Abstract
식물 진화 가장 자극 관측 중 하나는 자기장의 발생 (GMF) 역전 (또는 여행) 및 피자 식물 방사선의 모멘트 사이의 상관 관계이다. 이것은 GMF 극성의 변화가 식물 진화 역할을하는 가설되었다. 여기서는 GMF 인위적 조건을 반전하는 애기 장대를 노출시켜이 가설을 검증하는 방법을 설명한다. 우리는 3 축 자력계를 사용하여 수집 된 데이터는 GMF의 크기를 계산하는 데 사용 하였다. 세 개의 DC 전원 공급 장치는 세 개의 헬름홀츠 코일 쌍에 접속하고, GMF 조건을 변경하는 컴퓨터에 의해 제어했다. 페트리 접시에서 자란 식물은 모두 정상에 노출 GMF 조건을 반전했다. 가짜 노광 실험도 수행 하였다. 노출 된 식물을 실험 기간 동안 촬영 된 이미지는 루트 길이와 잎 면적을 계산하기 위해 분석 하였다. 애기 장대 총 RNA를 추출하여 정량적이었다실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에)는 CRUCIFERIN 3 (CRU3), 구리 수송 protein1 (COTP1), 산화 환원 응답 전사 Factor1 (RRTF1), 철 수퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 (1), (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal의 유전자 발현에 대한 분석을 수행 하였다 아스코르브 산염 퍼 옥시 다제 (TAPX), 세포질 아스코르브 Peroxidase1 (APX1), 및 NADPH / 호흡기 버스트 산화 효소 단백질 D (RbohD). 네 가지 기준 유전자 qPCR의 결과를 정규화하기 위해 분석 하였다. 네 가지 유전자의 최상의 선택하고, 정규화를위한 가장 안정한 유전자를 사용 하였다. 우리의 데이타는 코일을 사용하는 축 GMF의 극성을 반전하면 식물 성장 및 유전자 발현에 중요한 효과를 가지고 있음을 최초로 보여준다. 이것은 결국 P 선도, 더 높은 압력이 선택을 정당화 할 수 GMF 반전 식물 발달 변화를 유도에 기여 가설을 지원LANT 진화.
Introduction
지구의 자기장 (또는 동등 자기장, GMF)은 식물을 포함하여 지구상에 살고있는 모든 생물에 대한 피할 수없는 환경 적 요인이다. GMF는 항상 지구의 자연적인 기능을하고있다, 이렇게 진화하는 동안, 모든 살아있는 유기체는 행동을 경험했다. 증거 증가 체 GMF 여러 생물학적 과정에 영향을 미치는 1 수 있다는 것을 보여준다. GMF는 균일하지 않고 지구의 표면에서의 크기와 방향에 상당한 로컬 차이가있다. 지구 표면에서 GMF 미만 30 μT에서 약 70 μT에 이르기까지, 크기의 넓은 범위를 보여줍니다. GMF는 자기권 2를 통해 대전 된 입자의 대부분을 편향에 의해 태양풍의 치명적인 영향으로부터 지구와 생태계를 보호합니다.
식물은 환경 적 자극에 반응; 이러한 빛과 중력과 같은 비 생물 적 요소에 고전적인 반응은 T왔다horoughly 소위 phototropic gravitropic 및 응답을 정의하여 설명했다. 거의, 또는 아무것도,이 주제에 대한 발표와 최근 1 검토 서류의 과다에도 불구하고, 지각과 자기장에 식물의 반응의 메커니즘에 알려져있다. 중력장과는 달리, GMF하여 최근 다양 화와 분화 2 공장에 기여 결국 잠재적 인 원동력으로 간주 된 중요한 비 생물 적 스트레스 요인을 나타내는 식물 진화하는 동안 지속적으로 변경되었습니다. 지자기 역전 (또는 여행)는 GMF의 극성의 변화이다. 지구 생명의 역사 동안, GMF 반전이 여러 번 발생했습니다. 이 모든 극성 전환하는 동안 감소 GMF 강도의 기간에 지구를 노출. 낮은 강도의 GMF이 천이 기간이 유도되어, 지구 표면에 도달하는 태양 바람 전리 방사선 허용 할 수 있다는 몇몇 저자 가정 한진화 2 공장 선도 결국 유전자의 변화를 유도하기에 충분히 강한 수 있었다 살아있는 유기체에 일관성 스트레스.
