Abstract
의 Organotypic 문화 기능과 생체 조직의 대응의 생리를 모방 세포 - 세포 연락처 및 세포 - 기질 상호 작용에 중요한 3D 환경의 재구성 할 수 있습니다. 이 충실히 표피 분화와 계층화 프로그램을 되풀이되었습니다의 Organotypic 피부 배양을들 수있다. 기본 인간의 표피 각질 세포는 유전자가 쉽게 과발현 또는 무너 뜨렸다 수 있습니다 레트로 바이러스를 통해 유전자 조작 될 수 있습니다. 이러한 유 전적으로 변형 된 각질 세포는 유전자 전달 경로에 충격을 표피 성장, 분화, 및 질병 진행을 연구하는 모델을 제공하는 강력한의 Organotypic 피부 배양 인간 표피를 재생성하기 위해 사용될 수있다. 여기에 제시된 프로토콜은 약화 된 인간의 진피를 준비뿐만 아니라 유 전적으로 피부의 Organotypic 문화를 생성하기 위해 기본 인간의 각질 세포를 조작하는 방법을 설명합니다. 인간의 피부는 재생 downstr 사용될 수있다이러한 유전자 발현 프로파일, 면역 및 높은 처리량 시퀀싱 하였다 염색질 면역 침전 등 EAM 애플리케이션. 따라서, 이러한 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성은 피부의 항상성 유지에 중요한 유전자의 결정을하실 수 있습니다.
Introduction
인간 표피뿐만 아니라이 아니라를 보호하는 제 1의 방어선 수분의 손실을 방지하는 불 투과성 장벽 역할 기저막 zone.The 표피로 알려진 세포 외 기질을 통해 하부 진피에 연결 성층 상피이고 외국과 독성 물질 1 몸. 표피의 가장 깊은 층 인 기저층은, 표피 (2)의 나머지를 형성하는 분화 된 자손을 야기 표피 줄기 및 전구 세포를 포함한다. 상피 전구 세포는 분화 된 바와 같이 그들은 가시 층 (3)으로 알려진 분화 된 세포의 제 1 층을 형성하기 위해 위쪽으로 이동한다. 가시 층에서, 세포는 표피의 분화 층 물리적 응력을 견딜 수 있도록 강도를 제공 케라틴 1 내지 10의 발현에 차례. 가시 층 세포는 상기 차별화 된 바와 같이, 그들에 대한 표피의 위쪽으로 이동세포막 아래 조립 keratohyalin와 라멜라 과립의 형성뿐만 아니라, 구조 단백질을 특징으로 과립 층 미터. 세포 분화 과정에서 진행하는 라멜라 과립이 풍부한 층은 각질층 4라는 지질을 형성하는 셀로부터 압출되는 동안, 세포막 밑 단백질은 서로 결합 가교이다.
상피 세포 성장과 분화에 미치는 영향 ~ 인구 5의 20 %의 변화를 포함하는 질병. 따라서,이 과정의 기전을 이해하는 것이 매우 중요하다. 이 질병의 많은 표현이 세포 - 세포 또는 세포 - 매트릭스 접촉에 달려 있기 때문에, 인간의 표피가 3D 환경에서 재구성의 Organotypic 문화 6-10 만들어졌습니다. 이들 방법은 일반적으로 약화 된 인간과 같은 세포 외 기질에 파종 차 또는 변환 된 각화 세포의 사용을 포함진피, 마트 리겔, 또는 콜라겐.
표피 성장과 분화에 중요한 유전자 조절 기전을 이해하기 위하여 케 라티노 유전자 차원 배양 유전자 녹다운 또는 과발현하는 레트로 바이러스 벡터를 통해 조작 된 후 3D로 재구성 될 수있다. 이러한 방법은 종양 11-21 표피 줄기 및 전구 세포자가 재생과 분화뿐만 아니라 진행에 관여하는 유전자를 특성화하는 데 광범위하게 사용되어왔다. 여기서, 레트로 바이러스를 사용하여 배양 물에서, 표피의 Organotypic 유전자 발현을 변경하는 방법에 대한 심도있는 프로토콜이 제공된다.
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Protocol
인간의 피부 프로토콜 캘리포니아 대학, 샌디에고의 연구 윤리위원회의 지침에 따라 수행 하였다. 인간의 피부는 폐기 수술 샘플에서 얻은 또는 (피부 은행이 소재 / 장비의 표에 나와있는) 피부 은행에서 구입하실 수 있습니다. 피부 또는 기증자의 나이 파생 위치는 실험만큼 진피의 기저막 영역 단백질 (콜라겐 / 라미닌)에 중요하지 않은 것은 성능이 저하되지 않습니다.
약화 된 인간의 진피 1. 준비
- 인간의 피부를 수신하면, (~ 3-5 분) 해동 조직 배양 후드에서 조직을 배치. 피부의 크기에 따라, 일회용 무균 50 ㎖ 원뿔형 튜브 또는 125 ml의 용기에 해동 조직을 배치. 피부 은행에서 피부의 전형적인 크기는 0.75 평방 피트입니다.
- 1X PBS에서 4 배 페니실린과 스트렙토 마이신 (펜 / 연쇄 구균)와 75 %의 전체 컨테이너를 채 웁니다. 격렬하게 흔들어5 분 및 액체 폐기하십시오. 이 단계를 3 번 이상 반복합니다.
- 마지막 세척 후, 새로운 튜브 / 병에 조직을 전송하고 컨테이너의 75 %를 채우기 위해 신선한 배 펜 / 패 혈성 / PBS를 추가합니다. 2 주부터 표피 진피의 분리를 허용하기 위해 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터에서이 혼합물을 배양한다.
- 무균 조건에서, 진피에서 표피를 벗겨 집게를 사용합니다. 표피는 기증자 (그림 1A)의 인종에 따라 색상이 반면 진피는 완전히 흰색입니다. 인체 조직을 다루는 기관의 프로토콜에 따라 표피를 폐기하십시오.
- 관 또는 병에 진피를 놓고 (4 시간 5 분 세척) 활발한 진탕 1X PBS에 희석 배 펜 / 연쇄상 구균에 씻는다. 마지막 세척 후 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 4 배 펜 / 1X PBS에 희석 연쇄 구균과 상점에서 새로운 튜브 / 병에 진피를 전송합니다. 진피 년까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. 2. 유전자 수정 기본 인간의 각질 형성 세포
- 1 일 : 형질 전날, 완전한 DMEM 매체 잘 당 800,000 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 시드 피닉스 세포.
- 주 2 : 형질의 날, 3 레트로 바이러스 벡터의 μg의 당을 잘 사용합니다. 1.5 ML 튜브에 레트로 바이러스 벡터의 나누어지는 3 μg의. 100 μ의 혼합을 사용하여; L의 DMEM 플러스 벡터의 모든 3 μg의에 대한 형질 전환 시약의 6 μL. 1.5 ML 튜브에 100 μL의 DMEM으로 형질 전환 시약의 6 μl를 섞는다. (사용되는 레트로 바이러스 벡터는 장비 / 재료 표에 나와 있습니다).
- 5 분 동안 인큐베이션 및 레트로 바이러스 벡터를 함유하는 3 μg의 사전 분취 튜브에 106 ㎕의 혼합물을 추가한다. 혼합하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. 피닉스 세포의 각 웰이 전체 혼합물의 적가를 추가합니다.
- 주 3 : 형질 전환 후 날, 피닉스 세포에서 미디어를 제거하고 신선한 완전한 DMEM 배지 2 ㎖를 추가합니다. 같은 날에, 웰 당 75,000 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 차 인간 각화 세포를 시드. 항생제와 각질 세포의 무 혈청 배지 (KCSFM) (펜 / 연쇄상 구균)에있는 각질을 유지한다.
참고 : 1 차 인간의 각질 세포가 구입 하였다. 세포 (소재 / 장비의 표에 나와있는) 다양한 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다. - 주 4 : 하르지금은 바이러스 입자를 포함하는 형질 전환 피닉스 세포에서 용지를 가득. 주사기를 사용하여 0.45 μm의 필터를 통해 미디어를 전달 (모든 오염 피닉스 세포를 제거하기 위해) 및 각질 형성 세포에 2 ml의 배치 (전날 / 잘 75,000 세포에서 도금 : 단계 2.3 참조). 감염 과정을 중재하기 위해 언론에 hexadimethrine 브로마이드 (5 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 바이러스 역가는 ~ 1 × 10 7 TU / ㎖이다.
- RT에서 1 시간 동안 200 XG에서 원심 분리기에서 6 웰 플레이트 스핀. 스핀 후, 바이러스를 포함하는 미디어를 제거하고 KCSFM를 추가하기 전에 1X PBS로 한 번 세포를 씻으십시오.
- 제 5 일 : 단계를 다시 2.4로 각질 세포의 동일한 배치를 감염.
참고 : 레트로 바이러스 벡터의 선택 마커가있는 경우 약물을 사용하여 각질을 선택하고 다운 스트림 분석 또는의 Organotypic 문화 등의 용도로 확장합니다. - 구축일반 실험실에있는 자료 또는 카세트에서의 Organotypic 카세트 사용자 정의 금속 제조 가게를 통해 할 수있다 (그림 2A - F). 3.5 cm 조직 문화 판에서 이러한 카세트를하려면, 3.5 cm 접시 (그림 2A-B)의 뚜껑의 중심에서 1.0 cm X 1.0 cm 사각형을 제거하는 소작을 사용합니다. 무균 상태에서이 작업을 수행합니다.
- 명확한 매니큐어 (그림 2C)를 사용하여 카세트 (3.5 cm 접시의 뚜껑)의 바닥에 사각형 못을 연결합니다. 매니큐어 5 분 건조하고 광장 못 (그림 2D)에 쉬고되도록 카세트를 뒤집어하도록 허용합니다. 6cm 접시에 카세트를 놓습니다.
참고 : 광장 예술과 공예 상점의 다양한에서 구입하실 수 있습니다 쐐기.
- 명확한 매니큐어 (그림 2C)를 사용하여 카세트 (3.5 cm 접시의 뚜껑)의 바닥에 사각형 못을 연결합니다. 매니큐어 5 분 건조하고 광장 못 (그림 2D)에 쉬고되도록 카세트를 뒤집어하도록 허용합니다. 6cm 접시에 카세트를 놓습니다.
- 각질 세포 성장 배지 DMEM 66 %, 22 %, 햄 F12, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 % FBS, 2.67 μg의 / ㎖ 아데닌 100 μg의 40 N로 구성된 (KGM)를 준비g / ㎖ 하이드로 코르티손, 10 NG / ㎖ 콜레라 독소, 4.94 / ㎖ μg의 인슐린, 5 μg의 / ㎖ 트랜스페린, 1.36 NG / ㎖ Triiodo-L-로닌, 10 NG / ㎖ EGF 및 10 μg의 / ㎖ 시프로플록사신 염산염. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 미디어를 필터링합니다.
- 배 펜 / 연쇄상 구균 + PBS 용액에서 진피를 타고 KGM에서 2 회 반복 한 후 사용하기 전에 이틀 동안 37 ° C에서 KGM에 품어.
- 1.5 cm X 1.5 cm 크기의 조각으로 메스를 사용하여 진피를 잘라 다음의 Organotypic 카세트에 배치합니다. 이 위를 향하게하여 진피의 상부와 진피를 놓습니다. 진피의 정상은 각질 세포 (그림 1B)와 접촉하는면 될 것입니다.
- (그림 3A)를 직면하고있는 진피의 상부면의 Organotypic 카세트의 사각형 구멍에 사전 컷 진피를 놓습니다.
- 집게를 사용하여 위에 진피를 함유하는 전체의 Organotypic 카세트 (도 3b 플립). 얼음 외 기질 용액을 해동. 카세트 당 세포 외 기질 용액 100 μL를 그려 바늘과 주사기를 사용합니다. 진피 (광택면)의 바닥에 5 방울을 추가하고 진피 (그림 3B)에 걸쳐 고른 분포를 확인하기 위해 약간 흔들.
- 상업 세포 외 매트릭스 솔루션을위한 5 분은 완전히 (그림 3C)를 공고히 할 수 있습니다. 응고 후, 다시 위에 카세트를 플립 집게를 사용합니다. 6cm 접시에 KGM의 4 ML을 추가합니다.
- 진피 (그림 3D)를 포함하는의 Organotypic 카세트에 0.5-1000000 유 전적으로 변형 된 각질 세포를 놓습니다.
- 5 분 동안 10cm 플레이트에 0.05 % 트립신 4㎖를 배치하고 완전 DMEM 배지 4 ㎖로 급냉하여 각화 세포를 Trypsinize.
- 혈구를 사용하여 각질 세포를 계산 한 다음 5 분 동안 200 XG에 스핀 다운. 재현 탁 0.5-1000000 세포는 90 μ로 (사용 가능한 셀의 수)에 따라그리고 KGM의 L은 진피에있는 모든 세포를 놓습니다.
주 : 재생 된 표피의 두께에 차이가 보이는 세포 수를 시작하는 차이에 의해되지 않도록 동일한 실험 진피 내에서 동일한 수의 셀을 배치하는 것이 중요하다. 진피에 미만 50 만 셀을 배치하면 가난한 계층화와 차별화 될 수 있습니다.
- 매일의 Organotypic 문화에 KGM 미디어를 변경합니다. 수확 조직 진피에 각질 세포의 배치 후 1-14일. 표피의 전체 계층화 및 분화는 일반적으로 5 일 후에 발생합니다.
주 : 차 인간 각화 세포를 감염 바이러스를 생산하기 위해 완벽한 DMEM 배지 [DMEM + 10 % 소 태아 혈청 (FBS) + 펜 / 연쇄상] 재배 사용 amphotropic 피닉스 세포. 이러한 개그-POL 및 봉투와 같은 단백질을 인코딩 바이러스 성 포장 유전자가 안정적으로 레트로 바이러스 벡터로 형질 전환 된 경우 바이러스 생산을 허용 피닉스 세포 게놈에 통합되어 있습니다. 피닉스 세포 고효율 높은 역가의 바이러스 생산을위한 형질 허용 될 수있다. 이 포장 라인에서 생산 된 바이러스는 인간을 포함한 포유 동물 세포의 큰 다양성을 감염시킬 수 있습니다.
3. 피부의 Organotypic 문화를 설정
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Representative Results
인간 피부의 Organotypic를 생성하는 첫 번째 단계는 표피 진피를 제거하는 것이다. 37 ° C에서 4X 펜 / 연쇄상 / PBS에서 피부의 2 주 인큐베이션 표피 (도 1a)에서 진피의 분리를 허용한다. 표피와 진피를 분리하는 것이 어려운 경우 다른 주 동안 4 배 펜 / 연쇄상 구균에 37 ° C / PBS에서 조직을 배치하고 다시 벗겨 집게를 사용해보십시오.
약화 된 진피에 인간의 표피를 재생의 열쇠 중 하나는 각질 세포가 진피의 올바른 측면에 배치되어 있는지 확인하는 것입니다. 진피는 상단과 하단이 있습니다. 진피의 정상은 생체 내에서 각질 세포와 접촉뿐만 아니라의 Organotypic 문화에서 제공되는 측면이다. 진피의 상부 인해 저면 (도 1b)의 광택도에 진피의 바닥으로부터 구별 될 수있다. 각질 세포가 바닥에 직접 배치하는 경우진피의 (광택) 측, 표피는 차별화 또는 제대로 계층화되지 않습니다. 따라서,의 Organotypic 카세트에 직면하고있는 진피 (비 광택)의 상단을 가지고 매우 중요합니다. 진피는의 Organotypic 카세트 (- F 그림 2A)에 직접 배치 할 수 있습니다. 금속 제작 카세트 진피 이전에이에 배치되는 멸균 할 수 있지만 조직 배양 접시에서 만든 카세트는 자외선 살균해야한다. 유 전적으로 변형 된 케 라티노이어서 진피 상에 배치 될 수있다. 그들이 KGM에 재현 탁 진피 상에 배치 된 이후 각질 세포는 초기 액체에 잠겨있다. 24 시간 후에는 KGM 표피 각질 7 (도 3)로 층화과 분화를 유발 공기 - 액체 계면에 노출되도록 진피를 통해 확산 할 것이다.
RNA는 단백질, DNA / 염색질뿐만 아니라, 조직 절편의 Organotypic들로부터 수확 될 수있다모든 하류 다양한 용도에 사용될 수 친척 배양. RNA는 제어 및 최저 / RT-QPCR, 마이크로 어레이 또는 RNA-SEQ를 과발현하여 조직 간의 유전자 발현의 차이를 결정하기 위해 사용될 수있다. DNA / 염색질은 DNA 또는 칩-SEQ 애플리케이션에 사용될 수있다. 재생 된 피부는 OCT에서 장착 될 수 있으며, 동결 절편은 제어 및 실험군의 조직 형태, 단백질 발현 / 현지화를 평가하는 면역 염색 또는 헤 마톡 실린과 에오신 염색을 위해 사용될 수있다.
이것의 전형적인 예는 피부의 Organotypic 문화의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색,도 4에 도시된다. 표피의 모든 네 가지 계층이 분화 관련 단백질 층 특이 적 발현 (그림 4) 11,12,14,15이 형성되어 있습니다. 이 시스템은 과발현 또는 표피에 다른 유전자의 넉다운의 영향을 결정하기 위해 사용될 수있다.도 5를 SNAI2에 대한 과다 발현 제어, LacZ를뿐만 아니라 조직을 표현 재생 된 표피 조직을 보여줍니다. 13,22 - 각질 1 (K1) 염색의 부족뿐만 아니라 TGM1과 SPRR1A로 분화 유도하는 구조 유전자 (C도 5a)의 표현의 손실에 의해 언급 된 바와 같이 SNAI2의 과발현은 표피 분화 억제되었다. 도 4 및도 5에 도시 된 표피 두께 인해 세포가 진피 초기에 배치 될 때 외주에 비해 진피의 중간에 축적 이상의 셀에 동일한 샘플 내에서 변할 수있다. 따라서, 중간 섹션은 주연 얇게 갖는 경향이있는 반면 두꺼운 표피를 가질 경향이있다. 상이한 샘플 사이의 직접적인 비교를위한 부분의 동일한 영역을 비교한다. 그러나, 마커 염색 일관성 유지해야한다.
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인간의 피부에서 진피층도 1의 제조. (A)을 2 주 동안 37 ℃에서 인간 피부 배양 후에는, 진피는 표피로부터 분리 될 수있다. 집게 멀리 진피 (흰색)에서 (색 갈색) 표피를 벗겨하는 데 사용됩니다. (B)는 진피의 상단은 조직의 광택도에 의해 하부로부터 구별 될 수있다. 진피의 상단 (자연적 생체 어디서 각질 세포가 시드됩니다의 표피에 직면하게 될 것이다 측면) 비 광택입니다. 진피의 바닥 광택입니다. KGM에서 배양한다. 때문에 조직은 분홍색 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
에프의 Organotypic 카세트의 igure 2 세대. () 3.5 cm 접시의 뚜껑의 중심에서 1.0 cm X 1.0 cm 사각형을 제거하는 소작을 사용합니다. (B) 3.5 cm 접시의 중심에서 사각형을 제거합니다. (C) 광장 못을 준수하기 위해 명확한 매니큐어를 사용합니다. 매니큐어가 마를 때까지 5 분을 허용합니다. 이 광장 못 쉬고되도록 (D) 뚜껑을 뒤집습니다. 카세트 이제 사용할 준비가된다. 금속의 (E)는 이미지 치수의 Organotypic 카세트를 제작. (F) 금속 제조 카세트의 이미지는 지원 못 보여 거꾸로 뒤집혀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
organot 그림 3. 세대ypic 피부 문화. (가)의 Organotypic 카세트에이 위를 향하도록 진피 (비 광택면)의 상부와 진피를 놓습니다. (B)를 통해 카세트 플립과 진피의 광택면에 마트 리겔을 추가합니다. 마트 리겔이 응고 후 다시 위에 카세트를 반전하는 (C)는 5 분을 허용합니다. (D)는 유 전적으로 진피 (0.5-1000000 세포가 KGM의 90 μL에 재현 탁된다)로 각질을 수정 추가. 1~14일 각질 세포의 파종 후 조직을 수확. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 헤 마톡 실린과의 Organotypic 피부 문화의 에오신 염색. 재생성 인간의 피부는 표피와 진피 모두 포함되어 있습니다. epiderm4 별개의 층과 완벽하게 계층화와 차별화 된입니다. 이 층은 미분화 기초 층과 지층 spinosum 등, granulosum과 각질을 포함하여 3 차별화 된 층을 포함한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5. 면역 형광 염색 및 유 전적으로 변형 된 인간 표피의 유전자 발현 분석. SNAI2의 (A) 과발현 표피 분화를 억제한다. 분화 단백질 케라틴 1 (K1)에 대한 염색하는 것은 녹색과 핵에 표시됩니다 파란색 (헥스)에 표시됩니다. (나) 제어 LacZ를하고 SNAI2 과발현 조직 SNAI2의 mRNA 수준에 RT-QPCR 분석. 의 mRNA에 오차 막대 = SD, N = 3 (C) RT-QPCR 분석제어 LacZ를하고 SNAI2 과발현 조직의 분화 성적 증명서 KRT1, TGM1 및 SPRR1A 수준. 오차 막대 = SD, N = 3 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
의 Organotypic 문화가 많은 장점을 제공하는 사람의 피부에서 유전자 조작은 일반적으로 2D를 배양 된 세포뿐만 아니라 마우스 모델을 공부합니다. 2D 배양 본래 조직 및 기관에서 발견 삼차원 세포 - 세포 및 세포 - 세포 외 기질의 상호 작용이 부족하다. 최근의 연구는 16 차 종양이 사람의 피부에 많은 유전자 발현 유사성을 보여주는 3 차원 배양 된 세포와 함께 배양 된 2D 및 3D 피부암 세포 사이의 상당한 차이를 발견 하였다. 인간의 Organotypic 피부의 문화는 마우스 모델에 비해 여러 가지 장점이있다. 마우스 모델은 시간 소모적이고, 인간 및 마우스의 피부 사이에 주목할만한 차이를 생성 할뿐만 아니라, 고가이다. 이들은 다른 조직의 이직률뿐만 아니라 쥐와 인간의 표피 (8) 사이의 표피의 두께를 포함한다. 이러한 CRISPR-CAS으로 부상하고 새로운 기술은 특정 유전자가 변형 될 수와 /의 Organotypic 스킨이 배양을 이용하여 인간의 피부 질환을 모델로 돌연변이ES (23). 또한, 유전자 전달 또는 여기에 설명 된 레트로 바이러스 유전자 전달 이외에도 다양한 방법을 통해 이러한 세포에서 녹다운 될 수있다. 만큼 높은 전달 효율 또는 약물 선택을 통해 강력한 전달이있는 한, 방법을 채용 할 수있다. 이러한 전달 방법은 siRNA를의 nucleofection, 렌티 바이러스, adenoassociated 바이러스 및 아데노 바이러스 11,12,24-26을 포함한다.
의 Organotypic 피부 배양 시스템으로 상이한 세포 유형을 추가함으로써 변형 될 수있다. 예를 들어, 정상 또는 유전자 조작 인간 섬유 아세포 중간 엽 상피 누화 공부 약화 된 진피에 첨가 될 수있다. 면역 세포는 피부에서 섭동에 염증 반응을 연구 진피에 첨가 될 수있다. 시스템의 하나의 제한은, 생체 내에서 발생하는 박리 공정의 Organotypic 문화가 발생하지 않는다는 점이다. 이것은 장기적으로 대부분의 분석이 문화의 사용을 방지표피 세포의 파종 후 1-14일간에 이루어진다. 장기 분석을 위해,의 Organotypic 문화 면역 손상 마우스 17,27의 백업에 이식 할 수 있습니다.
여기에 제시된 피부의 Organotypic 배양은 대부분의 다른 시스템은 기판 (28)으로서 콜라겐이나 마트 리겔을 사용하는 반면, 생체 내에서 표피의 천연 기질 인 그대로 약화 된 인간 진피를 이용하는 점에서 독특하다. 이러한 우리의 경험에서 표피의 얇은 덜 강력한 층화에 마트 리겔 결과로 기판을 사용하여 피부의 Organotypic 문화의 설정. 진피는 표피 세포가 부착 증식, 분화, 29을 계층화 할 수 있습니다 라미닌 및 콜라겐을 포함 지하실 막 영역의 단백질이 포함되어 있습니다. 진피의 사용은 생체 내 대응을 모방 표피의 생성이 가능합니다. 따라서,의 Organotypic 피부의 문화는 독성 및 약리들에 매우 도움이 될 수 있습니다동물 연구 (화장품 산업) 30 수 없습니다 경우에 tudies.
약화 된 진피를 사용하면 여러 기증자 사이 또는 같은 기증자가 다를 수 있습니다 내 진피의 두께 이후 자신의 단점이 함께 제공됩니다. 두꺼운 진피에 성장 표피 세포는 증식 얇은 진피에 성장 세포와 같은 표피의 두꺼운 발생하지 않는 경향이있다. 따라서, 여러 샘플을 비교하는 실험을 설정할 때 비슷한 두께의 진피를 선택하는 것이 중요합니다. 또 다른 중요한 파라미터는 본 차이는 셀의 초기 시드 수의 차이에 의해되지 않도록 서로 다른 그룹을 비교할 때 표피 세포와 동일한 번호를 배정한다.
결론적으로, 피부의 Organotypic 문화는 궁극적으로 유전자 규제 mechan의 이해를 가속화 더 생리 학적 맥락에서 분자 경로의 유효성을 확인하는 체외 모델의 고급 및 효율적인 역할을 할 수 있습니다상피 세포 성장과 분화에 중요한 ISMS.
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Acknowledgments
이 작품은 미국 암 학회 (American Cancer Society) 연구 학자 그랜트 (RSG-12-148-01-DDC) 및 CIRM 기본 생물학 상 (RB4-05779) supportedby했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html | |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 | |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 | |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 | |
| DMEM | GIBCO | 11995 | |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F | |
| FBS | GIBCO | 10437-028 | |
| Adenine | Sigma | A-9795 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 | |
| Insulin | Sigma | I-1882 | |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 | |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P | |
| square pegs | Arts and crafts stores | ||
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n | |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 | |
| LZRS retroviral vector | Addgene | ||
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
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- Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
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