Abstract
En af de mest stimulerende observationer i planter evolution er en sammenhæng mellem forekomsten af geomagnetiske felt (GMF) tilbageførsler (eller udflugter), og tidspunktet for stråling af Blomsterplanter. Dette førte til den hypotese, at ændringer i GMF polaritet kan spille en rolle i plante evolution. Her beskriver vi en metode til at teste denne hypotese ved at udsætte Arabidopsis thaliana kunstigt vendt GMF betingelser. Vi anvendte en tre-akset magnetometer og de opsamlede data blev anvendt til at beregne størrelsen af GMF. Tre jævnstrømsforsyninger blev forbundet til tre Helmholtz coil par og blev styret af en computer til at ændre GMF betingelser. Planter dyrket i petriskåle blev udsat for både normale og omvendt GMF betingelser. Eksponering eksperimenter sham blev også udført. Eksponerede planter blev fotograferet under forsøget og billeder blev analyseret for at beregne root længde og blad områder. Arabidopsis total RNA blev ekstraheret og kvantitativeReal Time-PCR (qPCR) analyser blev udført på genekspression af cruciferin 3 (CRU3), kobber transport protein1 (COTP1), Redox Responsive Transskription faktor1 (RRTF1), Fe superoxiddismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal Ascorbat peroxidase (TAPX), en cytosolisk Ascorbat Peroxidase1 (APX1), og NADPH / respiratorisk burst oxidase protein D (RbohD). Fire forskellige referencepunkter gener blev analyseret for at normalisere resultaterne af qPCR. Den bedste af de fire gener blev udvalgt og mest stabile genet for normalisering blev anvendt. Vore data viser for første gang, at vende den GMF polariteten hjælp triaksiale spoler har væsentlige virkninger for plantevækst og genekspression. Dette understøtter hypotesen om, at GMF tilbageførsel bidrager til at fremkalde ændringer i plante udvikling, der kunne begrunde en højere selektivt tryk, i sidste ende fører til plant evolution.
Introduction
Jordens magnetfelt (eller ækvivalent det geomagnetiske felt, GMF) er en uundgåelig miljømæssig faktor for alle organismer, der lever på planeten, herunder planter. Den GMF har altid været en naturlig del af jorden, så i løbet evolution, alle levende organismer oplevede sin handling. Et stigende mængde beviser viser, at GMF er i stand til at påvirke mange biologiske processer 1. Den GMF ikke er ensartet, og der er betydelige lokale forskelle i dens størrelse og retning på Jordens overflade. Den GMF på Jordens overflade viser en bred vifte af størrelser, der spænder fra mindre end 30 uT til næsten 70 uT. Den GMF beskytter Jorden og dens biosfæren fra dødelige virkninger af solvinden ved afbøje de fleste af sine ladede partikler gennem magnetosfære 2.
Planter reagere på miljømæssige stimuli; og klassiske reaktioner på abiotiske faktorer som lys og tyngdekraften har været thoroughly beskrevet ved at definere de såkaldte fototropisk og gravitropic svar. Meget lidt eller intet, der er kendt på de mekanismer, perception og reaktioner af planter for magnetfelter, trods de mange papirer offentliggjort om dette emne og for nylig anmeldt 1. I modsætning til den tyngdefelt, den GMF ændret konsekvent under planter evolution og derved repræsenterer en vigtig abiotisk stress faktor, der for nylig er blevet betragtet som en potentiel drivkraft i sidste ende bidrage til at plante diversificering og artsdannelse 2. Geomagnetiske tilbageførsler (eller udflugter) er ændringer i polaritet GMF. Under Jordens liv-historie, GMF tilbageførsler opstod flere gange. Disse udsatte planeten til at perioder med reduceret GMF styrke i løbet af hver polaritet overgang. Nogle forfattere har hypotese, at disse overgange perioder med lav GMF styrke kunne have tilladt ioniserende stråling fra solvinden at nå Jordens overflade, og derved fremkalde enkonsekvent stress til levende organismer, som kunne have været stærk nok til at fremkalde genændringer i sidste ende fører til at plante evolution 2.
En detaljeret analyse af eksperimenter, der beskriver virkningerne af magnetfelter på planter viser en lang række modstridende rapporter, karakteriseret ved en mangel på plausible biofysiske interaktionsmekanismer. Mange eksperimenter er simpelthen urealistisk, mens andre mangler en testbare hypoteser og i sidste ende, er ikke overbevisende 3. I de seneste år har fremskridt og status for forskning om effekten af magnetiske felter på fabrikken blevet revideret 2,4-11. For nylig, effekten af både lav og høj magnetfelt er blevet grundigt diskuteret 1, med særlig fokus på inddragelse af GMF vending begivenheder på planternes evolution 2.
