в течение двух дней до использования.
    4. Вырезать дермы с помощью скальпеля до 1,5 см х 1,5 см по размеру куски, а затем поместить на органотипической кассеты. Поместите дермы с верхней части дермы вверх. В верхней части дермы будет та сторона, которая входит в контакт с кератиноцитами (Фигура 1В).
    5. Поместите нарезанные дермы на квадратный отверстие органотипического кассеты с верхней стороны дермы вверх (фиг.3А).
    6. Переверните весь органотипической кассету, содержащую более дермы с помощью щипцов (рис 3B). Оттепель внеклеточного матрикса решение на льду. Используйте иглу и шприц, чтобы вытянуть 100 мкл внеклеточного матрикса раствора на кассете. Добавить 5 капель на дно дермы (глянцевая сторона) и встряхивают слегка обеспечения равномерного распределения всей дермы (Фиг.3В).
    7. Разрешить 5 мин для коммерческого дополнительной решения сотовой матрицы полностью затвердеть (3С). После затвердевания, используйте щипцы, чтобы перевернуть кассету обратно старше. Добавить 4 мл КГМ на 6 см блюдо.
    8. Поместите 0.5-1 млн генетически модифицированных кератиноцитов на органотипических кассет, содержащих дермы (рис 3D).
      1. Trypsinize кератиноциты путем размещения 4 мл 0,05% трипсина на 10 см пластинах в течение 5 мин и гасят 4 мл полной DMEM средств массовой информации.
      2. Граф кератиноцитов использованием гемоцитометра и затем спин вниз при 200g в течение 5 минут. Млн Ресуспендируйте 0,5-1 клетки (в зависимости от количества клеток, имеющихся в) 90 мкмл КГМ и поставить все клетки на дерму.
        Примечание: Важно, чтобы разместить то же количество клеток дермы на течение того же эксперимента, чтобы гарантировать, что любые различия в толщине видно из эпидермиса регенерированных не из-за различий в стартовый номер клеток. Размещение менее чем 0,5 млн клеток на дермы может привести к ухудшению стратификации и дифференциации.
    9. Изменить КГМ СМИ на органотипических культур каждый день. Урожай ткани 1-14 дней после размещения кератиноцитов на дерму. Полное расслоение и дифференциация эпидермиса обычно происходит после того, как 5-й день.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Первым шагом в создании органотипической человеческую кожу, чтобы удалить эпидермис от дермы. Два неделю инкубации кожи при 37 ° С в 4х ручка / стрептококк / PBS должны позволить разделение дермы из эпидермиса (1А). Если разделения эпидермиса и дермы трудно затем поместите ткань при 37 ° C в 4-кратным ручка / стрептококк / PBS в течение другой недели, а затем попытаться снова пилинг с помощью щипцов.

Один из ключей к регенерации эпидермиса человека на нежизнеспособных дермы для того, чтобы кератиноциты размещаются на правильной стороне дермы. Дерма имеет верх и низ. В верхней части дермы сторона, которая входит в контакт с кератиноцитами в естественных условиях, а также в органотипических культур. В верхней части дермы может быть дифференцирована от нижней части дермы из-за блеска дна (Фиг.1В). Если кератиноциты размещаются непосредственно на дносторона (глянцевая) дермы, эпидермиса не будет отличать или стратифицировать должным образом. Таким образом, очень важно, чтобы в верхней части дермы (не глянцевых) вверх в органотипической кассеты. Дерма могут быть размещены непосредственно на органотипической кассеты (рис 2А - F). Кассеты, изготовленные из тканевых культур пластин должны быть стерилизованы, а УФ металлические изготавливаются кассеты могут быть автоклавного до дермы уделяется. Генетически модифицированные кератиноциты может быть помещен на дерму. В кератиноциты первоначально погружен в жидкость, так как они были размещены на дермы ресуспендировали в КГМ. Через 24 ч КГМ будет рассеянным через дерму, что позволяет кератиноциты подвергаться интерфейса воздух-жидкость, что приводит стратификации и дифференциации в эпидермисе 7 (рис 3).

РНК, белков, ДНК / хроматина, а также срезы ткани могут быть собраны из органотипических сродственных культур, которые все могут быть использованы для различных применений. ниже по течению РНК может быть использован для определения различий экспрессии генов между контролем и нокдаун / сверхэкспрессии ткани с использованием RT-количественной ПЦР, микрочипов, или РНК-Seq. ДНК / хроматина могут быть использованы для применения ДНК или чип-след. Регенерированный кожа может быть установлен в ОСТ и замороженные срезы могут быть использованы для иммуно-окрашивание или гематоксилином и эозином для оценки тканевой морфологии, экспрессии белка / локализации в контрольной и экспериментальной группах.