식물에 대한 자기장의 효과를 설명하는 실험의 상세한 분석은 그럴듯 생물 물리학 적 상호 작용 메커니즘 결핍을 특징으로 충돌 보고서, 다수를 나타낸다. 다른 사람들이 궁극적으로, 3 설득력이있다, 검증 가능한 가설이 부족하면서 많은 실험은, 단순히 비현실적이다. 지난 몇 년 동안 식물에 자기장의 영향에 진보와 연구의 상태는 2,4-11을 검토하고있다. 최근, 낮고 높은 자기장의 효과는 충분히 발전 플랜트 2 GMF 반전 이벤트 참여에 특히 초점을 맞춘 하나를 논의하고있다.
가장 직접적인 수단은 GMF 역전 식물의 진화는 GMF를 합성하는 것입니다 영향을 미치는 가설을 입증하기정상 및 반전 자계 상태에 식물의 응답을 테스트하여 실험실에서 반전. 가설을 시험하기 위해, 우리는 따라서 정확하게 정상 GMF 조건 역방향 수 각형 축 헬름홀츠 코일 쌍 자계 보정 시스템 (축 코일)를 구축했다.
우리는 모델 식물로 애기 장대를 사용하여 우리는 몇 가지 중요한 유전자의 유전자 발현에 반대 GMF의 효과 테스트 : CRUCIFERIN 3 (CRU3), 티로신 인산화이고 그것의 인산화 상태가 응답 변조 12S 종자 저장 단백질을 암호화 애기 장대 씨앗 12,13에서 ABA에; 토양 구리 수집 및 꽃가루 개발 (14)의 주된 기능을 가진 중금속 전송 / 해독 상과 단백질을 코딩하는 구리 운송 Protein1 (COTP1); 및 산화 - 환원 응답 전사 Factor1 (RRTF1)즉, ERF (에틸렌 응답 인자) 아과의 B-3 유전자 발현 경로의 상승 공동 활성화를 촉진하고 비 생물 교차 내성을 부여하고 생물 15 강조 한 AP2 도메인을 포함 ERF / AP2 전사 인자 패밀리의 구성원을 암호화한다.
더욱이 우리는 또한 산화 스트레스 반응에 관여하는 다섯 유전자 분석 : 효소 적으로 빠르게 슈퍼 옥사이드 음이온 변환 세포질 효소를 코딩 철 과산화물 Dismutase1 (FSD1)를, (O 2 -) 및 물 (H 2 O) 과산화수소 (H 물과 산소 (17, 18)로 H의 붕괴 2 O 2 촉매 Catalase3 (즉, 인코딩 것을 CAT3), 효소, 2 O 2)와 산소 분자 (O 2) 16 Thylakoidal 아스코르브 퍼 옥시 다제 (TAPX), 인코딩 H 2 O를 청소합니다 엽록체 틸라코이드 퍼 옥시 다제2 (19), H 2 O 2를 없애고 NO 유래 분자 (20)에 의해 매개 번역 후 변형의 잠재적 인 목표 중 하나를 나타냅니다 세포질 퍼 옥시 다제를 암호화 아스코르브 Peroxidase1 (APX1); 및 O 2를 생성하는 효소 인코딩 NADPH- 호흡기 버스트 산화 효소 단백질 D (RbohD) - 및 애기 장대 (21)의 성장, 개발 및 스트레스 반응을 조절하는 중요한 역할을합니다.
우리의 필드 - 반전 방법론 GMF의 반전 A.의 형태학 및 유전자 발현에서 유의 한 변화를 유도 할 수 있다는 첫번째 증거를 제공한다 장대 뿌리 촬영. 이 프로토콜은 RO의 논의 식물 형태학 및 유전자 발현에 GMF 반전의 효과를 평가하고, 식물의 동작의 다른 측면에 GMF 반전의 잠재적 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있으며, 이에 의해 안내 혁신적인 방법을 제공한다식물의 진화에 GMF 반전의 제작.
Protocol
3 축 코일 1. 설정
참고도 1은 GMF를 반대로 사용 축 코일을 도시한다.
- 그 프로브 축 코일에 삽입 된 3 축 자력계, 켭니다.
- 데이터가 세 축 자력계에서 수집 할 수있는 자력 소프트웨어를 컴퓨터를 켜고 시작합니다.
