Abstract
Organotypiske kulturer tillate omdanning av et 3D-miljø kritisk for celle-celle-kontakt og celle-matriks-interaksjoner som etterligner den fysiologiske funksjon og deres in vivo vev motstykker. Dette er eksemplifisert ved organotypiske hud kulturer som trofast rekapitulerer epidermal differensiering og stratifisering program. Primære human epidermal keratinocytter er genetisk manipulable gjennom retrovirus hvor gener kan lett overuttrykt eller slått ned. Disse genetisk modifiserte keratinocytter kan deretter brukes til å regenerere human epidermis i organotypiske hud kulturer som gir en kraftig modell for å studere genetisk trasé slag epidermal vekst, differensiering og utvikling av sykdommen. Protokollene som er presentert her for å beskrive fremgangsmåter for å fremstille devitalized menneskehuden, så vel som for å genetisk manipulere primære humane keratinocytter for å generere organotypiske hud kulturer. Regenereres menneskelig hud kan brukes i downstrEAM applikasjoner som genekspresjon profilering, farging, og kromatin immunoutfellinger etterfulgt av høy gjennomstrømming sekvensering. Således vil dannelse av slike genetisk modifiserte organotypiske hud kulturer tillate bestemmelse av gener som er kritisk for å opprettholde homeostase hud.
Introduction
De menneskelige epidermis er et stratifisert epitel som kobles til de underliggende dermis gjennom en ekstracellulær matrise kjent som den basalmembran zone.The epidermis ikke bare tjener som en ugjennomtrengelig barriere for å hindre tap av fuktighet, men også som en første forsvarslinje for å beskytte kroppen fra utenlandske og giftige stoffer 1. Basallaget, som er det dypeste lag av epidermis, inneholder epidermal stamceller og forløperceller som gir opphav til den differensierte avkom som danner resten av epidermis 2. Som epidermale progenitorceller differensiere de vandrer oppover for å danne det første sjikt av differensierte celler som kalles spinous laget 3. I spinous lag, celler slå på ekspresjon av keratin 1 og 10, som deretter gir styrke til å motstå fysisk stress for de differensierte lag av epidermis. Som spinous lagscellene ytterligere differensiere, de beveger seg oppover i epidermis til form den granulære lag som er karakterisert ved dannelse av keratohyalin og lamellære granuler, så vel som strukturelle proteiner som er montert under plasmamembranen. Ettersom cellene gå frem på denne differensieringsprosessen proteinene under plasmamembranen er kryss knyttet til hverandre mens de lamellære granuler ekstrudert fra cellene for å danne en lipid rik barriere kalt stratum corneum 4.
Sykdommer som involverer endringer i epidermal vekst og differensiering innvirkning ~ 20% av befolkningen 5. Således forstå mekanismene for denne fremgangsmåte er av stor betydning. Siden manifestasjon av mange av disse sykdommene er betinget av celle-celle eller celle-matriks kontakt, har organotypiske kulturer hvor human epidermis blir rekonstituert i et 3D-miljø er skapt 6-10. Disse fremgangsmåtene involverer typisk bruken av primære eller transform keratinocytter sådd på ekstracellulær matriks som devitalized humandermis, Matrigel eller kollagen.
For å forstå gen regulerende mekanismer som er viktige i epidermal vekst og differensiering, kan keratinocytter være genetisk manipulert gjennom retrovirale vektorer til knockdown eller overuttrykke gener i 2D kultur og deretter rekonstituert i 3D. Disse metodene har vært brukt mye til å karakterisere gener involvert i epidermal stilk og stamcelleselvfornyelse og differensiering samt progresjon til neoplasi 11-21. Her er en grundig protokollen på hvordan å endre genuttrykk i epidermal organotypiske kulturer gjennom bruk av retrovirus gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den menneskelige huden protokollen ble utført i samsvar med retningslinjene fra University of California, San Diego forskningsetiske komité. Menneskelig hud kan fås fra kasserte kirurgiske prøver eller kjøpt fra hud banker (hud bank er oppført i tabellen materiell / utstyr). Stedet hvor huden er avledet fra eller alder av donor er ikke kritisk for forsøket så lenge basalmembransonen proteiner (kollagen / laminin) i dermis ikke er degradert.
