Abstract
En av de mest stimulerande observationer i växternas evolution finns ett samband mellan förekomsten av jordens magnetfält (GMF) återför (eller utflykter) och den tidpunkt då strålningen från Angiosperms. Detta ledde till hypotesen att förändringar i GMF polaritet kan spela en roll i växternas evolution. Här beskriver vi en metod för att testa denna hypotes genom att exponera Arabidopsis thaliana att artificiellt omvänd GMF villkor. Vi använde en treaxlig magnetometer och insamlade data användes för att beräkna storleken på GMF. Tre likspänningskällor anslöts till tre Helmholtz spolpar och kontrollerades av en dator för att ändra GMF villkor. Växter som odlas i petriskålar exponerades för både normala och omvända GMF villkor. Sham exponering experiment genomfördes också. Utsatta växter fotograferades under experimentet och bilder analyserades för att beräkna rotlängd och blad områden. Arabidopsis totalt RNA extraherades och KvantitativReal Time-PCR (qPCR) analyser utfördes på genuttrycket av kruciferin 3 (CRU3), koppartransport protein1 (COTP1), Redox transkriptions Factor1 (RRTF1), Fe superoxiddismutas 1 (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal askorbatperoxidas (TAPX), ett cytosoliskt askorbat Peroxidase1 (APX1), och NADPH / respiratoriska utbrott oxidas protein D (RbohD). Fyra olika referensgener analyserades för att normalisera resultaten av qPCR. Den bästa av de fyra generna valdes och den mest stabila genen för normalisering användes. Våra data visar för första gången att reversera GMF polaritet med hjälp av treaxliga spolar har betydande effekter på växternas tillväxt och genuttryck. Detta stöder hypotesen att GMF återföring bidrar till att framkalla förändringar i växtutveckling som skulle kunna motivera en högre selektivt tryck, så småningom leder till plant evolutionen.
Introduction
Jordens magnetfält (eller ekvivalent det jordmagnetiska fältet, GMF) är en ofrånkomlig miljöfaktor för alla organismer som lever på planeten, inklusive växter. GMF har alltid varit en naturlig del av jorden, så under evolutionen, alla levande organismer upplevde sin talan. En ökande mängd bevis visar att GMF kan påverka många biologiska processer 1. GMF är inte enhetlig och det finns stora lokala skillnader i sin storlek och riktning vid jordytan. GMF vid jordytan visar ett brett utbud av storheter, allt från mindre än 30 pT till nästan 70 pT. GMF skyddar jorden och dess biosfär från de dödliga effekterna av solvinden genom att avleda de flesta av sina laddade partiklar genom magneto 2.
Växter reagera på stimuli från omgivningen; och klassiska svar på abiotiska faktorer såsom ljus och gravitation har thoroughly beskrivits genom att definiera den så kallade phototropic och gravitropic svar. Mycket lite, eller ingenting är känt om mekanismerna för perception och svar växter till magnetfält, trots de många artiklar publicerade om detta ämne och nyligen recenserade 1. Till skillnad från gravitationsfältet, GMF förändrats genomgående under växternas evolution och därmed utgör en viktig abiotisk stressfaktor som nyligen har betraktas som en potentiell drivkraft så småningom bidra till att plantera diversifiering och artbildning 2. Geomagnetiska återföringar (eller utflykter) är förändringar i polaritet GMF. Under jordens livs historia, GMF återför inträffade flera gånger. Dessa utsatta planeten perioder med reducerad GMF styrka under varje polaritet övergång. Vissa författare har en hypotes om att dessa övergångar perioder med låg GMF styrka skulle ha tillåtit joniserande strålning från solvinden att nå jordytan, och därigenom inducera enkonsekvent stress levande organismer, som skulle ha varit tillräckligt stark för att framkalla genförändringar till slut leder till växternas evolution 2.
En detaljerad analys av experiment som beskriver effekterna av magnetfält på växter visar ett stort antal motstridiga rapporter, som kännetecknas av en brist på rimliga biofysiska interaktionsmekanismer. Många experiment är helt enkelt orealistiskt, medan andra saknar en testbar hypotes och i slutändan är inte övertygande 3. Under de senaste åren har utvecklingen och status forskning om effekterna av magnetfält på anläggningen granskats 2,4-11. Nyligen har effekten av både låga och höga magnetfält diskuterats ingående 1, med särskild inriktning på medverkan av GMF återföring händelser på växternas evolution 2.
De mest direkta sättet att styrka hypotesen att GMF återför påverkar växternas evolution är att syntetisera en GMFåterföring i laboratoriet genom att testa svaret av växter till normala och omvända magnetiska fältförhållanden. För att testa hypotesen, därför byggde vi en treaxlig åttkantiga helmholtzspole-par magnetfält kompensationssystem (treaxliga spolar), som är i stånd att korrekt vända normala GMF förhållanden.
Vi använde Arabidopsis thaliana som en modellväxt och vi testade effekten av omvända GMF på genuttryck av några viktiga gener: kruciferin 3 (CRU3), som kodar för en 12S frölagringsprotein som är tyrosin-fosforylerad och dess fosforyleringstillstånd moduleras som svar till ABA i Arabidopsis thaliana frön 12,13; Copper Transport Protein1 (COTP1), som kodar för en transport heavy metal / avgiftning super protein med den dominerande funktionen i jord Cu förvärv och pollenutveckling 14; och Redox Responsive Transcription Factor1 (RRTF1),som kodar för en medlem av Europeiska flyktingfonden (etylen svarsfaktor) subfamily B-3 i ERF / AP2 transkriptionsfaktor familj som innehåller en AP2 domän som underlättar den synergistiska co-aktivering av genuttryck vägar och ge tvär tolerans mot abiotisk och biotiska betonar 15.
Dessutom analyserade vi också fem gener som är involverade i oxidativa stressreaktioner: Fe Superoxide Dismutase1, (FSD1), som kodar för ett cytoplasmatiskt enzym som enzymatiskt och snabbt konverterar superoxidanjonen (O 2 -) och vatten (H2O) till väteperoxid (H 2 O 2) och molekylärt syre (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), att detta kodar och enzym som katalyserar nedbrytningen av H 2 O 2 i vatten och syre 17,18; Thylakoidal askorbatperoxidas (TAPX), som kodar för en kloroplast tylakoid peroxidas som scavenges H2O2 19; askorbat Peroxidase1 (APX1), som kodar för ett cytosoliskt peroxidas som avlägsnar H2O 2 och representerar en av de potentiella målen för posttranslationella modifieringar som medieras av NO-härledda molekyler 20; och NADPH- Andningsskuroxidas protein D (RbohD) som kodar för ett enzym som genererar O 2 - och spelar avgörande roller vid reglering av tillväxt, utveckling och stressvar i Arabidopsis 21.
Vår fält återföring metoden ger det första beviset att GMF återföring kan framkalla en betydande förändring i morfologi och genuttryck av A. thaliana rötter och skott. Detta protokoll ger ett innovativt sätt att utvärdera effekten av GMF återföring på växtmorfologi och genuttryck och kan användas för att bedöma den potentiella effekten av GMF återföring på andra aspekter av vegetabiliskt beteende, och därigenom styra diskussionen om role för GMF återföring på växternas evolution.
Protocol
1. Inställning av Triaxial Spolar
OBS: Figur 1 visar triaxiala spolar används för att vända GMF.
- Slå på treaxlig magnetometer, vars sond förs in i triaxiala spolarna.
- Slå på datorn och starta magnetometer programvara som gör att data samlas in från treaxlig magnetometer.
- Använd komponentvärdena som rapporteras av magneto att beräkna magnituden av GMF. Till exempel, med magneto värden: Bx = 6.39 jT, Av = 36,08 jT, Bz = 20,40 jT beräkna en fältstyrka på 41,94 pT med hjälp av följande ekvation: B = B GMF + B Ytterligare, där B ytterligare = (Bx 2 + By 2 + Bz 2) ½ (dvs 41,9 pT i exemplet.)
- Slå på tre DC-nätaggregat (dual range: 0-8V / 5A och 0-20V / 2.5A, 50W) var och en är ansluten till tre couples av Helmholtz-spolar och ansluten till en dator via en GPIB-anslutning (Figur 1B).
- Måste spänningarna hos nätaggregat för att alstra den önskade magnetiska fältet med en omvänd magnetisk fältvektor. Till exempel med B GMF som i steg 1,3 och med spolen storleken på instrumentering som beskrivs här, ställer spänningarna V X = 0,00 V, V y = 30,52 V, V z = 0,00 V i syfte att generera en ny erhållen B = B GMF + B triaxiella spolar = (6,38, -36,08, 20,39) pT. dvs ett nytt fält med samma storleksordning som B GMF men pekar på en annan riktning.
- Verifiera den nya fältet med magneto programvara med hjälp av proceduren beskriven i 1,3.
- Utsätta växter till både normala och omvända GMF betingelser genom att använda petriskålar som beskrivs i avsnitt 2.
- Utför skenexponeringsexperiment genom att hålla storleken på fältet som är lika med | B GMF | och hålladen vertikala komponenten av fältet är lika med den för GMF, men att ändra riktningen (dvs "North, öst eller väst") av den horisontella delen av fältet med lika strömmar i triaxiala spolar jämfört med fält återföring skick. Gör detta genom att ändra spänningen av spolarna såsom beskrives i 1,5.
Obs: Denna bluff exponering utesluter potentiella subtil värme eller vibrationseffekter från antingen spolarna själva eller från elektronik som används för att styra spolarna. - Kör dubbelblinda experiment genom att tillämpa fältförhållanden förblindade från den personal som utför resten av experimenten och / eller tolka data.
2. Beredning av växtmaterial och betingelser för växtligheten
- Använd frön av Arabidopsis thaliana, ekotyp Columbia 0 (Kol 0), placera sedan i en 1,5 ml rör och ytan sterilisera genom behandling med en 5% (vikt / volym) kalciumhypokloritlösning och 0,02% (volym / volym) Triton X-100 i 80% etanol (EtOH) för 10-12 minuter vid 25-28 ° C, med kontinuerlig skakning. Skölj därefter två gånger med 80% EtOH, tvätta med 100% EtOH och slutligen skölj med sterilt destillerat vatten.
- Bered en L av Murashige och Skoog 22 (MS) modifierat medium genom att tillsätta: 2,297 g MS (0,5 x MS Basal saltblandning), 10 g sackaros, avjoniserat vatten upp till 1 L, pH 5,8-6,0 justerat med KOH. Lägg 16 g agar och autoklav under 20 minuter, 120 ° C.
- Före stel, häll 80 ml medium i varje (120 x 120 mm 2) kvadratiska petriskålar. Sugga trettio sterila frön på plattan, och sedan försegla plattor med en vaxartad film.
- Vernalize plattorna horisontellt i mörker vid 4 ° C under 2 dagar för att förstärka och synkronisera groning, och sedan utsätta petriskålar till antingen normal eller omvänd GMF.
- Exponera frön i ett klimat kontrollerad miljö vid 22 ° C i en vertikal position i parallella experiment både innanför triaxiala spolar och utanför triaxiala spolarenligt en fotoperiod schema för 8 timmar mörker och 16 timmar ljus, med hjälp av natriumlampor (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Använd en blå gelatinfilm för spotlight för att minska röda komponenten av lampor.
- Exponera anläggningar för 10 dagar före RNA-extraktion till både normala (kontroll) och återföring (behandling) GMF förhållanden.
- Efter exponering, ta bilder av petriskålar.
- Använd ImageJ programvara för att beräkna roten längd och blad områden.
- I korthet, mäta sidan av Petri plattan, sedan öppna bilden av Petri plattan och genom att använda "raka" line option att rita en linje som exakt korsar plattsidan.
- I menyn "analysera" välj "set skala" och sätt det faktiska avståndet i "kända avståndet" rutan (t.ex. 120 mm) och sätt sedan i längdenhet (mm); Slutligen klickar du på "global" för att göra inställningar för alla mätningar.
- För root längd, följ noga form av roten med hjälp av frihand verktyget. Mät längden med hjälp av "åtgärd" i menyn "analysera". Fortsätt att mäta alla rötter i bilden och spara filen för ytterligare statistiska analyser.
- För bladarea, från menyn "image" använda justerings alternativ och sedan "färg tröskel". Välj enskilda blad och i menyn "analysera" välj "analysera partiklar". Spara enskilda mätningar för statistiska analyser.
3. Arabidopsis Total RNA-extraktion, kvantitativa realtid-PCR (qPCR) reaktionsbetingelser och Primers för Arabidopsis
- Samla separat 30 skott och 30 rötter och omedelbart frysa i flytande kväve. Sedan slipa i flytande kväve med mortel och mortelstöt.
- Isolera totalt RNA med hjälp av en reningskit och RNas-fritt DNas behandling kit med hjälp manufacturrens instruktioner.
- Kontrollera prov kvalitet och kvantitet genom användning av en RNA-nano kit och kapillärgelelektrofores enligt tillverkarens instruktioner. Bekräfta kvantifiering av RNA spektrofotometriskt.
- Använd 2 pg av totalt RNA och slumpmässiga primrar med användning av en cDNA-Omvänd transkription Kit för att erhålla första sträng cDNA enligt tillverkarens rekommendationer.
- Utför alla experiment på en Real-Time System med SYBR grön jag med ROX som en intern belastning standard.
- Genomföra reaktionen med 25 il blandning bestående av 12,5 pl av 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 pl av cDNA och 100 nM primers. Använd primrar som anges i tabell 1. Inkludera i kontrollerna icke-RT kontroller (med användning av total-RNA utan omvänd transkription för att övervaka för genomisk DNA-kontamine) och icke-mall kontroller (vatten istället för templat).
- Beräkna primer effektivitet för alla primers par med hjälp av standardkurva metod 23.
- Använd följande PCR-betingelser: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min vid 95 ° C, 40 cykler av 15 s vid 95 ° C, 30 sekunder vid 58 ° C och 30 sek vid 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, ÄRV1, GAPC2, CAT3, TAPX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min vid 95 ° C, 40 cykler av 15 s vid 95 ° C, 20 sek vid 57 ° C och 30 sek vid 72 ° C.
- Läs fluorescens efter varje hybridisering och förlängning fasen. För alla körningar, utför en smältkurvanalys från 55 till 95 ° C genom att ta dissociationen segmentet i termiska profilen. Använd dissociationskurvan skärmen till via fliken resultat att visa dissociationen profilen (kurva över fluorescensen som en funktion av temperatur). Se till att datamängden som samlats in under dissociation segment av försöket väljs för analys med hjälp av skärmen Analys / Inställningar.
- Bestäm linear utbud av templatkoncentration till tröskelcykelvärdet (Ct värde) genom att utföra en tiofaldig utspädningsserie (1 till 10 3-faldig) med hjälp av cDNA från tre oberoende RNA-extraktioner analyseras i tre tekniska replikat 24,25.
- Analysera alla förstärknings tomter med realtids-PCR instrument programvara för att erhålla Ct-värden. Kalibrera och normalisera relativa RNA-nivåer med den nivå av de bästa hushållningsgener enligt följande: 3.11.1) Gå till Amplification Plots skärmen via fliken Resultat markerar ramp eller platå för vilka uppgifter ska analyseras med hjälp av / Setup Analysis Selection, och välj sedan DRN (baslinjekorrigerade normaliserade fluorescens) från Fluorescence menyn på kommandopanelen. Gå till Plate sampelvärdena skärmen via fliken Resultat för att visa Ct-värden för brunnarna i urvalet.
- Använd fyra olika referensgener [t.ex. cytoplasma glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas, (GAPC2), ubiquitin specific proteas 6 (UBP6), Actin1 (ÄRV1) och elongeringsfaktor 1B-alfa-subenheten 2 (eEF1Balpha2)] för att normalisera resultaten av realtids-PCR. Välj den högst rankade genen med hjälp av en analysprogramvara 26; och använda den mest stabila genen för normalisering.
- I korthet, organisera indata i ett Excel-ark med den första kolumnen innehåller genen namn och första raden som innehåller provnamnen. Välj sedan analysprogrammet från menyfältet. Använd dialogrutan för att välja indata.
- Nästa, kontrollera fälten Sample namn, gen namn och enkel utgång bara. Klicka på Go-knappen för att utföra analysen. Välj den högst rankade genen (som har det minsta stabilitetsvärdet) som kandidatgen mest stabilt uttryckta.
- Handling uppgifter genom att visa differential faldig förändring uttryck i både skott och rötter.
4. Statistiska analyser
- Uttrycka data som medelvärden ± standardfel. Jämför control och behandlingsgrupperna genom att utföra analys av varians (ANOVA) och Tukeys test med Bonferroni och Dunn-Sidak Justerad sannolikhetstest (0,95% konfidens).
Representative Results
Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en metod för att bedöma om återföring av det geomagnetiska fältet (GMF) kan påverka växtutveckling och genuttrycket av Arabidopsis thaliana ekotyp Col 0. Triaxiala spolar som visas i figur 1A används för att vända GMF när uppsättningen med de lämpliga drivspänningar (figur 1B), erhållen såsom beskrivs i steg 1,5 i protokollet. Måtten för de triaxiala spolarna är ~ 2 x 2 x 2 m 3, vilket gjorde tillräckligt utrymme med omvända GMF villkor att vara värd flera petriskålar. Kontroller odlades i samma miljöförhållanden och vid normala GMF värden. Efter 10 dagars exponering till det normala och omvända GMF villkor, fenotypen av växter visade uppenbara morfologiska förändringar. Såsom visas i fig 2, kontrollplantor (dvs odlade i normala GMF förhållanden) visade rot längder med signifikant (Dunn-Sidak och Bonferroni Justerat Prob <0,001;Students t = 10,68, df = 31) högre värden (29,41 mm, SEM = 1,04; N = 32) med avseende på växter som utsätts för omvänd GMF (17,53 mm, SEM = 0,58; N = 36). I GMF-omvända växter, var morfologin av skott också förändras genom att visa en minskad utveckling av broschyren expansion. Växter som utsätts för normala förhållanden visade en genomsnittlig bladyta av 4,95 mm 2 (SEM 0,025, N = 54), medan växter som utsätts för omvända GMF villkor uppvisade signifikant (Dunn-Sidak och Bonferroni Justerat Prob = <0,001; studentens t = 31,32, df = 53) lägre bladvärden området (3,71 mm 2, SEM = 0,032, N = 54). Därför exponering av Arabidopsis återförda GMF villkor inducerade en minskning av både rotlängd och bladyta.
Leaf expansion och rot tillväxt är beroende av både divisionen och förlängningen av celler 27. Därför växtens utveckling, produktivitet och kondition är beroende av en optimal fotograferings och rot-systemarkitektur <sup> 28. Den reducerade rotlängd och lövstorlek av växter som utsätts för omvända GMF förhållanden indikerar närvaro av ett avkänningssystem kan inte bara uppfatta variationer i magnetisk fältintensitet, men också för att reagera på förändringar i det magnetiska fältet "riktning" jämfört med tyngdkraften. Hypotesen att GMF återföring kan påverka växternas tillväxt finner övertygande bevis i våra experiment, som visar att GMF återföring föreskrifter på ett väsentligt kan påverka växtens utveckling.
De morfologiska förändringarna var också åtföljs av förändringar i genuttryck. Bland hushållningsgener, den mest stabila genen var elongeringsfaktor 1B-alfa-subenheten 2. Den första gruppen av gener (CRU3, COTP1, RRTF1) visade en dramatisk förändring i genexpressionen (Figur 3). Shoot uttryckning av alla tre gener ökade signifikant (P <0,05) med ca 2,5-faldigt i växter utsatta för reservd GMF villkor. Root uttryck för CRU3 uppreglerades i rötterna i växter utsätts för normala GMF förhållanden, men var signifikant (P <0,05) nedreglerade i omvänd GMF förhållanden. Motsatsen konstaterades för COTP1 och RRTF1, som nedreglerade under normala förhållanden och uppregleras i närvaro av GMF återföring (Figur 3).
Kruciferin (12 S globulin) är den vanligast förekommande lagringsprotein i frön av A. thaliana och andra korsblommiga och syntetiseras som en prekursor in the rough endoplasmatiska nätverket. Det är sedan transporteras till proteinlagrings vakuoler 13. Planta groning kräver nedbrytningen av kruciferin, som används som en första källa av kväve. Nedreglering av kruciferin nedbrytning minskar embryon utveckling genom att försämra cellstrukturer eller cellkomponenter utvecklings 29,30. Våra resultat visar att uppreglering av CRU3 korrelerar meden lägre expansionsblad och en reducerad rotlängd, vilket sålunda indikerar att denna gen i känsliga för GMF återföring och att dess överexpression kan bidra till en minskning av växtens utveckling. Dessutom inducerar GMF återföring en betydande nedreglering av CRU3 i rötter, som korrelerar med en minskad rotlängd. Koppar är en viktig kofaktor för viktiga processer i växter, men det utövar skadliga effekter när utöver; således överuttrycker koppar transport äventyrar växternas tillväxt. Effekten av GMF återföring var en betydande överuttryck av COTP1 både skott och rötter, vilket förklarar den minskade tillväxtverket. Ion påfrestningen försämrar kloroplast metabolismen, som är tätt kopplad till redox-tillståndet hos cellen. I Arabidopsis transkriptionsfaktom RRTF1 är viktigt för uttryck av gener associerade till förmågan att anpassa sig till redox förändringar 31. Därför, när växter utsätts för yttre stimuli som kan förändra deras fysiologiska och utvecklingal-program en överuttryck av denna viktiga transkriptionsfaktor förväntas. Återföring av GMF inducerade en signifikant överuttryck av RRTF1 både skott och rötter, vilket indikerar högre oxidativa stressreaktioner av växter till omvända GMF villkor.