- GMF의 크기를 계산하기 위해 자기력에 의해보고 된 성분 값을 사용한다. 자력계 값 인스턴스에 대해 : Bx로 = 6.39 μT, 저자 = 36.08 μT, BZ = 20.40 μT가 다음 식을 사용하여 41.94 μT의 전계 강도를 계산한다 :, B = B의 GMF + B 추가적인 여기서 B 추가 = (Bx로 2 + 2 + BZ 2)으로 ½ (즉, 예에서 41.9 μT.)
- 세 개의 DC 전원 공급 장치에 (듀얼 범위 : 0-8V / 5A 및 0-20V / 2.5A, 50W)를 ON 세 COUPL에 연결된 각 하나를헬름홀츠 코일 ES 및 GPIB 연결 (도 1b)을 통해 컴퓨터에 접속.
- 전원 공급 장치의 설정 전압은 반전 자계 벡터와 원하는 자기장을 생성한다. 새로 생성 된 B를 생성하기 위해 예를 들어, 단계 130 및 여기에 설명 된 계기의 코일의 크기와 같은 B GMF와 V로 전압을 설정할 X = 0.00 V, V의 Y = 30.52 V, V의 Z = 0.00 V = B GMF + B의 축 코일 = (6.38, -36.08, 20.39) μT. 즉, 같은 B 형 GMF 같은 크기하지만 다른 방향을 가리키는 새로운 분야.
- 1.3에 기재된 절차를 이용하여 자력 소프트웨어 새로운 필드를 확인한다.
- 모두 정상으로 식물을 노출하고 2 절에 설명 된대로 페트리 접시를 사용하여 GMF 조건을 반전.
- 동일 필드의 크기를 유지하여 노광 모의 실험을 수행 | B GMF | 및 유지GMF의 그러나 동일한 필드의 수직 성분 필드 반전 조건에 비해 축 코일에 동일한 전류와 필드의 수평 성분의 방향 (즉, "북쪽, 동쪽 또는 서쪽")을 변화. 1.5에 설명 된 코일의 전압을 변경함으로써 이것을한다.
주 :이 가짜 노광 전위 미묘한 가열하거나 또는 코일로부터 진동 효과 자체 또는 코일을 제어하는 데 사용되는 전자 제품을 배제한다. - 데이터의 나머지 실험을 수행 및 / 또는 해석에서 인력 맹검 현장 조건을 적용하여 이중 맹 실험을 실행.
식물 재료 및 식물 성장을위한 조건 2. 준비
- 애기 장대의 종자를 이용, 생태형 콜롬비아 0 (골 0), 1.5 ㎖의 튜브에 제자리 표면은 5 %로 처리하여 살균 (w / v)의 차아 염소산 칼슘 용액 및 0.02 % (v / v)의 트리톤 X-연속 진탕 25-28 ℃에서 10-12 분, 80 % 에탄올 (EtOH 중), 100. 그리고 100 % EtOH로 씻어, 80 % EtOH로 두 번 헹구고 마지막으로 멸균 증류수로 헹군다.
- 추가하여 매체를 수정 무라 시게하고 스쿡 (22) (MS)의 1 L 준비 : MS의 2.297 g (0.5 × MS 바살 염 혼합물), 10g의 자당, 1 패, KOH로 조정 산도 5.8-6.0에 탈 이온수를 위로. 20 분, 120 ° C에 대한 한천과 오토 클레이브의 16g을 추가합니다.
- 응고하기 전에 각 (120 X 120mm 2) 정사각형 페트리 접시에 배지 80 ml에 붓는다. 왁스 필름 판을 밀봉 한 후 접시에 삼십 멸균 씨앗을 뿌리고합니다.
- 강화할 및 발아를 동기화 한 다음 중 하나를 정상으로 페트리 접시를 노출 또는 GMF를 역전 2 일 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 수평으로 판을 Vernalize.
- 축 코일 내부와 축 코일 외부 모두 병렬 실험에서 수직으로 22 ° C에서 기후 통제 된 환경에서 씨앗을 노출나트륨 증기 램프를 사용하여 8 시간의 어둠과 16 시간의 빛의 광주 일정, 아래 (220 × 10 -6 E 분 -2 S-1). 램프의 적색 성분을 감소시키기 위해 주목 블루 젤라틴 필름을 사용한다.
- 일반 (제어) 모두 RNA 추출과 반전 (처리) GMF 조건 10 일 전 식물을 노출.
- 노출 후, 배양 접시의 사진을 찍을.
- 뿌리의 길이와 잎 부분을 계산하기 위해 ImageJ에 소프트웨어를 사용합니다.
- 간단히, 다음 페트리 접시의 정확히 플레이트 측을 교차하는 선을 그립니다 "STRAIGHT"행 옵션을 사용하여 이미지를 열고, 페트리 접시의 측면을 측정한다.
- "분석"메뉴에서 "설정 규모"를 선택하고 "알려진 거리"상자 (예를 들어, 120mm), 다음 길이 (mm) 단위를 삽입에 실제 거리를 삽입; 마지막으로 모든 측정에 대한 설정을 사용할 수 있도록하기 위해 "글로벌"옵션을 클릭합니다.
- 캥거루의 경우T 길이, 프리 핸드 도구를 사용하여 조심스럽게 뿌리의 모양을 따릅니다. "분석"메뉴에서 "측정"옵션을 사용하여 길이를 측정한다. 사진의 모든 뿌리를 측정하고 또한 통계 분석을위한 파일을 저장하기 위해 계속합니다.
- 잎 영역은 "이미지"메뉴에서 옵션을 누른 다음 "컬러 임계 값을"조정 사용할 수 있습니다. 각각의 잎을 선택하고 "분석"메뉴에서 "입자를 분석"을 선택합니다. 통계 분석에 대한 개별 측정 값을 저장합니다.
3. 애기 전체 RNA를 추출, 정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에) 반응 조건 및 애기 장대 프라이머
- 별도로 30 촬영 30 뿌리를 수집하고 즉시 액체 질소에 동결. 그리고 박격포와 유 봉 액체 질소에 갈기.
- manufactur의를 사용하여 정제 키트의 RNase와 DNase를 무 처리 키트를 사용하여 총 RNA를 분리어의 지시.
- 제조업체의 지시에 따라 RNA 나노 키트 및 모세관 겔 전기 영동을 사용하여 샘플의 질과 양을 확인한다. 분광 RNA의 정량을 확인합니다.
- 총 RNA와 제조업체의 권장 사항에 따라 첫 번째 가닥 cDNA를을 얻기 위해 cDNA를 역전사 키트를 사용하여 랜덤 프라이머의 2 μg의를 사용합니다.
- 내부로드 표준으로 ROX으로 SYBR 녹색 나는를 사용하여 실시간 시스템의 모든 실험을 수행합니다.
- 배 SYBR 녹색 qPCR에 마스터 믹스의 12.5 μL, cDNA를 0.5 μL, 100 nm의 프라이머로 구성된 혼합물의 25 μL와 반응을 수행합니다. 표 1의 프라이머를 사용한다. 제어에 (게놈 DNA의 오염을 모니터링 역전사없이 총 RNA를 이용하여) 비 RT 제어 및 비 제어 템플릿 (물 대신 템플릿)을 포함한다.
- 표준을 사용하여 모든 프라이머 쌍에 대한 프라이머 효율을 계산곡선 (23)에있어서.
- CRU3, COTP1, RRTF1 다음 PCR 조건을 사용합니다. 95 ° C에서 10 분, 95 ° C, 58 ° C에서 30 초, 72 ℃에서 30 초에서 15 초 40주기, UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3, TAPX, APX1, RbohD, FeSOD1 (10) 분 95 ° C에서 95 ° C, 57 ° C에서 20 초, 72 ℃에서 30 초에서 15 초 40주기.
- 각 소둔 및 확장 단계 다음 형광을 읽어보십시오. 모든 실행을위한, 열 프로파일에 해리 세그먼트를 포함하여 55 ° C에서 95 융해 곡선 분석을 수행한다. 해리 프로파일 (온도의 함수로서 형광의 플롯)을 보려면 결과 탭을 통해 액세스 해리 곡선 화면을 사용한다. 실험의 해리 세그먼트 동안 수집 된 데이터 세트를 분석 / 설정 화면을 사용하여 분석을 위해 선택되어 있는지 확인합니다.
- L 결정세 가지 기술 복제 24,25 분석 3 개의 독립적 인 RNA의 추출로부터의 cDNA를 사용하여 10 배의 일련의 희석 (1- -fold 3 내지 10)을 수행하여 임계 사이클 값 (CT 값)에 템플릿 농도 범위 inear.
- 코네티컷 값들을 획득하기 위해 실시간 PCR 기기 소프트웨어 모두 증폭 플롯을 분석한다. 교정과 같이 다음과 최고의 하우스 키핑 유전자의 수준 상대 RNA 수준을 정상화 : 3.11.1) 결과 탭을 통해 플롯이 화면 증폭 액세스, 데이터 분석 선택 / 설정 화면을 사용하여 분석되어야하는 램프 또는 고원을 선택, 다음 명령 패널의 형광 메뉴에서 DRN (베이스 라인 보정 표준화 된 형광)을 선택합니다. 샘플 우물 CT는 값을 표시하는 결과 탭을 통해 샘플 값은 화면 플레이트에 액세스 할 수 있습니다.
- 네 개의 다른 표준 발현 유전자를 사용하여 [예를 들면, 세포질 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소, (GAPC2), 유비퀴틴의 사양IC 프로테아제 6 (UBP6) Actin1 (ACT1) 및 연장 인자 1B 알파 소단위 2 (eEF1Balpha2)]을 실시간 PCR의 결과를 정규화한다. 분석 소프트웨어 (26)를 사용하여 유전자를 위 상단을 선택합니다; 정상화를위한 가장 안정적인 유전자를 사용합니다.
- 간단히, 샘플 명을 포함한 유전자 이름과 첫 번째 행을 포함하는 제 컬럼 엑셀 시트에 상기 입력 데이터를 구성. 그런 다음 메뉴 바에서 분석 소프트웨어를 선택합니다. 입력 데이터를 선택하는 대화 상자를 사용합니다.
- 다음 필드를 샘플 이름, 유전자 이름과 간단한 출력 만 확인합니다. 분석을 수행하기 위해 이동 버튼을 클릭합니다. 가장 안정적으로 표현 후보 유전자로 (작은 안정성 값이있는) 맨 위 유전자를 선택합니다.
- 싹과 뿌리 모두에서 차동 배 변화 식을 보여줌으로써 플롯 데이터.
4. 통계 분석
- 표준 오차 ± 평균 값으로 데이터를 표현한다. 공동 비교ntrol과 분산 (ANOVA)과 페로 니 던-Sidak 조정 확률 테스트 (0.95 % 신뢰도)와 Tukey에의 시험 분석을 수행하여 치료 그룹.
Representative Results
이 프로토콜의 목적은, 설정되면 GMF를 반대로 사용하는도 1a에 도시 된 바와 같이 자기장 (GMF)의 반전이 식물 발달과 애기 장대 생태형의 안부 0 삼축 코일의 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는지 여부를 평가하는 방법을 제공하는 것이다 프로토콜의 단계 1.5에 설명 된대로 적절한 구동 전압 (그림 1B)를 얻을. 축 코일의 크기는 ~ 몇 페트리 접시를 호스트 반전 GMF 조건에 충분한 공간을 허용 2 × 2 × 2m 3. 컨트롤 같은 환경 조건 및 GMF 정상 값에서 성장시켰다. GMF 조건 정상에 노출 된 후 10 일 후와 반전, 식물의 표현형은 분명 형태 학적 변화를 보여 주었다. 도 2에 도시 된 바와 같이, (GMF 정상 조건에서 성장 예) 대조군 식물은 유의 (던-Sidak과 페로 니 조정 PROB <0.001로 루트 길이를 보였다;반전 GMF에 노출 된 식물에 대해 (17.53 mm의 N = 32), 학생의 T = 10.68, DF = 31)보다 높은 값 (29.41 mm; SEM = 1.04 SEM = 0.58; N = 36). GMF 반전 식물에서, 촬영의 형태는 전단지 확장의 감소 현상을 보여 변경되었다. 학생의 t = 31.32, DF 정상 조건에 노출 된 식물은 4.95 mm 2 (SEM 0.025, N가 = 54), 반전 GMF 조건에 노출 된 식물이 크게 나타났다 반면 (던-Sidak과 페로 니 조정 PROB = <0.001의 평균 잎 면적을 보였다 = 53) 낮은 잎 영역 값 (3.71 mm 2; SEM = 0.032; N = 54). 따라서, 반전 GMF 조건 애기 노출 루트 길이와 잎 면적 모두의 감소를 유도.
잎과 뿌리 팽창 성장 및 세포 분열 (27)의 신장 모두에 의존한다. 따라서, 식물 개발, 생산성과 전반적인 체력은 <최적의 shoot- 루트 시스템 아키텍처에 따라 달라집니다SUP> 28. 반전 GMF 조건에 노출 된 식물의 감소 된 루트 길이와 잎의 크기는 자계 강도의 변화를 인식 할뿐만 아니라 감지 시스템의 존재 수 나타낼뿐만 아니라, 중력에 비해 자장 "방향"에서의 변화에 응답 할 수. GMF 반전은 식물의 성장에 영향을 미칠 수있는 가설은 GMF 반전 조건에 크게 식물 발달에 영향을 미칠 수 있음을 입증 실험에서 강력한 증거를 발견한다.
형태 학적 변화는 유전자 발현의 변화를 수반 하였다. 하우스 키핑 유전자 중 가장 안정한 유전자 신장 인자 1B 알파 - 서브 유닛 (2)이었다. 유전자 (CRU3, COTP1, RRTF1)의 첫 번째 그룹은 유전자 발현에서 극적인 변화를 (도 3)를 보였다. 모든 세 유전자의 발현이 유의하게 보호구에 노출 된 식물의 약 2.5 배 (P <0.05) 증가 하였다 촬영할D GMF 조건. CRU3 뿌리 발현은 정상 GMF 조건에 노출 된 식물의 뿌리에 상향 조절하지만 (P <0.05) 반전 GMF 조건에서 상당히 하향 조절 하였다. 반대는 (그림 3) 정상 조건에서 하향 조절과 GMF 반전의 존재 상향 조절했다 COTP1과 RRTF1에 대한 발견되었다.
Cruciferin (12 S 글로불린)는 A의 씨앗에서 가장 풍부한 저장 단백질이다 장대와 다른 crucifers과는 거친 소포체에서 전구체로 합성된다. 그런 다음 단백질 저장 액포 (13)에 반송된다. 발아 모종하는 질소의 초기 소스로서 사용 cruciferin의 분해를 필요로한다. 하향 조절 저하를 cruciferin의 세포 구조 나 세포 구성 요소 개발 (29, 30)을 손상에 의해 배아 개발을 줄일 수 있습니다. 우리의 결과는 CRU3의 상향 조절과 함께 상관 관계가 있음을 보여따라서 그 과발현 GMF 반전에 민감하고이 유전자는 식물의 발달의 감소에 기여할 수 있음을 나타내는 하부 잎 팽창 및 축소 루트 길이. 또한, GMF 반전은 감소 루트 길이와 상관 관계 뿌리 CRU3 상당한 하향 조절을 유도한다. 구리는 식물의 주요 공정에 필수적인 보조 인자이지만, 과잉의 유해한 영향을 미친다; 따라서, 구리 전송을 과발현하는 식물 성장을 손상시킨다. GMF 반전의 효과는 따라서 감소 된 식물 성장을 설명, 신초와 뿌리에서 모두 COTP1 상당히 과발현되었다. 이온 응력 단단히 세포의 산화 환원 상태로 링크 된 엽록체의 신진 대사를 저해. 애기 장대에서 전사 인자 RRTF1 31 독스 변화에 적응하는 능력에 관련된 유전자의 발현에 중요하다. 따라서, 식물들은 생리적 및 개발을 변경할 수있는 외부 자극에 노출 될알 프로그램이 중요한 전사 인자의 과잉 발현이 예상된다. GMF의 반전 따라서 반전 GMF 조건에 식물의 높은 산화 스트레스 반응을 나타내는, 싹과 뿌리 모두 RRTF1의 중요한 과발현을 유도.
흥미로운 결과는 산화 스트레스에 관여하는 유전자를 다섯 분석함으로써 얻어진다. 일반적으로, 촬영에서 추출하고 분석하는 모든 유전자는 식물이 정상에서 재배 또는 GMF 조건 (그림 4, 그림 5) 반전했다 유의 한 차이 (p> 0.05)를 보이지 않았다. 그러나, 상당한 하향 조절은 항상 역전 GMF 조건에 노출 된 식물의 뿌리에서 관찰되었다. 특히, CAT3 (그림 5), APX1, FSD1, RBOHD 및 TAPX (그림 4)에 의해 하향 조절의 순서에 따라 가장 높은 하향 조절을 보여 주었다.
에 대한 상호 허용생물 적 및 생물학적 스트레스는 여러 가지 생화학 적 경로에 관여하는 다른 유전자의 활성화에 의해 제공된다. RRTF1 전사 인자가 이러한 경로 15,31의 유전자 발현의 상승 공동 활성화를 용이하게하고, 잠재적으로 산화 스트레스 (32)에 관련 될 수있다. 산소 소거가 감소 될 때 따라서 RRTF1의 상향 조절이 예상된다. 루트 소기 효소의 하향 조절은 증가 된 산화 적 스트레스에 대응하여 작용 RRTF1의 상향 조절과 상관. CAT3, APX1 및 TAPX의 극적인 루트 하향 조절은 FSD1의 하향 조절하여 슈퍼 옥사이드 음이온을 dismutate 할 수있는 능력이 감소를 동반 H 2 O 2, 폐품을하려면 루트 세포의 감소 능력을 나타냅니다. 산화 스트레스 반응은 반전 GMF 인식의 주요 사이트가 될 것으로 보인다 뿌리에서 더 높다.
그림 1. 자기장 보상 시스템. (세 직교 축 각각에 대한 각형 코일 쌍을 포함하는) (A) 축 코일은 자기장 벡터를 반대로 사용. (B) 컴퓨터 제어 전원은 헬름홀츠 코일의 각각의 쌍에 접속된다. (이 그림에서 전압이 임의적) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 애기 형태에 자기장 역전 2. 효과. 노출 제어 식물의 십일 후 (정상 GMF 조건에 노출 된 사람들은 IE) 상당히 큰 뿌리의 길이와 더 EXPAN을 보여DED 전단지 반전 GMF 조건에 노출 된 식물에 비해. 메트릭 바 = 18mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 애기 장대 유전자 발현에 자기장 역전 3. 효과. 노광 열흘 후, 대조군과 식물의 총 RNA를 추출하고, 발현 분석 실시간 PCR에 의해 분석 하였다. . COTP1, 구리 전송 Protein1; RRTF1, 레 독스 응답하여 전사 Factor1 GMF의 반전 효과 CRU3, Cruciferin 3 테스트 한 모든 유전자의 유전자 발현의 현저한 변화를 유발하는 것이었다. 바 표준 오류를 나타냅니다; 별표 (PL) 사이에 유의 한 (P <0.05) 차이를 나타냅니다반전 정상 GMF 조건에 노출 개미. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 애기 항산화 관련 유전자 발현에 자기장 역전 4. 효과. 노광 열흘 후, 대조군과 식물의 총 RNA는 격리 및 실시간 PCR을 사용하여 유전자 발현의 분석을 위해 사용. GMF의 반전의 효과는 촬영 유전자 발현에 큰 변화를 유도하지했다; 그러나, 급격한 하향 조절 반전 GMF 조건 하에서 성장 된 식물의 뿌리 유전자 발현이 관찰되었다 TAPX, Thylakoidal 아스코르브 퍼 옥시 다제;. APX1, 아스코르브 Peroxidase1; FSD1, 철 과산화물 Dismutase1; RbohD, NA를. DPH / 호흡기 버스트 산화 효소 단백질 D 바 표준 오류를 나타냅니다; 별표 반전 정상 GMF 조건에 노출 된 식물 사이에 유의 한 (P <0.05) 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 애기 장대 카탈라제 3 (CAT3) 유전자 발현에 자기장 역전 5. 효과. 노광 열흘 후, 대조군과 식물의 총 RNA는 격리 및 실시간 PCR을 사용하여 유전자 발현의 분석을 위해 사용. GMF의 반전의 효과는 촬영 유전자 발현에 큰 변화를 유도하지했다; 그러나, 급격한 하향 조절 반전 GMF 조건 하에서 성장 된 식물의 뿌리 유전자 발현이 관찰되었다. 바 표준 erro를 표시아르 자형; 별표 반전 정상 GMF 조건에 노출 된 식물 사이에 유의 한 (P <0.05) 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
우리는 최근 놀라운 상관 관계가 GMF 반전과 가족 피자 식물 계통의 대부분의 전환 2 발생한 시간 사이에 존재하는 것으로 나타났다. 그러나, GMF 반전 자체가 식물 유전자 발현과 형태에 상당한 변화를 유도 할 수있는 자극 가설하고 다양한 GMF 강도의 효과에 대한 연구의 과다, 가정에도 불구하고 입증 된 적이있다. 여기서 우리는, 처음 우리 실험실에서 GMF를 반대로 축 각형 헬름홀츠 코일을 사용하고, 주변 자계의 반전 표현형 변화 및 식물에서 유전자 발현의 조절을 일으킬 수있는 방법을 보여준다.
식물 생장 실험 (2 × 2 × 2m 3)에 대한 충분한 양 위에 GMF 반전 (또는 수정)를 얻기 위해, 우리는 팔각형 헬름홀츠 코일 시스템을 구축했다. 이 시스템은 (일반적으로 헬름홀츠 코일 링 모양의 작은된다)를 상업적으로 사용할 수 없습니다건설에 대한 비용은 상당한했다. 중요한 것은,이 시스템은 수정 된 자기장에 뛰어난 시간 안정성 및 균질성 견고한 필드의 변경을 제공한다.
시스템이 정상 상태로 천분의 GMF의 값을 감소 시키거나 자기장의 입체적 임의 역방향 설계 및 구축된다. 그러나, 코일의 설계는 높은 자기장 세기를 생성 할 수 없습니다. 따라서, 본 형태의이 장비는 식물이나 다른 생물에 높은 자기장 강도의 효과를 평가하기위한 실험에 적합하지 않습니다.
실험실에서는, 이러한 방법에 기재된 것과 유사한 GMF의 변화는 자기장을 벗어나 금속 자체 내에서 농축 높은 투자율과 강자성 금속 플레이트에 의해 실험적 영역을 둘러싸 의해 차폐 포함한 다양한 방법에 의해 얻어진다. 목헬름홀츠 코일을 이용하는 전자의 이점은 시스템 따라서뿐만 아니라 시험관 내 연구 (배양 접시의 사용과 같은) 이상 또한 만드는 식물보다 자연 조건 (빛, 공기 순환 등)에 노출 될 수 있다는 것이다 생체 내 식물의 성장 및 개발 실험. 우리 시스템 사이즈 따라서 여러 페트리 접시 또는 일부 작은 호스트 있도록 (도 1a 참조)를 25 × 25 × 25 ㎤의 구면 볼륨에 걸쳐 천연 GMF의 <1 / 1,000까지 억제 할 수있는 공간을 만들어 식물의 성장을위한 냄비.
여기에 제시된 방법은 식물 생물학 연구에 적용되었습니다; 그러나 시스템은 바이러스학 및 미생물학 실험 포함한 광범위한 허용뿐만 아니라, 선충 (예, 예쁜 꼬마 선충), 및 절지 동물 (마우스 및 래트를 포함)에 작은 동물 연구. 따라서, 가설의 시험 GMF의 역전 할 수있다형태와 전사의 변화는 아마도 궁극적으로도 인간의 세포에, 다른 많은 생명체로 확장 될 수있다 유도.
GMF는 끊임없이 변화 및 변동됩니다. 따라서, 우리의 실험에 하나의 주요 과제는 원하는 새로운 GMF 값들을 획득하기 위해 GMF의 일정한 보상을 제공하는 것이다. 이것은 단지 자력계 값 및 전압 보상의 판독을 통해 자기장 값의 연속 제어에 의해 달성 될 수있다. 따라서, 시스템의 GMF 서서히 변하는 부분을 보상 할 수 있지만, 더 높은 주파수의 변동에 대해 아무것도하지 않는다.
결론적 GMF 벡터를 반대로 축 코일의 사용은 GMF 벡터의 반전이 식물 형태 변화 및 차등 유전자 발현을 유도 할 수 있다는 것을 입증하기에 쓸모 있었다. 제시된 방법으로 얻어진 결과들은 가설 GMF 재지지하는 강력한 증거를 제공한다versals은 지질 학적 시간 척도 2 위에 식물 진화의 원동력 중 하나가되었을 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
| DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
| Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Ethanol | Sigma | 2860 | |
| GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
| RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
| RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
| 2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Petri dish square (120 x120 mm2) | Sigma | Z692344 |
References
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