Пример этого показан на рисунке 4 с гематоксилином и эозином типичного органотипического культуры кожи. Отметим, что все четыре различных слоев эпидермиса образуются слоем специфической экспрессии дифференцировки родственных белков (рис 4) 11,12,14,15. Эта система может быть использована для определения воздействия повышенной экспрессией или нокдауна различных генов на эпидермис. Фиг.5 Выставки регенерированного эпидермальный ткань, которая выражает контроль, LacZ, а также ткани для сверхэкспрессированный SNAI2. Избыточная экспрессия SNAI2 привело к торможению эпидермиса дифференциации как отметил отсутствие кератина 1 (K1) окрашивания, а также потери выражения дифференциации индуцированных структурных генов, таких как TGM1 и SPRR1A (рис 5А - C) 13,22. Толщина эпидермиса показано на фиг.4 и 5, может варьироваться в пределах того же самого образца вследствие более ячеек накапливающихся в середине дермы по сравнению с периферией, когда клетки были первоначально размещены на дерму. Таким образом, средние слои, как правило, более толстого эпидермиса, тогда как периферия имеет тенденцию к более тонким. Для прямого сравнения между различными образцами должны быть по сравнению с аналогичным регионы раздела. Тем не менее, окрашивание на маркеры должны оставаться последовательным.

</ HTML"Рисунок 1" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 53280 / 53280fig1.jpg" />
Рисунок 1. Приготовление дермы из человеческой кожи. (А) После инкубации в коже человека при 37 ° С в течение 2 недель, дермы может быть отделена от эпидермиса. Щипцы используются, чтобы очистить эпидермис (коричневые цвета) от дермы (белый). (Б) В верхней части дермы можно отличить от нижней по блеска ткани. В верхней части дермы (сторона, которая, естественно, будет сталкиваться эпидермис в естественных условиях, или когда кератиноциты будут посеяны) не глянцевый. В нижней части дермы глянцевый. Ткань розовый из-за инкубации в КГМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Figure 2. Генерирование органотипических кассет. (А) С помощью прижигание удалить 1,0 см х 1,0 см квадрат от центра крышке 3,5 см чашку. (Б) Удалить площадь от центра 3,5 см блюдо. (С) Используйте четкие ногтей придерживаться квадратных колышки. Разрешить 5 мин для ногтей, чтобы высохнуть. (D) Флип крышку так, что она лежит на квадратные штифтов. Кассета готова к использованию. (Е) Изображение из металла изготовлены органотипической кассету с его размерами. (F) Изображение из металла, изготовленного кассеты перевернул с ног на голову, чтобы показать поддержку колышки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Генерация organotypic культуры кожи. (A) Поместите дермы с верхней части дермы (не глянцевой стороной) вверх на органотипической кассеты. (Б) Флип кассету снова и добавить Матригель глянцевой стороне дермы. (С) Разрешить 5 мин для Матригель укрепить, а затем переверните кассету обратно старше. (D) Добавить генетически модифицированных кератиноцитов в дерму (0,5-1 млн клетки ресуспендировали в 90 мкл KGM). Урожай ткани 1-14 дней после посева кератиноцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. гематоксилин-эозином органотипической культур кожи. Регенерированную человеческая кожа содержит как эпидермиса и дермы. Эпидермисявляется полностью расслаиваются и дифференцированный 4 отдельных слоев. Эти слои включают недифференцированные базального слоя и 3 дифференцированные слои, включая слой Spinosum, гранулемы и слоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Иммунофлуоресценции окрашивание и анализ экспрессии генов генетически модифицированных эпидермиса человека. (А) Сверхэкспрессия SNAI2 ингибирует эпидермального дифференциации. Окрашивание для дифференциации белка кератина 1 (K1) показана на зеленый и ядер отмечен синим цветом (Hoechst). (B), РТ-КПЦР анализ на уровне мРНК SNAI2 в контрольной LacZ и SNAI2 гиперэкспрессией ткани. Усы = SD, п = 3. (С) РТ-КПЦР анализ мРНКуровни дифференциации транскриптов KRT1, TGM1 и SPRR1A в контрольной LacZ и SNAI2 гиперэкспрессией ткани. Усы = SD, п = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Генетические манипуляции в коже человека органотипической культуры предлагают много преимуществ обычно рассматривается 2D культивированных клеток, а также модели мыши. 2D культуры не имеют трехмерные клеточно-клетка и клетка-внеклеточный взаимодействия матрицы, найденной в интактных тканей и органов. Последние исследования также обнаружили огромные различия между 2D и 3D культивированных раковых клеток кожи с культивируемых клеток 3D, показывая намного больше экспрессии генов сходство с первичной человеческой опухолей кожи 16. Человека органотипической культуры кожи также имеют ряд преимуществ перед моделями мыши. Мышиные модели требуют много времени и дорого создавать, а также несколько известных различий между человеком и кожи мыши. Они включают различные текучесть ткани, а также толщину эпидермиса между мышиных и человеческих эпидермиса 8. Благодаря новым технологиям, возникающие, например, CRISPR-CAS, специфические гены могут быть изменены / мутировал моделировать заболевания человека кожи, используя органотипической КУЛЬТУРА кожиES 23. Кроме того, гены могут быть доставлены или сбит в этих клетках через широкий спектр методов, кроме ретровирусного переноса гена, описанного здесь. Пока есть надежный доставка через высокую эффективность трансдукции или отбора наркотиков, могут быть использованы метод. Эти методы доставки включают nucleofection из киРНК, Lentiviral, аденоассоциированный вирус, и адено вирус 11,12,24-26.