1. Utarbeidelse av devitalized menneske Dermis
- Ved mottak av menneskelig hud, plasserer vevet i panseret vevskultur å tine (~ 3-5 min). Avhengig av størrelsen av huden, plasserer tines vevet i en steril engangs 50 ml konisk rør eller 125 ml flaske. Den typiske størrelsen på huden fra huden bank er 0,75 kvadratfot.
- Fyll beholderen 75% full med 4x penicillin og streptomycin (penn / strep) i 1x PBS. Rist kraftig for5 min og kast av væsken. Gjenta dette trinnet 3 flere ganger.
- Etter siste vask, overføre vevet til et nytt rør / flaske og tilsett friskt 4x pen / strep / PBS for å fylle 75% av beholderen. Inkuber denne blandingen i en vevskulturinkubator ved 37 ° C i 2 uker for å tillate separasjon av dermis fra epidermis.
- Under sterile forhold Bruk pinsett til å skrelle bort epidermis fra dermis. Dermis er helt hvit, mens overhuden vil ha farge avhengig av rase av donor (figur 1A). Kast epidermis henhold til institusjonens protokoll for å håndtere menneskelig vev.
- Plasser dermis i en tube eller flaske og vaske den i 4x penn / strep fortynnet i 1x PBS med kraftige skjelv (5 min vasker for 4 ganger). Etter siste vask, overføre dermis til et nytt rør / flaske i 4x penn / strep fortynnet i 1x PBS og oppbevares ved 4 ° C til den er klar til bruk. Dermis kan lagres ved 4 ° C i opptil et år. 2. genetisk modifisere Primary humane keratinocytter
- Dag 1: Dagen før transfeksjon, frø Phoenix celler i en 6-brønn plate med en tetthet på 800.000 celler per brønn i fullstendig DMEM media.
- Dag 2: Dagen for transfeksjon, bruke 3 ug retrovirusvektorer per brønn. Alikvot 3 ug av retrovirale vektor i et 1,5 ml rør. Bruk en blanding av 100 μ; l DMEM pluss 6 pl av reagens transfeksjon for hver 3 ug av vektor. Bland 6 pl av reagens transfeksjon med 100 ul DMEM i et 1,5 ml rør. (De retrovirusvektorer som brukes, er oppført i utstyr / materialer tabell).
- Inkuber i 5 min og tilsett 106 ul blandingen inn i pre-porsjonert rør inneholdende 3 mikrogram av retroviral vektor. Bland og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Legg hele denne blanding tilsatt til hver brønn av Phoenix cellene.
- Dag 3: Dagen etter transfeksjon, fjerne medier fra phoenix celler og tilsett 2 ml fersk komplett DMEM media. På samme dag, frø primære humane keratinocytter i 6-brønners plater i en tetthet på 75.000 celler per brønn. Oppretthold keratinocytter i en keratinocyte serumfritt medium (KCSFM) med antibiotika (penn / strep).
MERK: Primære humane keratinocytter ble kjøpt. Celler kan kjøpes fra en rekke leverandører (oppført i materiell / utstyr tabell). - Dag 4: Harinnvunnet media fra de transfekterte phoenix celler, som nå inneholder viruspartikler. Passere media gjennom et 0,45 mikrometer filter ved hjelp av en sprøyte (for å fjerne eventuelle forurensende phoenix celler) og plassere 2 ml på keratinocytter (belagt på 75.000 celler / brønn gårsdagen: se trinn 2.3). Legg hexadimethrine bromide (5 mikrogram / ml) til media for å hjelpe megle infeksjonen prosessen. Virustiter er ~ 1 x 10 7 TU / ml.
- Spinn 6-brønns plater i en sentrifuge ved 200 xg i 1 time ved RT. Etter spin, fjerne medier som inneholder virus og vaske cellene gang med 1x PBS før du legger KCSFM.
- Dag 5: Infisere den samme batch av keratinocytter igjen som i trinn 2.4.
MERK: Velg keratinocyttene ved å bruke et stoff hvis det er en selekterbar markør på retrovirale vektor og ekspandere for bruk i nedstrøms analyse eller applikasjoner som organotypiske kulturer. - Byggeorganotypiske kassett fra vanlige materialer som finnes i laboratoriet eller kassettene kan være skreddersydde gjennom en metall fabrikasjon butikk (Figur 2A - F). For å gjøre disse kassettene fra en 3,5 cm vevskulturplate, bruker en kirurgi for å fjerne et 1,0 cm x 1,0 cm i firkant fra sentrum av lokket på en 3,5 cm plate (figur 2A-B). Gjør dette under sterile forhold.
- Fest firkantede plugger til bunnen av kassetten (lokk på 3,5 cm plate) ved bruk av klar neglelakk (figur 2C). Tillat 5 min for neglelakk tørke og snu kassetten over slik at den hviler på de firkantede pinnene (figur 2D). Sett kassetten inn i en 6 cm parabolen.
MERK: Square plugger kan kjøpes fra en rekke kunst- og håndverksbutikker.
- Fest firkantede plugger til bunnen av kassetten (lokk på 3,5 cm plate) ved bruk av klar neglelakk (figur 2C). Tillat 5 min for neglelakk tørke og snu kassetten over slik at den hviler på de firkantede pinnene (figur 2D). Sett kassetten inn i en 6 cm parabolen.
- Forbered keratinocytt-vekstmedium (KGM) bestående av 66% DMEM, 22% Hams F12, 100 enheter / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10% FBS, 2,67 ug / ml adenin, 40 ng / ml hydrokortison, 10 ng / ml koleratoksin, 4,94 ug / ml insulin, 5 ug / ml transferrin, 1,36 ng / ml trijod-L-thyronin, 10 ng / ml EGF og 10 ug / ml ciprofloksacin hydroklorid. Filter media gjennom et 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C til den er klar til bruk.
- Ta dermis ut av 4x pen / strep + PBS-løsning og vask 2 ganger i KGM og deretter inkuberes i KGM ved 37 ° C i to dager før bruk.
- Skjær dermis ved hjelp av en skalpell til 1,5 cm x 1,5 cm store biter og legg på organotypiske kassett. Plasser dermis med toppen av dermis vendt opp. Toppen av dermis vil være den side som kommer i kontakt med keratinocytter (figur 1B).
- Plasser pre-cut dermis på torget hullet på organotypiske kassetten med oversiden av dermis vendt opp (figur 3A).
- Vend hele organotypiske kassett som inneholder dermis enn å bruke pinsett (Figur 3B). Tine den ekstracellulære matrise løsning på is. Bruke en nål og sprøyte til å trekke ut 100 ul av ekstracellulær matriks oppløsning pr kassett. 5 dråper til bunnen av dermis (blank side) og rist litt for å sikre jevn fordeling gjennom dermis (figur 3B).
- Vent 5 min for den kommersielle ekstra matriks løsning helt stivne (Figur 3C). Etter størkning, bruke tang for å snu kassetten tilbake over. Tilsett 4 ml KGM til 6 cm parabolen.
- Plasser 0,5-1 millioner genmodifiserte keratinocytter på de organotypiske kassetter som inneholder dermis (Figur 3D).
- Trypsineres keratinocytter ved å plassere 4 ml 0,05% trypsin på 10 cm plater i 5 min og tilsett 4 ml komplett DMEM medier.
- Telle keratinocyttene ved bruk av et hemocytometer og så spinne ned ved 200 xg i 5 minutter. Suspender 0,5-1 millioner celler (avhengig av antallet celler som er tilgjengelige) i 90 μl KGM og plassere alle cellene på dermis.
Merk: Det er viktig å plassere det samme antall celler i dermis i det samme eksperiment for å sikre at eventuelle forskjeller sett i tykkelsen av regenerert epidermis er ikke på grunn av forskjeller i startcellenummer. Plassere mindre enn 0,5 millioner celler i dermis kan føre til dårlig lagdeling og differensiering.
