Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53280
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Dermatology, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego

Abstract

Los cultivos organotípicos permiten la reconstitución de un entorno 3D crítico para contacto célula-célula y célula-matriz interacciones que imita la función y la fisiología de sus homólogos de tejidos in vivo. Esto se ejemplifica con cultivos de piel organotípicos que recapitula fielmente la diferenciación epidérmica y el programa de la estratificación. Queratinocitos epidérmicos humanos primarios son genéticamente manipulable mediante retrovirus donde los genes pueden ser fácilmente sobreexpresan o derribados. Estos queratinocitos modificados genéticamente se pueden utilizar para regenerar la epidermis humana en cultivos de piel organotípicos proporcionan un poderoso modelo para estudiar vías genéticas de crecimiento epidérmico de impacto, la diferenciación y la progresión de la enfermedad. Los protocolos presentados aquí describen métodos para preparar dermis humana desvitalizados, así como para manipular genéticamente los queratinocitos humanos primarios a fin de generar cultivos de piel organotípicos. La piel humana regenerada se puede utilizar en downstream aplicaciones tales como perfiles de expresión génica, la inmunotinción y inmunoprecipitaciones cromatina seguido de secuenciación de alto rendimiento. Por lo tanto, la generación de estos cultivos de piel organotípicos modificados genéticamente permitirá la determinación de los genes que son críticos para el mantenimiento de la homeostasis de la piel.

Introduction

La epidermis humana es un epitelio estratificado que se conecta a la dermis subyacente a través de una matriz extracelular conocida como la epidermis terraza, plancha membrana basal no sólo sirve como una barrera impermeable para evitar la pérdida de humedad, sino también como una primera línea de defensa para proteger la cuerpo de sustancias extrañas y tóxicos 1. La capa basal, que es la capa más profunda de la epidermis, contiene las células madre epidérmicas y progenitoras que dan lugar a la progenie diferenciada que forman el resto de la epidermis 2. Como las células progenitoras se diferencian epidérmicas que migran hacia arriba para formar la primera capa de células diferenciadas conocida como la capa espinosa 3. En la capa espinosa, las células se convierten en la expresión de las queratinas 1 y 10, que a continuación proporciona la fuerza para soportar el estrés físico para las capas diferenciadas de la epidermis. Como las células de la capa espinosas diferenciar aún más, se mueven hacia arriba en la epidermis a FORm la capa granular, que se caracteriza por la formación de gránulos de queratohialina y laminares, así como proteínas estructurales que se ensamblan por debajo de la membrana plasmática. Como las células proceden en el proceso de diferenciación, las proteínas por debajo de la membrana plasmática son cruz vinculadas entre sí, mientras que los gránulos lamelares son extruidos a partir de las células para formar un lípido barrera rica llama el estrato córneo 4.

Enfermedades que implican alteraciones en crecimiento epidérmico y el impacto diferenciación ~ 20% de la población 5. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de este proceso es de gran importancia. Desde manifestación de muchas de estas enfermedades está supeditada a la célula-célula o célula-matriz de contacto, cultivos organotípicos donde la epidermis humana se reconstituye en un entorno 3D se han creado 6-10. Estos métodos implican típicamente el uso de queratinocitos primarios o transformadas sembradas sobre la matriz extracelular tales como humano desvitalizadodermis, Matrigel, o colágeno.

Para entender los mecanismos de regulación de genes que son importantes en crecimiento epidérmico y la diferenciación, los queratinocitos se pueden manipular genéticamente a través de vectores retrovirales para derribar o sobreexpresar genes en cultivo 2D y luego reconstituirse en 3D. Estos métodos se han utilizado ampliamente para caracterizar genes implicados en la madre epidérmicas y células progenitoras auto-renovación y diferenciación, así como la progresión a neoplasia 11-21. Aquí, se proporciona un protocolo en profundidad sobre cómo alterar la expresión de genes en cultivos organotípicos epidérmicas a través del uso de los retrovirus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

El protocolo de la piel humana se realizó de acuerdo con las directrices de la Universidad de California, Comité de Ética de Investigación de San Diego. La piel humana se puede obtener a partir de muestras quirúrgicas desechadas o comprado a los bancos de la piel (banco de piel aparece en la Tabla de materiales / Equipo). La ubicación donde la piel se deriva de o la edad del donante no es crítico para el experimento, siempre y cuando las proteínas de la membrana basal (colágeno / laminina) en la dermis no se degradan.