Den mest direkte måde at underbygge den hypotese, at GMF tilbageførsler planters evolution er at syntetisere en GMFvending i laboratoriet ved at teste responsen af planter til normale og omvendte magnetiske markforhold. For at teste hypotesen, vi derfor bygget en triaksial ottekantede Helmholtz coil-par magnetfelt kompensationsordning (triaksiale spoler), som er i stand til præcist at vende den normale GMF betingelser.
Vi brugte Arabidopsis thaliana som model anlæg og vi testede effekten af omvendt GMF på genekspression af nogle vigtige gener: cruciferin 3 (CRU3), der koder for et 12S frølagringsprotein der er tyrosin-phosphoryleret og dets phosphorylering tilstand moduleres som reaktion til ABA i Arabidopsis thaliana frø 12,13; kobber Transport Protein1 (COTP1), der koder et tungmetal transport / afgiftning superfamilien protein med den fremherskende funktion i jord Cu erhvervelse og pollen udvikling 14; og Redox Responsive transskription faktor1 (RRTF1),der koder for et medlem af ERF (ethylen respons faktor) underfamilie B-3 i ERF / AP2 transkriptionsfaktor familie, der indeholder et AP2 domæne, som letter den synergistiske co-aktivering af genekspression veje og giver cross tolerance over for abiotisk og biotisk understreger 15.
Desuden er vi også analyseret fem gener involveret i oxidativ stress reaktioner: Fe Superoxide Dismutase1, (FSD1), der koder for et cytoplasmatisk enzym, der enzymatisk og hurtigt omdanner superoxid anion (O 2 -) og vand (H2O) til hydrogenperoxid (H 2 O 2) og molekylært oxygen (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), at der koder og enzym, som katalyserer nedbrydningen af H 2 O 2 i vand og ilt 17,18; Thylakoidal ascorbatperoxidase (TAPX), der koder for et chloroplast thylakoid peroxidase, der scavenges H2O2 19 Ascorbat Peroxidase1 (APX1), der koder for et cytosolisk peroxidase, der opfanger H 2 O 2 og repræsenterer en af de potentielle mål for post-translationelle modifikationer er medieret af NO-afledte molekyler 20; og NADPH- respirationsbølge oxidase protein D (RbohD), der koder for et enzym, der genererer O 2 - og spiller afgørende roller i reguleringen af vækst, udvikling og stress reaktioner i Arabidopsis 21.
Vores felt-vending metode giver den første bevis på, at GMF vending kan medføre en betydelig ændring i morfologi og genekspression af A. thaliana rødder og skud. Denne protokol giver en innovativ måde at evaluere effekten af GMF tilbageførsel på planternes morfologi og genekspression og kan bruges til at vurdere den potentielle virkning af GMF tilbageførsel på andre aspekter af planter adfærd, og dermed lede diskussion af role af GMF tilbageførsel på planternes evolution.
Protocol
1. Indstilling af Triaxial Coils
BEMÆRK: Figur 1 viser de triaksiale spoler bruges til at vende GMF.
- Tænd for tre-aksen magnetometer, hvis proben er indsat i de triaksiale spoler.
- Tænd for computeren og starte magnetometer software, der giver data, der skal indsamles fra tre-akse magnetometer.
- Brug komponent værdier rapporteret af magnetometer til at beregne størrelsen af GMF. For eksempel med magnetometer værdier: Bx = 6.39 uT ved = 36.08 uT, Bz = 20.40 uT beregne en feltstyrke på 41.94 uT ved hjælp af følgende ligning: B = B GMF + B yderligere, hvor B yderligere = (Bx 2 + med 2 + Bz 2) ½ (dvs. 41,9 uT i eksemplet.)
- Tænd de tre DC strømforsyninger (dobbelt interval: 0-8V / 5A og 0-20V / 2.5A, 50W) hver forbundet til tre par, Mes af Helmholtz spoler og forbundet til en computer via en GPIB-tilslutning (figur 1B).
- Set spændinger strømforsyningerne til at generere den ønskede magnetfelt med en omvendt magnetfeltvektor. For eksempel, med B GMF som i trin 1.3 og med spolen størrelsen af instrumentering beskrevet her, indstille spændingerne V x = 0,00 V, V y = 30,52 V, V z = 0,00 V med henblik på at generere en ny resulterende B = B GMF + B triaksiale spoler = (6.38, -36,08, 20.39) uT. dvs et nyt felt med samme størrelsesorden som B GMF, men peger på en anden retning.
- Kontroller det nye felt med magnetometer software ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet i 1.3.
- Expose planter til både normal og omvendt GMF vilkår ved at bruge Petri plader som beskrevet i afsnit 2.
- Udfør eksponeringsforsøg sham ved at holde størrelsen af det område, der er lig med | B GMF | og holdeden lodrette komponent af feltet er lig med den GMF, men ændring af retning (dvs. "nord, øst eller vest") i den horisontale komponent af feltet med lige strømninger i de triaksiale spoler sammenlignet med feltvending tilstand. Gør dette ved at ændre spændingen på spolerne som beskrevet i 1.5.
Bemærk: Dette fingeret eksponering udelukker potentielle subtile opvarmning eller vibrationseffekter fra enten spolerne selv eller fra elektronikken bruges til at styre spolerne. - Kør dobbeltblinde forsøg ved at anvende markforhold blindede fra personale, der udfører den resterende del af forsøgene og / eller fortolke data.
2. Udarbejdelse af plantematerialer og betingelser for planternes vækst
- Brug frø af Arabidopsis thaliana, økotype Columbia 0 (Col 0), sted og derefter i et 1,5 ml rør og overfladen steriliseres ved behandling med en 5% (w / v) calcium hypochloritopløsning og 0,02% (volumen / volumen) Triton X100 i 80% ethanol (EtOH), for 10-12 minutter ved 25-28 ° C, under kontinuerlig omrystning. Derefter skylles to gange med 80% EtOH, vask med 100% EtOH og endelig skylles med sterilt destilleret vand.
- Forbered 1 L Murashige og Skoog 22 (MS) modificeret medie ved at tilføje: 2,297 g MS (0,5 x MS Basal Salt Blanding), 10 g Saccharose, demineraliseret vand op til 1 l, pH 5,8-6,0 justeret med KOH. Der tilsættes 16 g agar og autoklave i 20 minutter, 120 ° C.
- Før størkning, hæld 80 ml medium i hver (120 x 120 mm, 2) kvadratiske Petri plader. So tredive sterile frø på plade, og derefter forsegle plader med en voksagtig film.
- Vernalize pladerne vandret i mørke ved 4 ° C i 2 dage til at forstærke og synkronisere spiring, og derefter udsætte petriskåle til enten normal eller omvendt GMF.
- Expose frø i et klima kontrolleret miljø ved 22 ° C i en lodret position i parallelle eksperimenter både i de triaksiale spoler og uden for de triaksiale spolerunder en fotoperiode tidsplan for 8 timer mørke og 16 timers lys, ved hjælp af natriumlampe lamper (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Brug en blå gelatine film til spotlight for at reducere røde del af lamper.
- Udsætte planter for 10 dage før RNA-ekstraktion både normale (kontrol) og vending (behandling) GMF betingelser.
- Efter eksponering, tage billeder af petriskåle.
- Brug ImageJ software til at beregne røddernes længde og blad områder.
- Kort fortalt, måle side af petriskål, derefter åbne billedet af petriskål og ved brug af "lige" line option at tegne en linie, der krydser nøjagtigt pladen side.
- I "analysere" menuen vælg "sæt skala", og indsætte den faktiske afstand i "kendt afstand" boks (fx 120 mm), derefter indsætte enhed af længde (mm); til sidst klik på "global" mulighed for at foretage indstillinger til rådighed for alle målinger.
- For root længde nøje følge formen af roden ved hjælp af frihånd værktøjet. Mål længden ved hjælp af "foranstaltning" i "analysere" menuen. Fortsæt med at måle alle rødder i billedet, og gem filen for yderligere statistiske analyser.
- For bladareal, fra det "billede" menuen bruge justere indstilling og derefter "farve tærskel". Vælg den enkelte blade og i "analysere" menuen vælg "analysere partikler". Gem de enkelte målinger for statistiske analyser.
3. Arabidopsis Total RNA Extraction, Quantitative Real Time-PCR (qPCR) Reaction Betingelser og Primere til Arabidopsis
- Saml separat 30 skud og 30 rødder og straks fryse i flydende nitrogen. Så male i flydende nitrogen med morter og støder.
- Isoler total RNA ved hjælp af en oprensningskit og RNase-fri DNase-behandling kit ved hjælp FabrikER anvisninger.
- Kontroller prøven kvalitet og mængde ved hjælp af en RNA nano kit og kapillær-elektroforese i overensstemmelse med producentens anvisninger. Bekræft kvantificering af RNA spektrofotometrisk.
- Brug 2 ug af total RNA og tilfældige primere ved hjælp af et cDNA revers transkription Kit til opnåelse af første streng cDNA'er ifølge producentens anbefalinger.
- Udfør alle eksperimenter på en Real-Time System ved hjælp SYBR grønne I med ROX som intern belastning standard.
- Udfør reaktionen med 25 pi blanding bestående af 12,5 pi 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 pi cDNA og 100 nm primere. Brug primerne anført i tabel 1. Inkluderet i kontrol ikke-RT kontrol (ved hjælp af total RNA uden revers transkription til at overvåge for genomisk DNA-kontaminering) og ikke-template kontrol (vand i stedet for template).
- Beregn primer effektivitet for alle primere par ved hjælp af standardkurve fremgangsmåde 23.
- Brug følgende PCR betingelser: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 minutter ved 95 ° C, 40 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 58 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, AKT1, GAPC2, CAT3, TAPX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min ved 95 ° C, 40 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C, 20 sekunder ved 57 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C.
- Læs fluorescens efter hver annealing og forlængelse fase. For alle kørsler, udføre en smeltekurveanalyse fra 55 til 95 ° C ved at inkludere dissociation segment i den termiske profil. Brug dissociationskurven skærmen, adgang til via fanen resultater for at se dissociation profil (plot af fluorescens som en funktion af temperatur). Sørg for, at datasæt indsamlet under dissociation segment af eksperimentet er udvalgt til analyse ved hjælp af skærm Analyse / Setup.
- Bestem linear vifte af skabelon fusion til tærskelværdien cyklus værdi (Ct-værdi) ved at udføre en tifold fortyndingsrække (1- til 10 3 fold) ved hjælp af cDNA fra tre uafhængige RNA ekstraktioner analyseret i tre tekniske gentagelser 24,25.
- Analysere alle forstærkning parceller med Real-Time PCR instrument software til at få Ct-værdier. Kalibrere og normalisere relative RNA-niveauer med niveauet af de bedste husholdning gener som følger: 3.11.1) Åbn Amplification skærmen Plots via fanen Resultater, vælg rampen eller plateau, hvor data skal analyseres ved hjælp af Analyse Valg / Setup skærmbilledet, og vælg derefter DRN (baseline-korrigeret normaliseret fluorescens) fra fluorescens menuen på kommando panelet. Få adgang pladesigten Sample Værdier via fanen resultater at vise Ct-værdier for brøndene stikprøven.
- Brug fire forskellige referencepunkter gener [f.eks cytoplasmatisk glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, (GAPC2), ubiquitin specific protease 6 (UBP6), actin1 (AKT1) og forlængelsesfaktor 1B a-underenheden 2 (eEF1Balpha2)] for at normalisere resultaterne af real time PCR. Vælg de højest rangerede genet under anvendelse af en analyse software 26; og bruge den mest stabile gen for normalisering.
- Kort fortalt, organisere inputdata på en Excel-ark med den første kolonne indeholdende genet navne og første række indeholder prøven navne. Vælg derefter analysen software fra menuen-bar. Brug dialogboksen til at vælge input-data.
- Dernæst Se felterne Sample navne, gen navne og enkel output kun. Klik på knappen Go for at foretage analysen. Vælg de højest rangerede gen (som har den mindste stabilitet værdi) som kandidat gen mest stabilt udtrykt.
- Plot data ved at vise forskellen fold ændring udtryk i både skud og rødder.
4. Statistiske analyser
- Hurtig data som middelværdier ± standardfejl. Sammenlign control og behandlingsgrupperne ved at udføre variansanalyse (ANOVA) og Tukeys test med Bonferroni og Dunn-Sidak Justeret sandsynlighedstest (0,95% konfidensinterval).
Representative Results
Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en fremgangsmåde til at vurdere, om tilbageførsel af det geomagnetiske felt (GMF) kan påvirke plantens udvikling og genekspression af Arabidopsis thaliana økotype Col 0. Triaksiale spoler som vist i figur 1A anvendes til at vende GMF når den er indstillet med de relevante drivspændinger (figur 1B), opnået som beskrevet i trin 1.5 i protokollen. Dimensionerne af de triaksiale spoler er ~ 2 x 2 x 2 m 3, som tillod tilstrækkelig plads med omvendt GMF betingelser for at være vært for flere Petri plader. Kontroller blev dyrket i de samme miljømæssige betingelser og ved normale GMF værdier. Efter 10 dages eksponering for normal og omvendt GMF betingelser, fænotypen af planter viste tydelige morfologiske ændringer. Som vist i figur 2, kontrolplanter (dvs. dyrkes under normale betingelser GMF) viste root længder med signifikant (Dunn-Sidak og Bonferroni Korrigeret Sandsynlighed <0,001;Students t = 10,68, df = 31) højere værdier (29.41 mm SEM = 1,04; N = 32) med hensyn til planter udsat for omvendt GMF (17,53 mm SEM = 0,58; N = 36). I GMF-vendt planter blev morfologi af skud også ændres ved at vise en reduceret udvikling af indlægssedlen ekspansion. Planter, der udsættes for normale forhold viste en gennemsnitlig blad areal på 4,95 mm2 (SEM 0.025, N = 54), mens planterne udsat for omvendt GMF betingelser viste signifikant (Dunn-Sidak og Bonferroni Justeret Sandsynlighed = <0,001; studerendes t = 31,32, df = 53) lavere bladareal værdier (3,71 mm 2; SEM = 0,032; N = 54). Derfor eksponering af Arabidopsis revers GMF betingelser inducerede en reduktion i både rod længde og bladareal.
Leaf ekspansion og rodvækst er afhængige af både divisionen og forlængelsen af celler 27. Derfor plante udvikling, produktivitet og samlede fitness er afhængige af en optimal optagemenuen og rod-systemarkitektur <sup> 28. Den reducerede røddernes længde og blade størrelse af planter udsat for omvendt GMF betingelser angiver tilstedeværelsen af et sensorsystem i stand til ikke kun at opfatte variationer i magnetfeltet intensitet, men også at reagere på ændringer i magnetfeltet "retning" sammenlignet med tyngdekraften. Den hypotese, at GMF vending kan påvirke plantevæksten finder overbevisende bevismateriale i vores eksperimenter, som viser, at GMF vending betingelser væsentligt kan påvirke plantens udvikling.
De morfologiske ændringer blev også ledsaget af ændringer i genekspression. Blandt husholdning gener, den mest stabile genet var forlængelsesfaktor 1B a-underenheden 2. Den første gruppe af gener (CRU3, COTP1, RRTF1) viste en dramatisk ændring i genekspression (figur 3). Skyde ekspression af alle tre gener blev signifikant forøget (P <0,05) med ca. 2,5-fold i planter udsat for reservend GMF forhold. Root ekspression af CRU3 blev opreguleret i rødderne i planter udsat for normale GMF betingelser, men var signifikant (P <0,05) nedreguleret i omvendt GMF betingelser. Det modsatte blev fundet for COTP1 og RRTF1, der blev nedreguleret under normale forhold og opreguleret i nærvær af GMF vending (figur 3).
Cruciferin (a 12S globulin) er den mest udbredte forrådsprotein i frøene fra A. thaliana og andre korsblomstrede og syntetiseres som en forløber i det barske endoplasmatiske reticulum. Det transporteres derefter til proteinet opbevaring vakuoler 13. Kimplante spiring kræver nedbrydningen af cruciferin, der anvendes som en indledende kilde til nitrogen. Nedregulering af cruciferin nedbrydning reducerer embryoner udvikling ved at ændre celle strukturer eller cellebestanddele udvikling 29,30. Vores resultater viser, at opregulering af CRU3 korrelerer meden lavere blad ekspansion og en reduceret røddernes længde, hvilket indikerer, at dette gen i følsomme over for GMF vending og at dets overekspression kan bidrage til reduktion af plantens udvikling. Desuden GMF tilbageførsel inducerer en betydelig nedregulering af CRU3 i rødder, som korrelerer med en reduceret rod længde. Kobber er en vigtig cofaktor for vigtige processer i planter, men det udøver skadelige virkninger, når der overstiger; således overekspression kobber transport kompromitterer plantevækst. Virkningen af GMF vending var en signifikant overekspression af COTP1 i både skud og rødder, hvilket forklarer den reducerede plantevækst. Ion stress svækker chloroplast metabolisme, som er tæt knyttet til redoxtilstanden af cellen. I Arabidopsis transkriptionsfaktoren RRTF1 er vigtigt for ekspressionen af gener associeret med evnen til at tilpasse sig ændringer redox 31. Derfor, når planterne udsættes for ydre stimuli stand til at ændre deres fysiologiske og udviklingAL programmer forventes en overekspression af denne vigtige transkriptionsfaktor. Tilbageførsel af GMF inducerede en betydelig overekspression af RRTF1 i både skud og rødder, hvilket tyder højere oxidative stress reaktioner af planter til omvendte GMF betingelser.
Interessante resultater er opnået ved at analysere de fem gener involveret i oxidativ stress. Generelt har alle gener udvundet og analyseret i skud viser ikke signifikante forskelle (P> 0,05), når planter blev dyrket i normal eller omvendt GMF betingelser (figur 4 og figur 5). Imidlertid blev en signifikant nedregulering altid observeret i planterødder udsat for tilbageførte GMF betingelser. Især CAT3 viste den højeste nedregulering (figur 5), fulgt med henblik på nedregulering af APX1, FSD1, RBOHD og TAPX (figur 4).
Cross tolerance over for enbiotiske og biotiske stress tilvejebringes ved aktivering af forskellige gener, der er involveret i flere biokemiske veje. RRTF1 transkriptionsfaktor letter synergistisk co-aktivering af genekspression af disse veje 15,31, og kan potentielt involveret i oxidativ stress 32. Derfor forventes, opregulering af RRTF1 når oxygenbinding nedsættes. Nedregulering af root fjernende enzymer korrelerer med opregulering af RRTF1, der fungerer som reaktion på øget oxidativt stress. Den dramatiske root nedregulering af CAT3, APX1 og TAPX angiver den reducerede evne rodceller til at fjerne H2O 2, som er ledsaget af nedsat evne til at dismutate superoxidanionen ved nedregulering af FSD1. De oxidative stressreaktioner er højere i rødder, som synes at være den vigtigste sted for omvendt GMF opfattelse.
Figur 1. geomagnetiske felt Compensation-system. (A) triaksiale spoler (omfattende et par ottekantede spoler til hver af de tre vinkelrette akser), der anvendes til at vende den geomagnetiske feltvektor. (B) En computerstyret strømforsyning er forbundet til hvert par af Helmholzspolerne. (Spændinger i disse tal er vilkårlige) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Virkninger af geomagnetiske felt vending på Arabidopsis morfologi. Efter ti dages eksponering, kontrol planter (dvs. dem, der udsættes for normale GMF betingelser) viser en signifikant større rod længde og mere ExpanDED foldere i forhold til planter, der blev udsat for tilbageførte GMF betingelser. Metrisk bar = 18 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Virkninger af geomagnetiske felt vending på Arabidopsis genekspression. Efter ti dages eksponering blev total RNA af kontrol og behandlede planter ekstraheret og analyseret af Real-Time PCR for ekspression analyse. Virkningen af vending af GMF var at fremkalde en drastisk ændring i genekspression af alle gener, der blev testet CRU3, cruciferin 3;. COTP1, kobber Transport Protein1; RRTF1, Redox Responsive Transskription faktor1. Streger indikerer standardafvigelser; asterisker angiver signifikante (p <0,05) forskelle mellem plmyrer udsat for vendt, og normale GMF forhold. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Virkning af geomagnetiske felt vending på Arabidopsis antioxidant-relateret genekspression. Efter ti dages eksponering, er total RNA af kontrol og behandlede planter isoleret og anvendt til genekspression analyse ved hjælp Real-Time PCR. Effekten af vending af GMF var at fremkalde ingen væsentlige ændringer i skyde genekspression; dog en drastisk nedregulering blev observeret i roden genekspression af planter dyrket under omvendte GMF betingelser TAPX, Thylakoidal ascorbatperoxidase;. APX1, Ascorbat Peroxidase1, FSD1, Fe Superoxide Dismutase1, RbohD, NA. DPH / Respiratory burst oxidase protein D streger indikerer standardafvigelser; asterisker indikerer signifikante (P <0,05) forskelle mellem planter udsat for vendt og normale GMF forhold. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Virkninger af det geomagnetiske felt vending på Arabidopsis Katalase 3 (CAT3) genekspression. Efter ti dages eksponering, er total RNA af kontrol og behandlede planter isoleret og anvendt til genekspression analyse ved hjælp Real-Time PCR. Effekten af vending af GMF var at fremkalde ingen væsentlige ændringer i skyde genekspression; imidlertid en drastisk nedregulering blev observeret i roden genekspression af planter dyrket under tilbageførte GMF betingelser. Barer angiver standard error; asterisker indikerer signifikante (P <0,05) forskelle mellem planter udsat for vendt og normale GMF forhold. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi har for nylig vist, at der findes en fantastisk sammenhæng mellem GMF tilbageførsler og det tidspunkt, hvor omdirigering af de fleste af de familiære angiosperm slægter indtraf 2. Men trods de stimulerende hypoteser og de mange undersøgelser om effekten af forskellige GMF intensiteter, den antagelse, at GMF vending kan selv fremkalde væsentlige ændringer i anlægget genekspression og morfologi er aldrig blevet påvist. Her viser vi for første gang, en metode, der anvender en treakset ottekantede Helmholtz coil at vende GMF i vores laboratorium, og at udligningen af den omgivende magnetfelt kan forårsage fænotypiske ændringer og modulering af genekspression i planter.
For at opnå GMF vending (modificering) over en tilstrækkelig volumen til forsøgene plantevækst (2 x 2 x 2 m 3), vi byggede et ottekantet Helmholtz coil system. Dette system er ikke kommercielt tilgængelige (normalt Helmholzspolerne er ringformet og mindre)og omkostningerne for byggeriet var betydelig. Vigtigere er det, dette system leverer robust felt ændring, med ekstraordinær tid-stabilitet og homogenitet i de modificerede magnetfelter.
Systemet er designet og bygget til at reducere værdien af GMF til en tusindedel af de normale betingelser eller at vende nogen af de tre dimensioner af det magnetiske felt. Men konstruktionen af spolerne ikke mulighed for at generere en høj magnetisk feltstyrke. Derfor dette instrument i nuværende form ikke er egnet til eksperimenter designet til at evaluere effekten af høj magnetisk feltstyrke på planter eller andre organismer.
I laboratoriet har ændring af GMF ligner dem, der er beskrevet i denne metode er opnået ved forskellige metoder, herunder afskærmning ved at omgive den eksperimentelle zone ved ferromagnetiske metalplader med høj magnetisk permeabilitet, som afviger magnetfelter og koncentrere dem i metallet selv. The Fordelen ved at anvende Helmholzspolerne er, at systemet tillader planter at blive udsat for flere naturlige betingelser (lys, luftcirkulation, etc.), hvilket gør det ideelt ikke kun for in vitro-undersøgelser (som med anvendelse af petriskåle), men også til in vivo plantevækst og -udvikling eksperimenter. Dimensionerne af vores system skabe et rum, der tillader en suppression op til <1/1000-af det naturlige GMF gennem en 25 x 25 x 25 cm3 sfæriske volumen (se figur 1A), således at for at rumme flere petriskåle eller nogle små potter til plantevækst.
Den præsenteres her metode er blevet anvendt på anlægget biologiske undersøgelser; Men systemet giver en bred vifte af eksperimenter, herunder virologi og mikrobiologi, samt undersøgelser af nematoder (f.eks Caenorhabditis elegans), leddyr og små dyr (herunder mus og rotter). Derfor test af hypotesen om, at tilbageførsel af GMF er i standat fremkalde morfologiske og transkriptionelle ændringer kan også udvides til mange andre levende systemer, måske i sidste ende endda til humane celler.
Den GMF er i konstant forandring og svingende. Derfor, i vores forsøg en stor udfordring er at give en konstant kompensation af GMF for at opnå de ønskede nye GMF værdier. Dette kan kun opnås ved en løbende kontrol af magnetiske felter værdier gennem læsning af magnetometer værdier og spænding kompensation. Derfor kan systemet kompensere for langsomt varierende del af GMF men det gør intet for større udsving frekvens.
Afslutningsvis, anvendelsen af triaksiale spoler at vende GMF vektor var medvirkende til at påvise, at denne vending af GMF vektoren er i stand til at inducere plante morfologiske ændringer og differentiel genekspression. De opnåede resultater med den præsenterede metode giver en overbevisende dokumentation til støtte for hypotese, at GMF reversals kunne have været en af de drivende kræfter for plante udvikling over geologiske tidsskalaer 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
| DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
| Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Ethanol | Sigma | 2860 | |
| GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
| RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
| RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
| 2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Petri dish square (120 x120 mm2) | Sigma | Z692344 |
References
- Maffei, M. E. Magnetic field effects on plant growth, development, and evolution. Front. Plant Sci. 5, (2014).
- Occhipinti, A., De Santis, A., Maffei, M. E. Magnetoreception: an unavoidable step for plant evolution. Trends Plant Sci. 19 (1), 1-4 (2014).
- Harris, S. R., et al. Effect of magnetic fields on cryptochrome-dependent responses in Arabidopsis thaliana. J. Royal Soc. Interf. 6 (41), 1193-1205 (2009).
- Phirke, P. S., Kubde, A. B., Umbarkar, S. P. The influence of magnetic field on plant growth. Seed Sci. Technol. 24 (2), 375-392 (1996).
- Abe, K., Fujii, N., Mogi, I., Motokawa, M., Takahashi, H. Effect of a high magnetic field on plant. Biol. Sci. Space. 11, 240-247 (1997).
- Volpe, P. Interactions of zero-frequency and oscillating magnetic fields with biostructures and biosystems. Photochem. Photobiol. Sci. 2 (6), 637-648 (2003).
- Belyavskaya, N. A. Biological effects due to weak magnetic field on plants. Adv. Space. Res. 34 (7), 1566-1574 (2004).
- Weber Bittl, R., S, Transient radical pairs studied by time-resolved EPR. Biochim. Biophys. Acta- Bioenerg. 1707 (1), 117-126 (2005).
- Pazur Galland, P., A,
- Minorsky, P. V. Do geomagnetic variations affect plant function. J. Atm. Solar-Terrestr. Phys. 69 (14), 1770-1774 (2007).
- Burda Vanderstraeten, J., H, Does magnetoreception mediate biological effects of power-frequency magnetic fields. Sci. Tot. Environ. 417, 299-304 (2012).
- Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination. Plant Physiol. 138 (2), 790-802 (2005).
- Wan, L. L., Ross, A. R. S., Yang, J. Y., Hegedus, D. D., Kermode, A. R. Phosphorylation of the 12 S globulin cruciferin in wild-type and abi1-1 mutant Arabidopsis thaliana (thalecress) seeds.. Biochem J. 404, 247-256 (2007).
- Sancenon, V., Puig, S., Mira, H., Thiele, D. J., Penarrubia, L. Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 51 (4), 577-587 (2003).
- Foyer, C. H., Karpinska, B., Krupinska, K. The functions of Whirly1 and Redox-Responsive Transcription Factor 1 in cross tolerance responses in plants: A hypothesis. Philos.Trans.Royal Soc.B-Biol.Sci. 369 (1640), 20130226 (2014).
- Myouga, F., et al. A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (11), 3148-3162 (2008).
- Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., Noctor, G. Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. J. Exper. Bot. 61 (15), 4197-4220 (2010).
- Bassham Contento, A. L., C, D. Increase in catalase-3 activity as a response to use of alternative catabolic substrates during sucrose starvation. Plant Physiol. Biochem. 48 (4), 232-238 (2010).
- Kangasjarvi, S., et al. Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses. Biochem. J. 412, 275-285 (2008).
- Begara-Morales, J. C., et al. Dual regulation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine nitration and S-nitrosylation. J. Exper. Bot. 65 (2), 527-538 (2014).
- Li, N., et al. AtrbohD and AtrbohF negatively regulate lateral root development by changing the localized accumulation of superoxide in primary roots of Arabidopsis. Planta. 241 (3), 591-602 (2014).
- Skoog Murashige, T., F, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nuc. Acids Res. 29 (9), (2001).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Phillips, M. A., D'Auria, J. C., Luck, K., Gershenzon, J. Evaluation of candidate reference genes for real-time quantitative PCR of plant samples using purified cDNA as template. Plant Mol. Biol. Rep. 27 (3), 407-416 (2009).
- Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).
- Tsukaya, H. Developmental genetics of leaf morphogenesis in dicotyledonous plants. J. Plant Res. 108 (1092), 407-416 (1995).
- Szymanowska-Pulka, J. Form matters: morphological aspects of lateral root development. Ann. Bot. 112 (9), 1643-1654 (2013).
- Black Bewley, J. D., Seeds, M. Physiology of development and germination. , Plenum Press. New York. (1994).
- Kato-Noguchi, H., Ota, K., Kujime, H., Ogawa, M. Effects of momilactone on the protein expression in Arabidopsis germination. Weed Biol. Manage. 13 (1), (2013).
- Khandelwal, A., Elvitigala, T., Ghosh, B., Quatrano, R. S. Arabidopsis transcriptome reveals control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor. Plant Physiol. 148 (4), 2050-2058 (2008).
- Haddad, J. J. Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology. Respirat. Res. 3 (1), (2002).