Культуры Органотипической кожи могут быть изменены путем добавления различных типов клеток в системе. Например, нормальные или генетически измененные фибробласты человека могут быть добавлены к омертвевших дермы изучать мезенхимальных и эпителиальных перекрестных помех. Иммунные клетки также могут быть добавлены в дерму, чтобы изучить воспалительный ответ на возмущений в коже. Одним из ограничений системы является то, что процесс десквамации, что происходит в естественных условиях не встречается в органотипических культур. Это предотвращает использование этих культур на длительный срок и большей анализаделается в пределах 1-14 дней после посева клеток эпидермиса. Для долгосрочных анализах органотипической культуры могут быть привиты на спины иммунных скомпрометированных мышей 17,27.

Органотипической кожи культура представлена ​​здесь уникальна тем, что она использует нетронутыми девитальных человека дермы, который является естественным субстратом эпидермиса в естественных условиях в то время как большинство других систем использовать коллаген или Матригель в качестве субстрата 28. Настройка органотипических культур кожи с использованием подложек, таких как результаты матригеля в тонкой и менее прочной стратификации эпидермиса в нашем опыте. Дерма содержит подвал белки мембраны зоны в том числе ламинин и коллаген, который позволяет клетки эпидермиса приложить, размножаются, дифференцируются и стратификации 29. Использование дермы позволяет поколения эпидермиса, который имитирует их аналогов в естественных условиях. Таким образом, органотипической культуры кожи может быть чрезвычайно ценным в токсикологических и фармакологических сtudies в тех случаях, когда исследования на животных не допускаются (косметической промышленности) 30.

Использование девитальных дермы также поставляется с собственными недостатками, начиная с толщины дермы между различными донорами или даже в пределах одного донора может варьироваться. Клетки эпидермиса, выращенные на толстых дермы, как правило, не размножаются и генерировать толщиной эпидермиса, как клетки, выращенные на тонких дермы. Таким образом, важно, чтобы выбрать аналогичные толщина дермы при настройке эксперименты, сравнивающие несколько образцов. Другим важным параметром является, чтобы отобрать такое же количество клеток эпидермиса при сравнении различных групп, так что любые различия видны не из-за различий в начального числа клеток, посеянных.

В заключение, органотипической культура кожа может служить передовым и эффективным в модели пробирке для проверки молекулярных путей в более физиологической контексте, что в конечном итоге ускорит понимание генов регуляторной Mechanизмы, которые важны в эпидермального роста и дифференцировки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была supportedby Американское общество рака научных работников Грант (RSG-12-148-01-DDC) и биологии премии МКМР Basic (RB4-05779).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human skin New York Firefighters Skin Bank http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP GIBCO 15140-122
amphotropic phoenix cell lines ATCC CRL-3213
FUGENE 6 transfection reagent Promega E2691
Keratinocyte Media (KCSFM) Life Technologies 17005042
DMEM GIBCO 11995
Ham's F12 Cambrex 12-615F
FBS GIBCO 10437-028
Adenine Sigma A-9795
Cholera Toxin Sigma  C-8052
Hydrocortisone Calbiochem 3896
Insulin Sigma I-1882
EGF Invitrogen 13247-051
Transferrin  Sigma T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride Serologicals 89-001-1
cautery Bovie Medical Corporation AA01
Matrigel Corning 354234
Keratin 1 antibody Biolegend PRB-149P
square pegs Arts and crafts stores
human neonatal keratinocytes ATCC PCS-200-010
human neonatal keratinocytes Cell Applications 102K-05n
MSCV retroviral vector Clontech 634401
LZRS retroviral vector Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector Oligoengine VEC-PRT-0002 
hexadimethrine bromide  Sigma H9268-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
  2. Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
  3. Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
  4. Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
  5. Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
  6. Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
  7. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
  8. Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
  9. Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
  10. Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14 (2013).
  11. Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
  12. Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
  13. Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
  14. Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
  15. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
  16. Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
  17. Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
  18. Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
  19. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
  20. Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
  21. Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
  22. Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
  23. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  24. Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
  25. Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
  26. Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
  27. Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
  28. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
  29. Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
  30. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).

Tags

Биология развития выпуск 106 органотипической кожа генетика РНК-интерференция ретровируса избыточная экспрессия кератиноциты фибробласты дерма эпидермис трансдукция конструкции кожи стратифицированная эпителия эпителия дерматология SNAI2 эпителиальных мезенхимальных перехода к
Генерация генетически модифицированных культур Органотипической кожи Использование нежизнеспособных Human дермы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, J., Sen, G. L. Generation of… More

Li, J., Sen, G. L. Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis. J. Vis. Exp. (106), e53280, doi:10.3791/53280 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter