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Developmental Biology

निष्प्राण मानव डर्मिस का प्रयोग आनुवंशिक रूप से संशोधित Organotypic त्वचा संस्कृतियों की पीढ़ी

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53280
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Dermatology, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego

Abstract

Organotypic संस्कृतियों समारोह और उनके vivo ऊतक समकक्षों के शरीर क्रिया विज्ञान mimics जो सेल सेल से संपर्क करें और सेल-मैट्रिक्स बातचीत के लिए महत्वपूर्ण एक 3 डी वातावरण के पुनर्गठन की अनुमति देते हैं। यह ईमानदारी से एपिडर्मल भेदभाव और स्तरीकरण कार्यक्रम का स्मरण दिलाता है जो organotypic त्वचा संस्कृतियों द्वारा उदाहरण है। प्राथमिक मानव एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं जीन आसानी overexpressed या नीचे गिरा दिया जा सकता है जहां रेट्रोवायरस के माध्यम से आनुवंशिक रूप से manipulable हैं। ये आनुवंशिक रूप से संशोधित केरेटिनकोशिकाओं तो आनुवंशिक रास्ते प्रभावित epidermal वृद्धि, भेदभाव, और रोग प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल उपलब्ध कराने organotypic त्वचा संस्कृतियों में मानव एपिडर्मिस को पुनर्जीवित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल निष्प्राण मानव डर्मिस तैयार के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए आनुवंशिक रूप से organotypic त्वचा संस्कृतियों उत्पन्न करने के क्रम में प्राथमिक मानव केरेटिनकोशिकाओं में हेरफेर करने की विधियों का वर्णन। पुनर्जीवित मानव त्वचा downstr में इस्तेमाल किया जा सकताइस तरह के जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा, immunostaining, और उच्च throughput अनुक्रमण के द्वारा पीछा क्रोमेटिन immunoprecipitations के रूप में विदेश मंत्री अनुप्रयोगों। इस प्रकार, इन आनुवंशिक रूप से संशोधित organotypic त्वचा संस्कृतियों की पीढ़ी त्वचा homeostasis को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि जीन के निर्धारण के लिए अनुमति देगा।

Introduction

मानव एपिडर्मिस ही नहीं बल्कि रक्षा के लिए रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में नमी की हानि को रोकने के लिए एक अभेद्य अवरोध के रूप में कार्य करता है तहखाने झिल्ली zone.The एपिडर्मिस के रूप में जाना जाता है एक बाह्य मैट्रिक्स के माध्यम से अंतर्निहित डर्मिस को जोड़ता है कि एक स्तरीकृत उपकला है विदेशी और विषाक्त पदार्थों को 1 से शरीर। एपिडर्मिस की गहरी परत है जो बेसल परत, एपिडर्मिस 2 के बाकी है कि फार्म विभेदित संतान को जन्म दे कि एपिडर्मल स्टेम और पूर्वज सेल शामिल हैं। एपिडर्मल पूर्वज कोशिकाओं को अलग रूप में वे spinous परत 3 के रूप में जाना जाता है विभेदित कोशिकाओं की पहली परत के रूप में ऊपर की तरफ पलायन। Spinous परत में, कोशिकाओं तो एपिडर्मिस की विभेदित परतों के लिए शारीरिक तनाव को झेलने की शक्ति प्रदान करते हैं, जो keratins 1 और 10 की अभिव्यक्ति, पर बारी। Spinous परत की कोशिकाओं को आगे अंतर के रूप में, वे करने के लिए एपिडर्मिस में ऊपर की तरफ कदमप्लाज्मा झिल्ली के नीचे इकट्ठा कर रहे हैं कि keratohyalin और परतदार कणिकाओं के गठन के साथ ही संरचनात्मक प्रोटीन द्वारा होती है जो बारीक परत हूँ। कोशिकाओं भेदभाव प्रक्रिया में आगे बढ़ने के रूप में परतदार कणिकाओं अमीर बाधा परत corneum 4 नामक एक लिपिड फार्म के लिए कोशिकाओं से चली जाती हैं, जबकि प्लाज्मा झिल्ली के नीचे प्रोटीन एक दूसरे से जुड़े पार कर रहे हैं।

Epidermal वृद्धि और भेदभाव प्रभाव ~ जनसंख्या 5 के 20% में परिवर्तन शामिल है कि रोग। इस प्रकार, इस प्रक्रिया के तंत्र को समझने के लिए काफी महत्व की है। इन रोगों के कई की अभिव्यक्ति सेल सेल या सेल मैट्रिक्स संपर्क पर प्रासंगिक है के बाद से, मानव एपिडर्मिस एक 3 डी वातावरण में पुनर्गठन किया गया है जहां organotypic संस्कृतियों 6-10 बनाया गया है। इन तरीकों में आम तौर पर इस तरह के निष्प्राण मानव के रूप में बाह्य मैट्रिक्स पर वरीयता प्राप्त प्राथमिक या बदल केरेटिनकोशिकाओं के इस्तेमाल को शामिलडर्मिस, Matrigel, या कोलेजन।

Epidermal वृद्धि और भेदभाव में महत्वपूर्ण हैं कि जीन विनियामक तंत्र को समझने के लिए, केरेटिनकोशिकाओं आनुवंशिक रूप से 2 डी संस्कृति में जीन पछाड़ना या overexpress रेट्रोवायरल वाहक के माध्यम से छेड़छाड़ और उसके बाद 3 डी में पुनर्गठित किया जा सकता है। इन तरीकों में रसौली 11-21 को एपिडर्मल स्टेम और पूर्वज सेल आत्म नवीकरण और भेदभाव के साथ ही प्रगति में शामिल जीनों को चिह्नित करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। इधर, रेट्रोवायरस के प्रयोग के माध्यम एपिडर्मल organotypic संस्कृतियों में जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के बारे में एक में गहराई से प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है।

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Protocol

मानव त्वचा प्रोटोकॉल कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन डिएगो के रिसर्च आचार समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था। मानव त्वचा से खारिज शल्य नमूनों से प्राप्त या (त्वचा बैंक सामग्री / उपकरण तालिका में सूचीबद्ध है) त्वचा बैंकों से खरीदा जा सकता है। त्वचा से या दाता की आयु प्राप्त होती है, जहां पांच प्रयोग के रूप में लंबे समय के रूप डर्मिस में तहखाने झिल्ली क्षेत्र प्रोटीन (कोलेजन / laminin) के लिए महत्वपूर्ण नहीं है अपमानित नहीं कर रहे हैं।

निष्प्राण मानव डर्मिस की 1. तैयारी

  1. मानव त्वचा प्राप्त करने पर, (~ 3-5 मिनट) पिघलना करने के लिए टिशू कल्चर हुड में ऊतक जगह है। त्वचा के आकार पर निर्भर करता है, एक बाँझ डिस्पोजेबल 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब या 125 मिलीलीटर की बोतल में thawed ऊतक जगह है। त्वचा बैंक से त्वचा के विशिष्ट आकार 0.75 वर्ग फुट है।
  2. 1x पीबीएस में 4x पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / स्ट्रेप) के साथ 75% भरा कंटेनर भरें। सख्ती के लिए मंथन5 मिनट और तरल के निपटान के। इस चरण 3 बार दोहराएँ।
  3. पिछले धोने के बाद, एक नया ट्यूब / बोतल के लिए ऊतक हस्तांतरण और कंटेनर के 75% भरने के लिए नए सिरे से 4x कलम / स्ट्रेप / पीबीएस जोड़ें। 2 सप्ताह एपिडर्मिस से डर्मिस की जुदाई की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में इस मिश्रण को सेते हैं।
  4. बाँझ शर्तों के तहत, डर्मिस से एपिडर्मिस दूर छील संदंश का उपयोग करें। एपिडर्मिस दाता (चित्रा 1 ए) की जाति के आधार पर रंग होगा, जबकि डर्मिस पूरी तरह से सफेद है। मानव ऊतक से निपटने के लिए संस्था के प्रोटोकॉल के अनुसार एपिडर्मिस त्यागें।
  5. एक ट्यूब या बोतल में डर्मिस रखें और (4 बार के लिए 5 मिनट के जलरंग) जोरदार झटकों के साथ 1x पीबीएस में पतला 4x कलम / स्ट्रेप में धो। पिछले धोने के बाद, का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 4x कलम / 1x पीबीएस में पतला स्ट्रेप और दुकान में एक नया ट्यूब / बोतल के डर्मिस हस्तांतरण। डर्मिस एक साल तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    6. 2. आनुवंशिक रूप से संशोधित प्राथमिक मानव केरेटिनकोशिकाएं

    नोट: प्राथमिक मानव केरेटिनकोशिकाओं संक्रमित करने के लिए वायरस का उत्पादन करने के लिए पूरा DMEM मीडिया [DMEM + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) + कलम / स्ट्रेप] में उगाया उपयोग amphotropic फीनिक्स कोशिकाओं। इस तरह के झूठ पोल और लिफाफे के रूप में प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि वायरल पैकेजिंग जीन स्थिरतापूर्वक एक रेट्रोवायरल वेक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट जब वायरस उत्पादन के लिए अनुमति देता है जो फीनिक्स सेल जीनोम में एकीकृत कर रहे हैं। फीनिक्स कोशिकाओं उच्च दक्षता उच्च वायरल अनुमापांक उत्पादन के लिए अनुमति के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता। इस पैकेजिंग लाइन से उत्पादित वायरस भी मानव सहित स्तनधारी कोशिकाओं की एक बड़ी विविधता को संक्रमित कर सकते हैं।

    1. दिन 1: अभिकर्मक पहले दिन, पूरा DMEM मीडिया में अच्छी तरह से प्रति 800,000 कोशिकाओं के घनत्व पर 6 अच्छी तरह से थाली में बीज फीनिक्स कोशिकाओं।
    2. दिन 2: अभिकर्मक के दिन, 3 रेट्रोवायरल वैक्टर माइक्रोग्राम प्रति अच्छी तरह से इस्तेमाल करते हैं। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रेट्रोवायरल वेक्टर की अशेष 3 माइक्रोग्राम। 100 μ के मिश्रण का उपयोग; एल DMEM प्लस वेक्टर के हर 3 माइक्रोग्राम के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के 6 μl। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 100 μl DMEM के साथ अभिकर्मक अभिकर्मक के 6 μl मिलाएं। (इस्तेमाल कर रहे हैं कि रेट्रोवायरल वैक्टर उपकरण / सामग्री तालिका में सूचीबद्ध हैं)।
      1. 5 मिनट के लिए सेते हैं और रेट्रोवायरल वेक्टर के 3 ग्राम युक्त पूर्व aliquoted ट्यूब में 106 μl मिश्रण जोड़ें। मिक्स और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। फीनिक्स कोशिकाओं में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए इस पूरे मिश्रण dropwise जोड़ें।
    3. दिन 3: अभिकर्मक के बाद दिन, फोनिक्स कोशिकाओं से मीडिया को दूर करने और नए सिरे से पूरा DMEM मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें। उसी दिन, अच्छी तरह से प्रति 75,000 कोशिकाओं के घनत्व पर 6 अच्छी तरह प्लेटों में प्राथमिक मानव केरेटिनकोशिकाओं बीज। एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एक keratinocyte सीरम मुक्त मध्यम (KCSFM) (कलम / स्ट्रेप) में केरेटिनकोशिकाओं बनाए रखें।
      नोट: प्राथमिक मानव केरेटिनकोशिकाओं खरीदे गए थे। कोशिकाओं (सामग्री / उपकरण तालिका में सूचीबद्ध) विक्रेताओं की एक किस्म से खरीदा जा सकता है।
    4. 4 दिन: हरियाणाअब वायरल कणों में शामिल है जो ट्रांसफ़ेक्ट फीनिक्स कोशिकाओं से मीडिया विहित हैं। एक सिरिंज का उपयोग कर एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से मीडिया दर्रा (किसी भी दूषित फीनिक्स कोशिकाओं को हटाने के लिए) और केरेटिनकोशिकाओं पर 2 मिलीलीटर जगह (पिछले दिन / अच्छी तरह से 75,000 कोशिकाओं पर चढ़ाया: 2.3 कदम देखें)। संक्रमण की प्रक्रिया में मध्यस्थता करने में मदद करने के लिए मीडिया को hexadimethrine ब्रोमाइड (5 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें। वायरल titers ~ 1 10 x 7 टीयू / एमएल हैं।
      1. आरटी पर 1 घंटे के लिए 200 XG पर एक अपकेंद्रित्र में 6 अच्छी तरह प्लेटें स्पिन। स्पिन के बाद, वायरस युक्त मीडिया को हटाने और KCSFM जोड़ने से पहले 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें।
    5. दिन 5: फिर से 2.4 चरण में के रूप में केरेटिनकोशिकाओं के एक ही बैच को संक्रमित।
      नोट: रेट्रोवायरल वेक्टर पर एक चयन मार्कर है कि अगर वहाँ एक दवा का उपयोग केरेटिनकोशिकाओं का चयन करें और नीचे की ओर विश्लेषण या organotypic संस्कृतियों के रूप में इस तरह के अनुप्रयोगों में इस्तेमाल के लिए विस्तार।

    3. Organotypic त्वचा संस्कृतियों की स्थापना

    1. निर्माणआम प्रयोगशाला में पाया सामग्री या कैसेट से organotypic कैसेट कस्टम एक धातु का निर्माण दुकान के माध्यम से बनाया जा सकता है (2A चित्रा - एफ)। एक 3.5 सेमी टिशू कल्चर प्लेट से इन कैसेट बनाने के लिए, एक 3.5 सेमी पकवान (2A चित्रा-बी) के ढक्कन के केंद्र से एक 1.0 सेमी x 1.0 सेमी वर्ग को हटाने के लिए एक दाग़ना का उपयोग करें। बाँझ शर्तों के तहत यह मत करो।
      1. स्पष्ट नेल पॉलिश (चित्रा -2) का उपयोग कैसेट (3.5 सेमी डिश के ढक्कन) की तह तक वर्ग खूंटे संलग्न। नेल पॉलिश के लिए 5 मिनट के लिए सूखी और यह वर्ग खूंटे (चित्रा 2 डी) पर आराम कर रहा है तो यह है कि कैसेट पर फ्लिप करने की अनुमति दें। एक 6 सेमी डिश में कैसेट रखें।
        नोट: स्क्वायर कला और शिल्प की दुकानों की एक किस्म से खरीदा जा सकता है खूंटे।
    2. Keratinocyte मध्यम विकास 66% DMEM, 22% हाम F12, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% FBS, 2.67 माइक्रोग्राम / एमएल एडिनाइन 100 माइक्रोग्राम, 40 एन के शामिल (केजीएम) तैयार करेंग्राम / मिलीलीटर hydrocortisone, 10 एनजी / एमएल हैजा विष, 4.94 / एमएल इंसुलिन ग्राम, 5 ग्राम / एमएल transferrin, 1.36 एनजी / एमएल Triiodo एल thyronine, 10 एनजी / एमएल EGF, और 10 माइक्रोग्राम / एमएल सिप्रोफ्लोक्सासिन हाइड्रोक्लोराइड। उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से मीडिया फिल्टर।
    3. 4x कलम / स्ट्रेप + पीबीएस समाधान के बाहर डर्मिस लो और केजीएम में 2 बार धोने और फिर उपयोग करने से पहले दो दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर केजीएम में सेते हैं।
    4. 1.5 सेमी x 1.5 सेमी आकार के टुकड़ों को एक छुरी का उपयोग कर डर्मिस कटौती और फिर organotypic कैसेट पर जगह है। सामना करना पड़ रहा डर्मिस के शीर्ष के साथ डर्मिस रखें। डर्मिस के शीर्ष केरेटिनकोशिकाओं (चित्रा 1 बी) के साथ संपर्क में आता है उस तरफ हो जाएगा।
    5. (चित्रा 3) का सामना करना पड़ डर्मिस के ऊपर की ओर के साथ organotypic कैसेट के वर्ग छेद पर पूर्व में कटौती डर्मिस रखें।
    6. संदंश का उपयोग करने पर डर्मिस वाले संपूर्ण organotypic कैसेट (चित्रा 3 बी फ्लिप)। बर्फ पर बाह्य मैट्रिक्स समाधान गला लें। कैसेट प्रति बाह्य मैट्रिक्स समाधान के 100 μl बाहर आकर्षित करने के लिए एक सुई और सिरिंज का प्रयोग करें। डर्मिस (चमकदार पक्ष) की तह तक 5 बूँदें जोड़ें और डर्मिस (3B चित्रा) के दौरान भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए थोड़ा हिला।
    7. वाणिज्यिक अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स समाधान के लिए 5 मिनट के लिए पूरी तरह से (चित्रा 3 सी) जमना करने की अनुमति दें। सम्पिण्डन के बाद, पीठ पर कैसेट फ्लिप करने के लिए संदंश का उपयोग करें। 6 सेमी डिश के लिए केजीएम के 4 मिलीलीटर जोड़ें।
    8. डर्मिस (चित्रा 3 डी) युक्त organotypic कैसेट पर 0.5-1,000,000 आनुवंशिक रूप से संशोधित केरेटिनकोशिकाओं रखें।
      1. 5 मिनट के लिए 10 सेमी प्लेटों पर 0.05% trypsin के 4 मिलीलीटर रखने और पूरा DMEM मीडिया के 4 मिलीलीटर के साथ बुझाने द्वारा Trypsinize केरेटिनकोशिकाओं।
      2. एक hemocytometer का उपयोग केरेटिनकोशिकाओं गणना और फिर 5 मिनट के लिए 200 XG पर नीचे स्पिन। Resuspend .5-1,000,000 कोशिकाओं 90 μ में (उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या के आधार पर)और केजीएम के एल डर्मिस पर सभी कोशिकाओं की जगह।
        नोट: यह पुनर्जीवित एपिडर्मिस की मोटाई में देखा कोई मतभेद सेल नंबर शुरू करने में मतभेद के कारण नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ही प्रयोग के भीतर डर्मिस पर कोशिकाओं की संख्या में एक ही स्थान के लिए महत्वपूर्ण है। डर्मिस पर कम से कम 0.5 मिलियन कोशिकाओं रखकर गरीब स्तरीकरण और भेदभाव करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
    9. हर दूसरे दिन organotypic संस्कृतियों पर केजीएम मीडिया बदलें। हार्वेस्ट ऊतक डर्मिस पर केरेटिनकोशिकाओं की नियुक्ति के बाद 1-14 दिनों के लिए। एपिडर्मिस की पूर्ण स्तरीकरण और भेदभाव आमतौर पर 5 दिन बाद होता है।

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Representative Results

organotypic मानव त्वचा को पैदा करने में पहला कदम डर्मिस से एपिडर्मिस को दूर करने के लिए है। 37 डिग्री सेल्सियस 4x में कलम / स्ट्रेप / पीबीएस पर त्वचा के दो सप्ताह ऊष्मायन एपिडर्मिस (चित्रा 1 ए) से डर्मिस की जुदाई की अनुमति चाहिए। एपिडर्मिस और डर्मिस को अलग करने के लिए मुश्किल है तो एक सप्ताह के लिए 4x कलम / स्ट्रेप में 37 डिग्री सेल्सियस / पीबीएस में ऊतक जगह है और उसके बाद फिर से छीलने संदंश का उपयोग कर प्रयास करें।

निष्प्राण डर्मिस पर मानव एपिडर्मिस regenerating के लिए एक चाबी का केरेटिनकोशिकाओं डर्मिस के सही पक्ष पर रखा जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए है। डर्मिस एक ऊपर और एक नीचे है। डर्मिस के शीर्ष विवो में केरेटिनकोशिकाओं के साथ संपर्क में है और साथ ही organotypic संस्कृतियों में आता है कि पक्ष है। डर्मिस के शीर्ष कारण नीचे (चित्रा 1 बी) की चमक के डर्मिस के नीचे से भेदभाव किया जा सकता है। केरेटिनकोशिकाओं तल पर सीधे रखा जाता है तोडर्मिस की (चमकदार) की ओर, एपिडर्मिस अंतर या ठीक से विभक्त नहीं होंगे। इस प्रकार, यह organotypic कैसेट में सामना करना पड़ रहा डर्मिस (गैर चमकदार) के शीर्ष संबंध के लिए महत्वपूर्ण है। डर्मिस एक organotypic कैसेट (- एफ 2A चित्रा) पर सीधे रखा जा सकता है। धातु निर्मित कैसेट डर्मिस करने से पहले पर रखा जा रहा autoclaved किया जा सकता है, जबकि टिशू कल्चर प्लेटों से बना कैसेट्स यूवी निष्फल होना चाहिए। आनुवंशिक रूप से संशोधित केरेटिनकोशिकाओं तो डर्मिस पर रखा जा सकता है। वे केजीएम में resuspended डर्मिस पर रखा गया था के बाद से केरेटिनकोशिकाओं शुरू में तरल में डूबे हुए हैं। 24 घंटे के बाद केजीएम केरेटिनकोशिकाओं एपिडर्मिस 7 (चित्रा 3) में स्तरीकरण और भेदभाव का कारण बनता है, जो हवा तरल इंटरफेस को उजागर करने की अनुमति देता है जो डर्मिस के माध्यम से प्रचारित कर लिया जाएगा।

शाही सेना, प्रोटीन, डीएनए / क्रोमेटिन, साथ ही ऊतक वर्गों organotypic s से काटा जा सकता हैसभी बहाव के अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो परिजनों संस्कृतियों। आरएनए नियंत्रण और पछाड़ना / आर टी-qPCR, प्रोटीन, या आरएनए Seq का उपयोग कर overexpression के ऊतकों के बीच जीन अभिव्यक्ति मतभेदों को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। डीएनए / क्रोमेटिन डीएनए या चिप Seq अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पुनर्जीवित त्वचा अक्टूबर में रखा जा सकता है और जमे हुए वर्गों नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों में ऊतक आकृति विज्ञान, प्रोटीन अभिव्यक्ति / स्थानीयकरण का आकलन करने के इम्युनो धुंधला या hematoxylin और eosin धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस का एक उदाहरण एक ठेठ organotypic त्वचा संस्कृति के hematoxylin और eosin धुंधला के साथ 4 चित्र में दिखाया गया है। एपिडर्मिस के सभी चार अलग परतों भेदभाव से संबंधित प्रोटीन की परत विशिष्ट अभिव्यक्ति (चित्रा 4) 11,12,14,15 के साथ बनते हैं कि ध्यान दें। इस प्रणाली के overexpression या बाह्य त्वचा पर विभिन्न जीनों की पछाड़ना के प्रभावों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 5 चित्रा SNAI2 के लिए overexpressed नियंत्रण, lacZ के साथ ही ऊतक व्यक्त करता है कि पुनर्जीवित एपिडर्मल ऊतक से पता चलता है। 13,22 - केरातिन 1 (K1) धुंधला की कमी के साथ ही इस तरह के TGM1 और SPRR1A के रूप में भेदभाव प्रेरित संरचनात्मक जीन (सी चित्रा 5 ए) की अभिव्यक्ति की हानि द्वारा नोट के रूप में SNAI2 की overexpression एपिडर्मल भेदभाव के निषेध के लिए नेतृत्व किया। चित्रा 4 और 5 चित्रा में दिखाया गया एपिडर्मल मोटाई के कारण कोशिकाओं शुरू डर्मिस पर रखा गया था जब परिधि बनाम डर्मिस के बीच में जमते अधिक कोशिकाओं के लिए एक ही नमूना के भीतर अलग-अलग हो सकता है। इस प्रकार, मध्यम वर्गों परिधि पतली है जाता है, जबकि मोटा एपिडर्मिस हो जाते हैं। विभिन्न नमूनों के बीच प्रत्यक्ष तुलना के लिए एक अनुभाग का एक ही क्षेत्रों तुलना की जानी चाहिए। हालांकि, मार्करों के लिए धुंधला लगातार रहना चाहिए।

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मानव त्वचा से डर्मिस की चित्रा 1. तैयारी। (ए) 2 सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मानव त्वचा की ऊष्मायन के बाद, डर्मिस एपिडर्मिस से अलग किया जा सकता है। संदंश दूर डर्मिस (सफेद) से (भूरे रंग का) एपिडर्मिस छील करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। (बी) के डर्मिस के शीर्ष ऊतक की चमक से नीचे से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। डर्मिस के शीर्ष (स्वाभाविक रूप से इन विवो या जहां केरेटिनकोशिकाओं वरीयता प्राप्त किया जाएगा में एपिडर्मिस सामना करना होगा कि पक्ष) गैर चमकदार होती है। डर्मिस के नीचे चमकदार होती है। केजीएम में ऊष्मायन के लिए। कारण ऊतक गुलाबी है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
एफorganotypic कैसेट की igure 2. जनरेशन। (ए) एक 3.5 सेमी डिश के ढक्कन के केंद्र से एक 1.0 सेमी x 1.0 सेमी वर्ग को हटाने के लिए एक दाग़ना का प्रयोग करें। (बी) के 3.5 सेमी डिश के केंद्र से वर्ग निकालें। (सी) वर्ग खूंटे पालन करने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश का प्रयोग करें। नेल पॉलिश सुखाने के लिए के लिए 5 मिनट की अनुमति दें। यह वर्ग खूंटे पर आराम कर रहा है तो यह है कि (डी) ढक्कन पर फ्लिप। कैसेट अब इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है। एक धातु (ई) छवि अपने आयामों के साथ organotypic कैसेट गढ़े। (एफ) एक धातु निर्मित कैसेट की छवि का समर्थन खूंटे को दिखाने के लिए उल्टा रूप से फ़्लिप। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
Organot की चित्रा 3. पीढ़ीypic त्वचा संस्कृतियों। (ए) organotypic कैसेट पर सामना करना पड़ रहा डर्मिस (गैर चमकदार पक्ष) के शीर्ष के साथ डर्मिस रखें। (बी) पर कैसेट पलटें और डर्मिस का चमकदार पक्ष को Matrigel जोड़ें। Matrigel जमना और फिर पीठ पर कैसेट फ्लिप करने के लिए (सी) 5 मिनट की अनुमति दें। (डी) आनुवंशिक रूप से डर्मिस (0.5-1 लाख की कोशिकाओं केजीएम के 90 μl में resuspended कर रहे हैं) के लिए केरेटिनकोशिकाओं संशोधित जोड़ें। 1-14 दिनों केरेटिनकोशिकाओं के बोने के बाद ऊतक फसल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Hematoxylin और organotypic त्वचा संस्कृतियों के eosin धुंधला। पुनर्जीवित मानव त्वचा एपिडर्मिस और डर्मिस दोनों शामिल हैं। Epiderm4 अलग परतों के साथ पूरी तरह स्तरीकृत और विभेदित है। इन परतों अविभाजित बेसल परत और परत spinosum, granulosum और corneum सहित 3 विभेदित परतें शामिल हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और आनुवंशिक रूप से संशोधित मानव एपिडर्मिस के जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण। SNAI2 (ए) overexpression एपिडर्मल भेदभाव को रोकता है। भेदभाव प्रोटीन केरातिन 1 (K1) के लिए धुंधला हरे और नाभिक में दिखाया गया है नीला (Hoechst) में चिह्नित है। (बी) के नियंत्रण lacZ और SNAI2 overexpressing ऊतक में SNAI2 mRNA स्तर पर RT-qPCR विश्लेषण। MRNA पर त्रुटि सलाखों = एसडी, एन = 3 (सी) RT-qPCR विश्लेषणनियंत्रण lacZ और SNAI2 overexpressing ऊतक में भेदभाव टेप KRT1, TGM1, और SPRR1A का स्तर। त्रुटि सलाखों = एसडी, एन = 3. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Organotypic संस्कृतियों कई लाभ प्रदान करते मानव त्वचा में आनुवंशिक हेरफेर सामान्यतः 2 डी संवर्धित कोशिकाओं के साथ ही माउस मॉडल का अध्ययन करने के लिए। 2 डी संस्कृतियों बरकरार ऊतकों और अंगों में पाया तीन आयामी सेल सेल और सेल बाह्य मैट्रिक्स बातचीत की कमी है। हाल के अध्ययनों से भी 16 ट्यूमर प्राथमिक मानव त्वचा के लिए भी बहुत कुछ जीन अभिव्यक्ति समानता दिखा 3D संवर्धित कोशिकाओं के साथ 2 डी और 3 डी सुसंस्कृत त्वचा कैंसर की कोशिकाओं के बीच जबरदस्त मतभेद पाया है। मानव organotypic त्वचा संस्कृतियों भी माउस मॉडल पर कई फायदे हैं। माउस मॉडल समय लगता है और मानव और माउस त्वचा के बीच कई उल्लेखनीय मतभेद उत्पन्न करने के साथ ही महंगे हैं। ये अलग ऊतक कारोबार दरों के साथ-साथ murine और मानव एपिडर्मिस 8 के बीच एपिडर्मिस की मोटाई शामिल हैं। ऐसे CRISPR कैस के रूप में उभर नई प्रौद्योगिकियों, विशिष्ट जीन संशोधित किया जा सकता है / organotypic त्वचा संस्कृतियों का उपयोग मानव त्वचा रोगों मॉडल करने के लिए उत्परिवर्तिततों 23। इसके अलावा, जीन दिया या यहाँ वर्णित रेट्रोवायरल जीन स्थानांतरण के अलावा तरीकों की एक विस्तृत विविधता के माध्यम से इन कोशिकाओं में नीचे गिरा दिया जा सकता है। जब तक उच्च पारगमन दक्षता या नशीली दवाओं के चयन के माध्यम से मजबूत वितरण के रूप में वहाँ, विधि नियोजित किया जा सकता है। ये प्रसव के तरीके siRNAs की nucleofection, lentiviral, adenoassociated वायरस, और एडिनो वायरस 11,12,24-26 शामिल हैं।

organotypic त्वचा संस्कृतियों व्यवस्था करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को जोड़ने के द्वारा संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सामान्य या आनुवंशिक रूप से परिवर्तित मानव fibroblasts mesenchymal और उपकला crosstalk को अध्ययन करने के लिए निष्प्राण डर्मिस करने के लिए जोड़ा जा सकता है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भी त्वचा में अव्यवस्थाएं को भड़काऊ प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के डर्मिस करने के लिए जोड़ा जा सकता है। सिस्टम की एक सीमा विवो में होता है कि desquamation प्रक्रिया organotypic संस्कृतियों में नहीं होती है। यह लंबे समय तक और सबसे विश्लेषण के लिए इन संस्कृतियों के उपयोग को रोकताएपिडर्मल कोशिकाओं के बोने के बाद 1-14 दिनों के बीच किया जाता है। लंबी अवधि के assays के लिए, organotypic संस्कृतियों प्रतिरक्षा समझौता चूहों 17,27 की पीठ पर ग्राफ्ट जा सकता है।