1. Preparación de desvitalizados Dermis Humanos

  1. Tras la recepción de la piel humana, colocar el tejido en la campana de cultivo de tejido para descongelar (~ 3-5 min). Dependiendo del tamaño de la piel, colocar el tejido descongelado en un tubo estéril desechable de 50 ml o 125 ml cónica botella. El tamaño típico de la piel desde el banco de piel es de 0,75 pies cuadrados.
  2. Llene el recipiente de 75% de su capacidad con penicilina y estreptomicina 4x (penicilina / estreptomicina) en 1x PBS. Agitar vigorosamente durante5 min y deseche el líquido. Repita este paso 3 veces más.
  3. Después del último lavado, transferir el tejido a un nuevo tubo / botella y añadir 4x fresco pen / strep / PBS para llenar 75% del contenedor. Incubar esta mezcla en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C durante 2 semanas para permitir la separación de la dermis de la epidermis.
  4. En condiciones estériles, el uso de fórceps para despegar la epidermis de la dermis. La dermis es completamente blanco, mientras que la epidermis tendrán coloración en función de la carrera del donante (Figura 1A). Deseche la epidermis, según el protocolo de la institución para hacer frente a los tejidos humanos.
  5. Coloque la dermis en un tubo o botella y lavarlo en 4x pen / strep diluido en PBS 1x con agitación vigorosa (5 min lavados por 4 veces). Después del último lavado, transferir la dermis a un nuevo tubo / botella en 4x pen / strep diluido en PBS 1x y se almacena a 4 ° C hasta su utilización. Dermis pueden almacenarse a 4 ° C durante un máximo de un año.
    6. 2. Modificar genéticamente primaria queratinocitos humanos

    NOTA: Use las células phoenix anfotrópicos cultivadas en medio DMEM completo [DMEM + 10% de suero bovino fetal (FBS) + penicilina / estreptomicina] para producir virus para infectar los queratinocitos humanos primarios. Genes de empaquetamiento virales que codifican proteínas tales como gag-pol y el sobre se integran de manera estable en el genoma de la célula phoenix que permite la producción de virus cuando se transfecta con un vector retroviral. Células Phoenix se pueden transfectar con una alta eficiencia permitiendo para alta producción de título viral. Virus producido a partir de esta línea de envasado también puede infectar una gran variedad de células de mamífero incluyendo humanos.

    1. Día 1: El día antes de la transfección, las células Phoenix semillas en una placa de 6 pocillos a una densidad de 800.000 células por pocillo en medio DMEM completo.
    2. Día 2: El día de la transfección, utilice 3 g de vectores retrovirales por pocillo. Alícuota 3 g de vector retroviral en un tubo de 1,5 ml. Use una mezcla de 100 μ; l DMEM más de 6 l de reactivo de transfección por cada 3 g de vector. Mezclar 6 l de reactivo de transfección con 100 l DMEM en un tubo de 1,5 ml. (Los vectores retrovirales que se utilizan se enumeran en la tabla de equipos / materiales).
      1. Incubar durante 5 min y añadir la mezcla de 106 l en el tubo de pre-alícuota que contiene el 3 g de vector retroviral. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Añadir gota a gota toda esta mezcla a cada pocillo de las células Phoenix.
    3. Día 3: El día después de la transfección, retire el medio de las células Phoenix y añadir 2 ml de medio DMEM fresca completa. El mismo día, la semilla queratinocitos humanos primarios en placas de 6 pocillos a una densidad de 75.000 células por pocillo. Mantener los queratinocitos en un medio de suero de queratinocitos libre (KCSFM) con antibióticos (penicilina / estreptomicina).
      NOTA: los queratinocitos humanos primarios fueron adquiridos. Las células se pueden comprar en una variedad de proveedores (que aparece en la tabla de materiales / Equipo).
    4. Día 4: Harconferir los medios de comunicación de las células transfectadas phoenix, que ahora contiene partículas virales. Pase los medios de comunicación a través de un filtro de 0,45 micras con una jeringa (para eliminar cualquier célula phoenix contaminantes) y coloque 2 ml en los queratinocitos (chapados a 75.000 células / pocillo el día anterior: véase el paso 2.3). Añadir bromuro de hexadimetrina (5 g / ml) a los medios para ayudar a mediar en el proceso de infección. Los títulos virales son ~ 1 x 10 7 TU / ml.
      1. Haga girar las placas de 6 pocillos en una centrifugadora a 200 xg durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la escisión, retire el soporte que contiene el virus y lavar las células una vez con PBS 1x antes de añadir KCSFM.
    5. Día 5: infectar el mismo lote de queratinocitos de nuevo como en el paso 2.4.
      NOTA: Seleccionar los queratinocitos utilizando un fármaco si hay un marcador seleccionable en el vector retroviral y expandir para su uso en análisis de aguas abajo o aplicaciones tales como cultivos organotípicos.

    3. Configuración de las Culturas de la piel organotípicos

    1. Construir elcasete organotípico a partir de materiales comunes que se encuentran en el laboratorio o las cintas puede ser por encargo a través de un taller de fabricación de metal (Figura 2 A - F). Para hacer estos cassettes de una placa de cultivo tisular 3,5 cm, utilizar un cauterio para eliminar un cuadrado de 1,0 cm x 1,0 cm desde el centro de la tapa de una placa de 3,5 cm (Figura 2A-B). Haga esto en condiciones estériles.
      1. Adjuntar clavijas cuadradas a la parte inferior de la casete (tapa de 3,5 cm plato) usando esmalte de uñas transparente (Figura 2C). Permitir 5 min para el esmalte de uñas se seque y voltear la casete de manera que está descansando sobre las clavijas cuadradas (Figura 2D). Coloque el casete en un plato de 6 cm.
        NOTA: Plaza clavijas se pueden comprar en una variedad de tiendas de artesanías.
    2. Preparar medio de crecimiento de queratinocitos (KGM) compuesta de 66% de DMEM, 22% F12 de Ham, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 10% de FBS, 2,67 g / ml adenina, 40 ng / ml de hidrocortisona, 10 la toxina del cólera ng / ml, 4,94 mg / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, 1,36 ng / ml triyodo-L-tironina, 10 ng / ml EGF, y 10 mg / ml de hidrocloruro de ciprofloxacino. Filtra los medios de comunicación a través de un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C hasta su utilización.
    3. Tome la dermis de la solución PBS 4x penicilina / estreptomicina + y lavar 2 veces en KGM y luego incubar en KGM a 37 ° C durante dos días antes de su uso.
    4. Cortar la dermis utilizando un bisturí para 1,5 cm x 1,5 cm trozos de tamaño y luego se coloca en el cassette organotípico. Coloque la dermis con la parte superior de la dermis hacia arriba. La parte superior de la dermis será el lado que entra en contacto con los queratinocitos (Figura 1B).
    5. Coloque la dermis pre-cortadas en el orificio cuadrado de la casete organotípicos con el lado superior de la dermis hacia arriba (Figura 3A).
    6. Voltear todo el casete organotípico contiene la dermis sobre el uso de fórceps (Figura 3B). Descongele la solución de la matriz extracelular en el hielo. Use una aguja y una jeringa para extraer 100 l de solución de matriz extracelular por casete. Añadir 5 gotas a la parte inferior de la dermis (lado brillante) y agitar ligeramente para asegurar una distribución uniforme por toda la dermis (Figura 3B).
    7. Permitir a 5 min de la solución comercial matriz extracelular para solidificar completamente (Figura 3C). Después de la solidificación, utilizar pinzas para voltear el casete hacia atrás. Añadir 4 ml de KGM al plato 6 cm.
    8. Coloque 0,5-1 millones de queratinocitos modificados genéticamente en los cassettes que contienen organotípicos la dermis (Figura 3D).
      1. Trypsinize queratinocitos mediante la colocación de 4 ml de tripsina al 0,05% en placas de 10 cm durante 5 min y se inactiva con 4 ml de medio DMEM completo.
      2. Contar los queratinocitos utilizando un hemocitómetro y luego girar hacia abajo a 200 xg durante 5 min. Resuspender las células 0,5-1.000.000 (dependiendo del número de células disponibles) en 90 μl de KGM y colocar todas las células en la dermis.
        NOTA: Es importante colocar el mismo número de células en la dermis dentro del mismo experimento para garantizar que las diferencias observadas en espesor de la epidermis regenerada no es debido a diferencias en el número de células de partida. Colocación de menos de 0,5 millones de células de la dermis puede conducir a una mala estratificación y diferenciación.
    9. Cambie medios KGM en los cultivos organotípicos cada dos días. Tejido Cosecha 1-14 días después de la colocación de los queratinocitos en la dermis. Estratificación completa y la diferenciación de la epidermis por lo general se produce después del día 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

El primer paso en la generación de la piel humana organotípicos es eliminar la epidermis de la dermis. La incubación de dos semanas de la piel en 37 ° C en 4x pen / strep / PBS debería permitir la separación de la dermis de la epidermis (Figura 1A). Si es difícil separar la epidermis y la dermis luego colocar el tejido a 37 ° C en 4x penicilina / estreptomicina / PBS durante una semana y luego tratar de pelar de nuevo utilizando fórceps.

Una de las claves para la regeneración de la epidermis humana en dermis desvitalizados es asegurar que los queratinocitos se colocan en el lado correcto de la dermis. La dermis tiene una parte superior y una parte inferior. La parte superior de la dermis es el lado que entra en contacto con los queratinocitos in vivo, así como en cultivos organotípicos. La parte superior de la dermis puede ser diferenciada de la parte inferior de la dermis debido a la brillantez de la parte inferior (Figura 1B). Si queratinocitos se colocan directamente sobre la parte inferiorlado (brillante) de la dermis, la epidermis no se diferenciarán o estratificar correctamente. Por lo tanto, es fundamental contar con la parte superior de la dermis (no brillante) hacia arriba en el casete organotípico. La dermis se pueden colocar directamente en un casete de organotípicos (Figura 2A - F). Cassettes hechas de placas de cultivo de tejidos deben ser esterilizados UV mientras casetes metálicos pueden esterilizarse en autoclave antes de la dermis que se coloca en. Los queratinocitos modificados genéticamente pueden entonces ser colocados en la dermis. Los queratinocitos se sumergen en un líquido inicialmente, ya que se colocan en la dermis se resuspendieron en KGM. Después de 24 h, la KGM se han difundido a través de la dermis que permite los queratinocitos a estar expuestos a la interfase aire-líquido que causa la estratificación y diferenciación en epidermis 7 (Figura 3).

ARN, proteína, ADN / cromatina, así como secciones de tejido puede ser recolectada de las s organotípicosculturas parentesco que se pueden usar para una variedad de aplicaciones posteriores. ARN se puede utilizar para determinar las diferencias de expresión génica entre el control y desmontables / tejido sobreexpresión mediante RT-qPCR, microarrays, o RNA-Seq. ADN / cromatina puede ser utilizado para ADN o-Chip Sec aplicaciones. La piel regenerada se puede montar en OCT y secciones congeladas se puede utilizar para inmuno-tinción o hematoxilina y eosina para evaluar la morfología del tejido, la expresión de proteínas / localización en grupos de control y experimentales.

Un ejemplo de esto se muestra en la Figura 4 con la tinción de hematoxilina y eosina de un cultivo típico de la piel organotípicos. Tenga en cuenta que las cuatro capas distintas de la epidermis se forman con expresión específica capa de proteínas relacionadas con la diferenciación (Figura 4) 11,12,14,15. Este sistema puede ser utilizado para determinar los efectos de la sobreexpresión o desmontables de diferentes genes en la epidermis. Figura 5 muestra tejido epidérmico regenerada que expresa control, LACZ así como el tejido sobreexpresa para SNAI2. La sobreexpresión de SNAI2 condujo a una inhibición de la diferenciación epidérmica como se indica por la falta de queratina 1 (K1) tinción, así como pérdida de expresión de genes de diferenciación inducida estructurales tales como TGM1 y SPRR1A (Figura 5A - C) 13,22. El espesor de la epidermis se muestra en la Figura 4 y la Figura 5 puede variar dentro de la misma muestra, debido a la acumulación de más células en el medio de la dermis frente a la periferia cuando las células se colocaron inicialmente en la dermis. Por lo tanto, las secciones intermedias tienden a tener la epidermis más gruesas, mientras que la periferia tiende a tener más delgada. Para la comparación directa entre diferentes muestras de las mismas regiones de una sección deben compararse. Sin embargo, la tinción para los marcadores debe permanecer constante.

</ html"Figura 1" src = "/ files / ftp_upload / 53280 / 53280fig1.jpg" />
Figura 1. Preparación de la dermis de la piel humana. (A) Después de la incubación de la piel humana a 37 ° C durante 2 semanas, la dermis se puede separar de la epidermis. Fórceps se utilizan para pelar la epidermis (de color marrón) lejos de la dermis (blanco). (B) La parte superior de la dermis se puede distinguir de la parte inferior por el brillo del tejido. La parte superior de la dermis (la parte que se enfrentará naturalmente la epidermis en vivo o donde los queratinocitos se sembraron) es no brillante. La parte inferior de la dermis es brillante. El tejido es de color rosa debido a la incubación en KGM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Generación de casetes organotípicos. (A) Utilice un cauterio para eliminar un cuadrado de 1,0 cm x 1,0 cm desde el centro de la tapa de un plato de 3,5 cm. (B) Retire la plaza del centro de la placa de 3,5 cm. (C) Use esmalte de uñas transparente para adherirse clavijas cuadradas. Permitir 5 minutos para el esmalte de uñas se seque. (D) Voltear la tapa sobre lo que está descansando en las clavijas cuadradas. El casete está ahora listo para ser utilizado. (E) La imagen de un metal fabricado casete organotípico con sus dimensiones. (F) La imagen de un casete fabricado de metal volteado boca abajo para mostrar las clavijas de soporte. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Generación de organotcultivos de piel YPIC. (A) Coloque la dermis con la parte superior de la dermis (lado no brillante) hacia arriba sobre el casete organotípico. (B) Da la vuelta al casete y añadir Matrigel hacia el lado brillante de la dermis. (C) Permita 5 minutos para el Matrigel se solidifique y luego voltear el casete hacia atrás. (D) Agregar modificado genéticamente queratinocitos de la dermis (0,5-1 millones de células se volvieron a suspender en 90 l de KGM). Recoger el tejido 1-14 días después de la siembra de los queratinocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. hematoxilina y eosina de cultivos de piel organotípicos. Regenerada piel humana contiene tanto la epidermis y la dermis. La epidermises totalmente estratificada y diferenciada con 4 capas distintas. Estas capas son la capa basal indiferenciada y las 3 capas diferenciadas incluyendo estrato espinoso, granuloso y córneo. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. La tinción de inmunofluorescencia y análisis de expresión génica de la epidermis humana genéticamente modificados. (A) La sobreexpresión de SNAI2 inhibe la diferenciación epidérmica. La tinción de la proteína queratina diferenciación 1 (K1) se muestra en verde y núcleos está marcado en azul (Hoechst). (B) Análisis de RT-qPCR en los niveles de mRNA de SNAI2 en LACZ de control y el tejido que sobreexpresan SNAI2. Las barras de error = SD, n = 3. (C) Análisis de RT-qPCR en el ARNmniveles de transcripciones de diferenciación KRT1, TGM1, y SPRR1A en LACZ de control y el tejido que sobreexpresan SNAI2. Las barras de error = SD, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La manipulación genética en la piel humana cultivos organotípicos ofrecen muchas ventajas para estudió comúnmente 2D células cultivadas, así como modelos de ratón. Culturas 2D carecen de las tres interacciones célula-matriz celular y extracelular de las células dimensionales que se encuentran en tejidos y órganos intactos. Estudios recientes también han encontrado enormes diferencias entre las células de cáncer de piel cultivadas en 2D y 3D con las células cultivadas en 3D que muestran mucho más similitudes de expresión génica a la piel humana primaria tumores 16. Cultivos de piel organotípicos humanos también tienen varias ventajas sobre los modelos de ratón. Los modelos de ratón son largo y costoso para generar, así como varias diferencias notables entre la piel humana y de ratón. Estos incluyen diferentes tasas de rotación de tejido, así como el espesor de la epidermis entre murinos y humanos epidermis 8. Con las nuevas tecnologías emergentes tales como CRISPR-CAS, los genes específicos pueden ser modificados / mutado para modelar enfermedades humanas de la piel utilizando cultur piel organotípicoes 23. Además, los genes pueden ser entregados o derribados en estas células a través de una amplia variedad de métodos, además de la transferencia génica retroviral se describe aquí. Mientras no es robusta a través de la entrega de alta eficiencia de transducción o la selección de medicamentos, el método puede ser empleado. Estos métodos de entrega incluyen nucleofection de siRNAs, lentiviral, virus adenoasociados y adeno virus 11,12,24-26.