- Endre kgm media på organotypiske kulturer annenhver dag. Avling vev 1-14 dager etter plassering av keratinocytter i dermis. Full stratifisering og differensiering av epidermis oppstår vanligvis etter dag fem.
MERK: Bruk amfotrofiske Phoenix celler dyrket i fullstendig DMEM medium [DMEM + 10% føtalt bovint serum (FBS) + pen / strep] for å produsere virus for å infisere primære humane keratinocytter. Virale emballasje gener som koder for proteiner, slik som gag-pol og konvolutten er stabilt integrert inn i det Phoenix cellegenomet som gjør det mulig for virusproduksjon når transfektert med en retroviral vektor. Phoenix celler kan bli transfektert med høy effektivitet slik at for høy viral titer produksjon. Virus produsert fra denne pakkelinjen kan også infisere et stort utvalg av pattedyrceller, inkludert menneske.
3. Sette opp organotypiske Skin kulturer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det første trinnet i å generere organotypiske human hud er å fjerne epidermis fra dermis. De to ukers inkubering av huden ved 37 ° C i 4 x pen / strep / PBS bør tillate separasjon av dermis fra epidermis (figur 1A). Hvis skille epidermis og dermis er vanskelig deretter plassere vevet ved 37 ° C i 4x penn / strep / PBS for en uke, og deretter prøve peeling igjen med tang.
En av nøklene til regenerering av human epidermis på devitalized dermis er å sikre at keratinocytter er plassert på riktig side av dermis. Dermis har en topp og en bunn. Toppen av dermis er den siden som kommer i kontakt med keratinocytter in vivo så vel som i organotypiske kulturer. Toppen av dermis kan skilles fra bunnen av dermis på grunn av glans av bunnen (figur 1B). Hvis keratinocytter er plassert direkte på bunnenside (blank) av dermis, epidermis ikke vil skille eller stratifisere riktig. Således er det viktig å ha toppen av dermis (ikke-blank) vendt opp i organotypiske kassetten. Dermis kan plasseres direkte på en organotypiske kassett (figur 2A - F). Kassetter laget av vevskulturplater bør UV-steriliseres mens metall fremstilt kassetter kan autoklaveres før dermis blir plassert på. De genetisk modifiserte keratinocytter kan deretter plasseres på dermis. Keratinocyttene blir først nedsenket i væsken, siden de ble plassert på dermis resuspendert i KGM. Etter 24 timer ble KGM vil ha diffundert gjennom dermis som gjør keratinocytter å bli utsatt for luft-væske-grensesnittet som fører til lagdeling og differensiering i epidermis 7 (figur 3).
RNA, kan protein, DNA / kromatin, samt vevssnitt bli høstet fra organotypiske sKin kulturer som alle kan brukes til en rekke av nedstrøms applikasjoner. RNA kan brukes til å bestemme genekspresjon forskjeller mellom kontroll og knockdown / overekspresjon vev ved hjelp av RT-QPCR, mikromatriser eller RNA-Seq. DNA / kromatin kan brukes til DNA eller chip-applikasjoner Seq. Den regenererte hud kan monteres i oktober og frosne seksjoner kan brukes for immunofarging eller hematoxylin og eosin-farging for å vurdere vev morfologi, protein ekspresjon / lokalisering i kontroll og eksperimentelle grupper.
Et eksempel på dette er vist i figur 4 med hematoxylin og eosin farging av et typisk organotypiske hud kultur. Legg merke til at alle de fire forskjellige lag av epidermis er utformet med sjikt spesifikk ekspresjon av differensierings relaterte proteiner (figur 4) 11,12,14,15. Dette systemet kan brukes til å bestemme virkningene av overekspresjon eller knockdown forskjellige gener på epidermis. Figur 5 viser regenerert epidermal vev som uttrykker kontroll, LacZ samt vev overuttrykkes for SNAI2. Overekspresjon av SNAI2 førte til en inhibering av epidermal differensiering slik det fremgår av mangelen på keratin 1 (K1) farging, så vel som tap av ekspresjon av differensierings indusert strukturelle gener som TGM1 og SPRR1A (figur 5A - C) 13,22. Epidermal tykkelse er vist i figur 4 og figur 5, kan variere innenfor den samme prøve på grunn av flere celler akkumulert seg i midten av dermis versus periferien når cellene ble opprinnelig plassert på dermis. Således er de midtre deler har en tendens til å ha tykkere epidermis, mens periferien har en tendens til å ha tynnere. For direkte sammenligning mellom forskjellige prøver de samme regioner i en seksjon skal sammenlignes. Imidlertid bør farging for markørene være konsekvent.
"Figur 1" src = "/ filer / ftp_upload / 53280 / 53280fig1.jpg" />
Figur 1. Fremstilling av dermis fra human hud. (A) Etter inkubering av den menneskelige hud ved 37 ° C i 2 uker, dermis kan skilles fra epidermis. Tang brukes til å skrelle epidermis (brun farget) fra dermis (hvit). (B) Den øverste av dermis kan skilles fra bunnen av glans av vevet. Toppen av dermis (den siden som naturlig vil møte epidermis in vivo eller hvor keratinocytter blir seedet) er ikke-blank. Bunnen av dermis er blank. Vevet er rosa på grunn av inkubasjon i KGM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. generasjon av organotypiske kassetter. (A) Bruk en kirurgi for å fjerne en 1,0 cm x 1,0 cm firkantet fra midten av lokket på en 3,5 cm tallerken. (B) Ta plassen fra sentrum av den 3,5 cm parabolen. (C) Bruk klar neglelakk å følge firkantede knagger. Tillat 5 min for neglelakk tørke. (D) Vend lokk over slik at den hviler på de firkantede knagger. Kassetten er nå klar til å bli brukt. (E) Bilde av et metall fremstilt organotypiske kassetten med dens dimensjoner. (F) Bilde av en metall fabrikkert kassett snudd opp ned for å vise støtte knagger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. generasjon organotypic hud kulturer. (A) Plasser dermis med toppen av dermis (ikke-blanke siden) vender opp på organotypiske kassett. (B) Vend kassetten over og legge Matrigel til den blanke siden av dermis. (C) La 5 min for Matrigel å stivne og deretter snu kassetten tilbake over. (D) Tilsett genetisk modifisert keratinocytter til dermis (0,5-1 million celler blir resuspendert i 90 pl av KGM). Høste vev 1-14 dager etter såing av keratinocytter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Hematoxylin og eosin farging av hud organotypiske kulturer. Regenerert human hud inneholder både epidermis og dermis. Den epidermer er fullt lagdelt og differensiert med 4 forskjellige lag. Disse lagene inkluderer udifferensiert basal laget og de 3 differensierte lag inkludert stratum spinosum, granulosum og corneum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Immunfluorescens farging og genuttrykk analyse av genmodifiserte menneskehuden. (A) Overuttrykte SNAI2 hemmer epidermal differensiering. Farging for differensiering protein keratin 1 (K1) er vist i grønt og kjerner er merket i blått (Hoechst). (B) RT-QPCR analyse på mRNA nivåer av SNAI2 i kontroll LacZ og SNAI2 overuttrykke vev. Feilfelt = SD, n = 3 (C) RT-QPCR analyse på mRNAnivåer av differensiering transkripsjoner KRT1, TGM1, og SPRR1A i kontroll LacZ og SNAI2 overuttrykke vev. Feilfelt = SD, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetisk manipulasjon i human hud organotypiske kulturer tilbyr mange fordeler på vanlige studert 2D dyrkede celler samt musemodeller. 2D kulturer mangler de tredimensjonale celle-celle og celle-ekstracellulær matriks-interaksjoner er funnet i intakt vev og organer. Nyere studier har også funnet store forskjeller mellom 2D- og 3D-dyrkede hud kreftceller med 3D-dyrkede celler som viser mye mer genuttrykk likheter til primær menneskelig hud svulster 16. Humane organotypiske hud kulturer har også flere fordeler i forhold til musemodeller. Musemodeller er tidkrevende og kostbart å produsere, samt flere betydelige forskjeller mellom human og mus hud. Disse omfatter forskjellige vev Omsetningshastigheten så vel som tykkelsen av epidermis mellom murine og humane epidermis 8. Med nye teknologier dukker som CRISPR-CAS, kan spesifikke gener endres / mutert til å modellere menneskelige hudsykdommer som bruker organotypiske huden cultures 23. Videre kan genene leveres eller slått ned i disse celler gjennom en rekke forskjellige fremgangsmåter i tillegg til de retroviral genoverføring beskrevet her. Så lenge det er robust levering gjennom høy virkningsgrad transduksjon eller medikamentseleksjon, kan metoden bli benyttet. Disse leveringsmåter inkluderer nucleofection av siRNAs, lentiviral, adenoassociated virus, og adeno virus 11,12,24-26.
De organotypiske huden kulturene kan modifiseres ved tilsetning av forskjellige celletyper til systemet. For eksempel kan normale eller genetisk endrede humane fibroblaster legges til devitalized dermis å studere mesenchymale og epitel crosstalk. Immunceller kan også tilsettes til dermis for å studere den inflammatoriske respons på forstyrrelser i huden. En begrensning av systemet er at avskalling prosess som skjer in vivo ikke forekommer i organotypiske kulturer. Dette hindrer bruken av disse kulturene for langvarige og mest analyseutføres mellom 1-14 dager etter såing av de epidermale celler. For lengre sikt analyser, kan de organotypiske kulturer bli podet på ryggen av immun kompromittert mus 17,27.
Huden organotypiske kulturen presenteres her er unik ved at den anvender intakte devitalized menneskehuden, som er det naturlige substrat av epidermis in vivo, mens de fleste andre systemer bruker kollagen eller Matrigel som substrat 28. Oppsett av organotypiske hud kulturer som bruker underlag som matrigel resultater i tynnere og mindre robust lagdeling av epidermis i vår erfaring. Dermis inneholder kjeller membran sone proteiner inkludert laminin og kollagen som gjør at epidermal cellene å feste, spre seg, skille, og stratify 29. Bruk av dermis muliggjør generering av epidermis som etterligner deres in vivo motstykke. Dermed kan organotypiske hud kulturer være svært verdifull i toksikologiske og farmakologiske studies i tilfeller der dyrestudier ikke er tillatt (kosmetikkindustrien) 30.
Ved hjelp av devitalized dermis kommer også med sine egne ulemper, siden tykkelsen av dermis mellom forskjellige givere eller til og med innenfor samme donor kan variere. Epidermale celler dyrket på tykke dermis en tendens til å ikke spre seg og generere så tykk av epidermis som celler dyrket på tynnere dermis. Dermed er det viktig å velge tilsvarende tykkelse dermis under konfigureringen av eksperimenter som sammenligner flere prøver. En annen viktig parameter er til frø samme antall epidermale celler når man sammenligner forskjellige grupper, slik at eventuelle forskjeller ses ikke på grunn av forskjeller i første rekke celler sådd.
Som konklusjon kan det organotypiske huden kultur tjener som en avansert og effektiv in vitro modell for å validere molekylære reaksjonsveier i en mer fysiologisk sammenheng, som til slutt vil akselerere forståelsen av genet regulatoriske mechanismer som er viktige i epidermal vekst og differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet var supportedby American Cancer Society stipendiater Grant (RSG-12-148-01-DDC) og CIRM Basic Biology Award (RB4-05779).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html | |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 | |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 | |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 | |
| DMEM | GIBCO | 11995 | |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F | |
| FBS | GIBCO | 10437-028 | |
| Adenine | Sigma | A-9795 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 | |
| Insulin | Sigma | I-1882 | |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 | |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P | |
| square pegs | Arts and crafts stores | ||
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n | |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 | |
| LZRS retroviral vector | Addgene | ||
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A.
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E.
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A.
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V.
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