यहाँ प्रस्तुत त्वचा organotypic संस्कृति यह सबसे अन्य प्रणालियों सब्सट्रेट 28 के रूप में कोलेजन या Matrigel उपयोग जबकि विवो में एपिडर्मिस की प्राकृतिक सब्सट्रेट है जो बरकरार निष्प्राण मानव डर्मिस इस्तेमाल करता है कि आप में अनूठा है। इस तरह के हमारे अनुभव में एपिडर्मिस के पतले और कम मजबूत स्तरीकरण में Matrigel परिणाम के रूप में substrates का उपयोग organotypic त्वचा संस्कृतियों का सेटअप। डर्मिस एपिडर्मल कोशिकाओं, देते पैदा करना, अंतर है, और 29 विभक्त हो जाना करने के लिए अनुमति देता है जो laminin और कोलेजन सहित तहखाने झिल्ली क्षेत्र प्रोटीन होता है। डर्मिस का उपयोग उनके vivo समकक्ष mimics कि एपिडर्मिस की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार, organotypic त्वचा संस्कृतियों विषाक्तता और औषधीय एस में अत्यंत मूल्यवान हो सकता हैजानवरों के अध्ययन (सौंदर्य प्रसाधन उद्योग), 30 की अनुमति नहीं है ऐसे मामलों में जहां tudies।

निष्प्राण डर्मिस का प्रयोग भी अलग दाताओं के बीच या यहां तक ​​कि एक ही दाता भिन्न हो सकते हैं भीतर डर्मिस की मोटाई के बाद से अपनी कमियां के साथ आता है। मोटी डर्मिस पर हो एपिडर्मल कोशिकाओं पैदा करना और पतले डर्मिस पर विकसित कोशिकाओं के रूप में epidermis के रूप में मोटी उत्पन्न नहीं करते हैं। इस प्रकार, यह कई नमूनों की तुलना प्रयोगों की स्थापना जब समान मोटाई डर्मिस का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर देखा कोई मतभेद वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या में मतभेद के कारण नहीं है कि इतनी अलग-अलग समूहों की तुलना करते समय एपिडर्मल कोशिकाओं की संख्या में एक ही बीज के लिए है।

अंत में, organotypic त्वचा संस्कृति अंततः जीन विनियामक mechan की समझ को गति देगा, जो एक अधिक शारीरिक संदर्भ में आणविक रास्ते मान्य करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उन्नत और कुशल के रूप में सेवा कर सकते हैंepidermal वृद्धि और भेदभाव में महत्वपूर्ण हैं कि वाद।

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Acknowledgments

इस काम अमेरिकन कैंसर सोसायटी रिसर्च स्कॉलर्स अनुदान (आरएसजी-12-148-01 डीडीसी) और सीआईआरएम बुनियादी जीव विज्ञान पुरस्कार (RB4-05779) supportedby था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human skin New York Firefighters Skin Bank http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP GIBCO 15140-122
amphotropic phoenix cell lines ATCC CRL-3213
FUGENE 6 transfection reagent Promega E2691
Keratinocyte Media (KCSFM) Life Technologies 17005042
DMEM GIBCO 11995
Ham's F12 Cambrex 12-615F
FBS GIBCO 10437-028
Adenine Sigma A-9795
Cholera Toxin Sigma  C-8052
Hydrocortisone Calbiochem 3896
Insulin Sigma I-1882
EGF Invitrogen 13247-051
Transferrin  Sigma T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride Serologicals 89-001-1
cautery Bovie Medical Corporation AA01
Matrigel Corning 354234
Keratin 1 antibody Biolegend PRB-149P
square pegs Arts and crafts stores
human neonatal keratinocytes ATCC PCS-200-010
human neonatal keratinocytes Cell Applications 102K-05n
MSCV retroviral vector Clontech 634401
LZRS retroviral vector Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector Oligoengine VEC-PRT-0002 
hexadimethrine bromide  Sigma H9268-5G

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 106 organotypic त्वचा आनुवंशिकी आरएनए हस्तक्षेप रेट्रोवायरल overexpression केरेटिनकोशिकाओं फ़ाइब्रोब्लास्ट डर्मिस एपिडर्मिस पारगमन त्वचा निर्माणों स्तरीकृत epithelia उपकला त्वचा विज्ञान SNAI2 mesenchymal संक्रमण को उपकला
निष्प्राण मानव डर्मिस का प्रयोग आनुवंशिक रूप से संशोधित Organotypic त्वचा संस्कृतियों की पीढ़ी
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Li, J., Sen, G. L. Generation of… More

Li, J., Sen, G. L. Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis. J. Vis. Exp. (106), e53280, doi:10.3791/53280 (2015).

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