Intressanta resultat erhålles genom analys av de fem gener involverade i oxidativ stress. I allmänhet har alla gener extraherade och analyseras i skott inga signifikanta skillnader (P> 0,05) när växter odlades i normal eller omvänd GMF förhållanden (Figur 4 och Figur 5). Dock en betydande nedreglering alltid observeras i rötterna av växter utsätts för omvänd GMF villkor. I synnerhet CAT3 uppvisade den högsta nedreglering (Figur 5), följde i ordning nedreglering av APX1, FSD1, RBOHD och TAPX (Figur 4).
Tvär tolerans mot enbiotiska och biotiska påkänning åstadkommes genom aktivering av involverade i flera biokemiska vägar olika gener. RRTF1 transkriptionsfaktör underlättar den synergistiska sam-aktivering av genuttrycket av dessa vägar 15,31, och kan potentiellt involverade i oxidativ stress 32. Därför är uppreglering av RRTF1 förväntas när syrefång reduceras. Nedreglering av root avlägsnande enzymer korrelerar med uppreglering av RRTF1, som verkar som svar på ökad oxidativ stress. Den dramatiska rot nedreglering av CAT3, APX1 och TAPX indikerar minskad förmåga av rotceller att eliminera H2O 2, som åtföljs av minskad förmåga att dismutate superoxidanjonen genom nedreglering av FSD1. De oxidativa stressreaktioner är högre i rötter, som verkar vara den viktigaste platsen för omvänd GMF uppfattning.
Figur 1. jordmagnetiska fältet kompensationssystemet. (A) triaxiella spolar (innefattande ett par av åttahörniga spolar för var och en av tre vinkelräta axlar) som används för att vända den geomagnetiska fältvektorn. (B) En datorstyrd nätaggregat är ansluten till varje par av Helmholtz-spolar. (Spänningar i dessa siffror är godtyckliga) klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Effekter av jordens magnetfält återföring på Arabidopsis morfologi. Efter tio dagars exponering, kontrollplantor (dvs, de som utsätts för normala GMF förhållanden) visar en signifikant större rotlängd och mer expanded broschyrer jämfört med plantor som utsattes för omvänd GMF villkor. Metric bar = 18 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Effekter av jordens magnetfält återföring på Arabidopsis genuttryck. Efter tio dagars exponering, totalt RNA av kontroll och behandlade plantor extraherades och analyserades genom realtids-PCR för uttrycksanalys. Effekten av återföring av GMF var att framkalla en drastisk förändring i genuttryck av alla gener som testades CRU3, kruciferin 3,. COTP1, koppar Transport Protein1, RRTF1, Redox Responsive Transkription Factor1. Staplarna anger standardfelet; asterisker indikerar betydande (P <0,05) skillnader mellan plmyror som utsätts för omvända och normala GMF förhållanden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Effekter av jordens magnetfält återföring på Arabidopsis antioxidant relaterade genuttryck. Efter tio dagars exponering, är totalt RNA kontroll och behandlade plantor isoleras och används för genuttryck analys med användning av realtids-PCR. Effekten av återföring av GMF var att förmå inga väsentliga förändringar i skott genuttryck; dock en drastisk nedreglering observerats i rot genuttrycket av växter odlas under omvända GMF villkor TAPX, Thylakoidal askorbatperoxidas,. APX1, askorbat Peroxidase1, FSD1, Fe Superoxide Dismutase1, RbohD, NA. DPH / Andnings brast oxidas protein D Bars anger standardfel; asterisker indikerar betydande (P <0,05) skillnader mellan växter utsätts för omvända och normala GMF förhållanden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Effekter av det geomagnetiska fältet återföring på Arabidopsis katalas 3 (CAT3) genuttryck. Efter tio dagars exponering, är totalt RNA kontroll och behandlade plantor isoleras och används för genuttryck analys med användning av realtids-PCR. Effekten av återföring av GMF var att förmå inga väsentliga förändringar i skott genuttryck; dock en drastisk nedreglering observerats i rot genuttrycket av växter som odlas i omvänd GMF förhållanden. Staplar indikerar standard error; asterisker indikerar betydande (P <0,05) skillnader mellan växter utsätts för omvända och normala GMF förhållanden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vi visade nyligen att en fantastisk korrelation mellan GMF återföringar och den tidpunkt när avledning av de flesta av de familjära angiosperm härstamning inträffade två. Trots de stimulerande hypoteser och den uppsjö av studier om effekten av olika GMF intensiteter, antagandet att GMF återföring kan själv framkalla betydande förändringar i växtgenuttryck och morfologi har aldrig visats. Här visar vi för första gången, en metod som använder en treaxlig åttkantiga helmholtzspole att vända GMF i vårt laboratorium, och att återföring av det omgivande magnetfältet kan orsaka fenotypiska förändringar och modulering av genuttryck i växter.
För att få GMF återföring (modifikation) under en tillräcklig volym för tillväxtexperiment (2 x 2 x 2 m 3), byggde vi en åttakantig Helmholtz spolsystem. Detta system är inte kommersiellt tillgängliga (vanligen Helmholtz-spolar är ringformad och mindre)och kostnaderna för byggandet var betydande. Viktigt, levererar systemet robust fält modifiering, med exceptionell tids stabilitet och homogenitet i de modifierade magnetfält.
Systemet är konstruerat och byggt för att minska värdet av GMF till en tusendels de normala förhållanden eller att vända någon av de tre dimensionerna av magnetfältet. Emellertid inte utformningen av spolarna inte möjligt att generera en hög magnetisk fältstyrka. Därför är detta instrument i nuvarande form inte lämpar sig för experiment utformade för att utvärdera effekten av hög magnetisk fältstyrka på växter eller andra organismer.
I laboratoriet har ändring av GMF liknande de som beskrivs i denna metod har erhållits genom olika metoder, bland annat avskärmning genom att omge experimentell zon av ferromagnetiska metallplattor med hög magnetisk permeabilitet, som avviker magnetfält och koncentrera dem i själva metallen. The Fördelen med att använda Helmholtz spolar är att systemet tillåter växter att utsättas för mer naturliga förhållanden (ljus, luftcirkulationen, etc.), vilket gör den idealisk inte bara för in vitro-studier (som med hjälp av petriskålar) men också för in vivo växternas tillväxt och utveckling experiment. Dimensionerna hos vårt system skapa ett utrymme som medger en dämpning upp till <1 / 1000:e av den naturliga GMF under en 25 x 25 x 25 cm 3 sfärisk volym (se figur 1 A), vilket möjliggör att vara värd flera petriskålar eller några små krukor för växtligheten.
Den metod som presenteras här har tillämpats på växtbiologistudier; emellertid tillåter systemet ett brett spektrum av försök samt virologi och mikrobiologi, liksom studier av nematoder (t.ex. Caenorhabditis elegans), artropoder och små djur (inklusive mus och råtta). Därför, test av hypotesen att återföring av GMF kanatt inducera morfologiska och transkriptions förändringar skulle också kunna utvidgas till många andra levande system, kanske i slutändan även mänskliga celler.
GMF är i ständig förändring och fluktuerande. Därför i våra experiment en stor utmaning är att ge en konstant ersättning av GMF för att få de önskade nya GMF värden. Detta kan endast uppnås genom en kontinuerlig kontroll av magnetiska fält värden genom läsning av magnetometervärden och spänningskompensation. Därför kan systemet kompensera långsamt varierande delen av GMF men det gör ingenting för högre svängningar frekvens.
Sammanfattningsvis, var avgörande för att visa att denna återföring av GMF vektorn kan inducera växt morfologiska förändringar och differential genuttryck användningen av treaxliga spolar att vända GMF vektorn. De resultat som erhållits med den presenterade metoden ger en övertygande bevisning till stöd för hypotesen att GMF reÅterföring kan ha varit en av de drivande krafterna för växternas evolution över geologiska tidsskalor 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
| DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
| Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Ethanol | Sigma | 2860 | |
| GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
| RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
| RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
| 2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Petri dish square (120 x120 mm2) | Sigma | Z692344 |
References
- Maffei, M. E. Magnetic field effects on plant growth, development, and evolution. Front. Plant Sci. 5, (2014).
- Occhipinti, A., De Santis, A., Maffei, M. E. Magnetoreception: an unavoidable step for plant evolution. Trends Plant Sci. 19 (1), 1-4 (2014).
- Harris, S. R., et al. Effect of magnetic fields on cryptochrome-dependent responses in Arabidopsis thaliana. J. Royal Soc. Interf. 6 (41), 1193-1205 (2009).
- Phirke, P. S., Kubde, A. B., Umbarkar, S. P. The influence of magnetic field on plant growth. Seed Sci. Technol. 24 (2), 375-392 (1996).
- Abe, K., Fujii, N., Mogi, I., Motokawa, M., Takahashi, H. Effect of a high magnetic field on plant. Biol. Sci. Space. 11, 240-247 (1997).
- Volpe, P. Interactions of zero-frequency and oscillating magnetic fields with biostructures and biosystems. Photochem. Photobiol. Sci. 2 (6), 637-648 (2003).
- Belyavskaya, N. A. Biological effects due to weak magnetic field on plants. Adv. Space. Res. 34 (7), 1566-1574 (2004).
- Weber Bittl, R., S, Transient radical pairs studied by time-resolved EPR. Biochim. Biophys. Acta- Bioenerg. 1707 (1), 117-126 (2005).
- Pazur Galland, P., A,
- Minorsky, P. V. Do geomagnetic variations affect plant function. J. Atm. Solar-Terrestr. Phys. 69 (14), 1770-1774 (2007).
- Burda Vanderstraeten, J., H, Does magnetoreception mediate biological effects of power-frequency magnetic fields. Sci. Tot. Environ. 417, 299-304 (2012).
- Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination. Plant Physiol. 138 (2), 790-802 (2005).
- Wan, L. L., Ross, A. R. S., Yang, J. Y., Hegedus, D. D., Kermode, A. R. Phosphorylation of the 12 S globulin cruciferin in wild-type and abi1-1 mutant Arabidopsis thaliana (thalecress) seeds.. Biochem J. 404, 247-256 (2007).
- Sancenon, V., Puig, S., Mira, H., Thiele, D. J., Penarrubia, L. Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 51 (4), 577-587 (2003).
- Foyer, C. H., Karpinska, B., Krupinska, K. The functions of Whirly1 and Redox-Responsive Transcription Factor 1 in cross tolerance responses in plants: A hypothesis. Philos.Trans.Royal Soc.B-Biol.Sci. 369 (1640), 20130226 (2014).
- Myouga, F., et al. A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (11), 3148-3162 (2008).
- Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., Noctor, G. Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. J. Exper. Bot. 61 (15), 4197-4220 (2010).
- Bassham Contento, A. L., C, D. Increase in catalase-3 activity as a response to use of alternative catabolic substrates during sucrose starvation. Plant Physiol. Biochem. 48 (4), 232-238 (2010).
- Kangasjarvi, S., et al. Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses. Biochem. J. 412, 275-285 (2008).
- Begara-Morales, J. C., et al. Dual regulation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine nitration and S-nitrosylation. J. Exper. Bot. 65 (2), 527-538 (2014).
- Li, N., et al. AtrbohD and AtrbohF negatively regulate lateral root development by changing the localized accumulation of superoxide in primary roots of Arabidopsis. Planta. 241 (3), 591-602 (2014).
- Skoog Murashige, T., F, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nuc. Acids Res. 29 (9), (2001).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Phillips, M. A., D'Auria, J. C., Luck, K., Gershenzon, J. Evaluation of candidate reference genes for real-time quantitative PCR of plant samples using purified cDNA as template. Plant Mol. Biol. Rep. 27 (3), 407-416 (2009).
- Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).
- Tsukaya, H. Developmental genetics of leaf morphogenesis in dicotyledonous plants. J. Plant Res. 108 (1092), 407-416 (1995).
- Szymanowska-Pulka, J. Form matters: morphological aspects of lateral root development. Ann. Bot. 112 (9), 1643-1654 (2013).
- Black Bewley, J. D., Seeds, M. Physiology of development and germination. , Plenum Press. New York. (1994).
- Kato-Noguchi, H., Ota, K., Kujime, H., Ogawa, M. Effects of momilactone on the protein expression in Arabidopsis germination. Weed Biol. Manage. 13 (1), (2013).
- Khandelwal, A., Elvitigala, T., Ghosh, B., Quatrano, R. S. Arabidopsis transcriptome reveals control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor. Plant Physiol. 148 (4), 2050-2058 (2008).
- Haddad, J. J. Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology. Respirat. Res. 3 (1), (2002).