Los cultivos organotípicos de la piel pueden ser modificados por la adición de diferentes tipos de células en el sistema. Por ejemplo, los fibroblastos humanos normales o alterados genéticamente se pueden añadir a la dermis desvitalizadas para estudiar mesenquimales y crosstalk epitelial. Las células inmunes también se pueden añadir a la dermis para estudiar la respuesta inflamatoria a las perturbaciones en la piel. Una limitación de este sistema es que el proceso de descamación que se produce in vivo no se produce en cultivos organotípicos. Esto evita el uso de estos cultivos a largo plazo y para la mayoría de los análisisse realiza entre 1-14 días después de la siembra de las células epidérmicas. Para los ensayos a más largo plazo, los cultivos organotípicos se pueden injertar sobre las espaldas de los ratones inmunodeprimidos 17,27.

El cultivo organotípico de la piel que se presenta aquí es único en que utiliza intactas dermis humana desvitalizados que es el sustrato natural de la epidermis in vivo mientras que la mayoría de los otros sistemas utilizan colágeno o Matrigel como el sustrato 28. Configuración de cultivos de piel organotípicos utilizando sustratos tales como los resultados de Matrigel en más delgado y menos robusto estratificación de la epidermis en nuestra experiencia. La dermis contiene proteínas membrana basal incluyendo laminina y colágeno que permite a las células epidérmicas para fijar, proliferan, se diferencian, y estratificar 29. El uso de dermis permite la generación de epidermis que imita su contraparte in vivo. Por lo tanto, cultivos de piel organotípicos pueden ser extremadamente valioso en s toxicológicos y farmacológicosos estudios de casos en los que no se permiten los estudios en animales (industria cosmética) 30.

Usando dermis desvitalizados también viene con sus propios inconvenientes puesto que el espesor de la dermis entre diferentes donantes o incluso dentro de la misma donante puede variar. Las células epidérmicas cultivadas en dermis gruesos tienden a no proliferar y generar tan grueso de la epidermis como las células cultivadas en la dermis más delgadas. Por lo tanto, es crítico para elegir dermis espesor similar al configurar los experimentos que comparan múltiples muestras. Otro parámetro crítico es sembrar el mismo número de células de la epidermis cuando se comparan diferentes grupos, de modo que las diferencias observadas no se debe a las diferencias en el número inicial de células sembradas.

En conclusión, el cultivo de piel organotípicos puede servir como un avanzado y eficiente modelo in vitro para la validación de las vías moleculares en un contexto más fisiológica, que en última instancia se acelerará la comprensión de gen regulador mechanismos que son importantes en crecimiento epidérmico y la diferenciación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Este trabajo fue supportedby la Sociedad Americana del Cáncer de Investigación estudiosos Grant (RSG-12-148-01-DDC) y el Premio de Biología CIRM Básica (RB4-05779).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human skin New York Firefighters Skin Bank http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP GIBCO 15140-122
amphotropic phoenix cell lines ATCC CRL-3213
FUGENE 6 transfection reagent Promega E2691
Keratinocyte Media (KCSFM) Life Technologies 17005042
DMEM GIBCO 11995
Ham's F12 Cambrex 12-615F
FBS GIBCO 10437-028
Adenine Sigma A-9795
Cholera Toxin Sigma  C-8052
Hydrocortisone Calbiochem 3896
Insulin Sigma I-1882
EGF Invitrogen 13247-051
Transferrin  Sigma T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride Serologicals 89-001-1
cautery Bovie Medical Corporation AA01
Matrigel Corning 354234
Keratin 1 antibody Biolegend PRB-149P
square pegs Arts and crafts stores
human neonatal keratinocytes ATCC PCS-200-010
human neonatal keratinocytes Cell Applications 102K-05n
MSCV retroviral vector Clontech 634401
LZRS retroviral vector Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector Oligoengine VEC-PRT-0002 
hexadimethrine bromide  Sigma H9268-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
  2. Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
  3. Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
  4. Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
  5. Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
  6. Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
  7. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
  8. Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
  9. Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
  10. Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14 (2013).
  11. Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
  12. Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
  13. Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
  14. Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
  15. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
  16. Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
  17. Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
  18. Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
  19. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
  20. Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
  21. Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
  22. Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
  23. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  24. Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
  25. Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
  26. Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
  27. Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
  28. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
  29. Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
  30. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).

Tags

Biología del Desarrollo Número 106 organotípico la piel la genética la interferencia de ARN la sobreexpresión retroviral queratinocitos fibroblastos la dermis epidermis la transducción las construcciones de la piel epitelio estratificado epitelio dermatología SNAI2 epiteliales de transición mesenquimal
Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, J., Sen, G. L. Generation of… More

Li, J., Sen, G. L. Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis. J. Vis. Exp. (106), e53280, doi:10.3791/53280 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter