Abstract
En av de mest spennende observasjoner i anlegget evolusjon er en sammenheng mellom forekomst av geomagnetiske felt (GMF) reversering (eller utflukter) og øyeblikket av strålingen fra angiosperms. Dette førte til hypotesen om at endringer i GMF polaritet kan spille en rolle i plante evolusjon. Her beskriver vi en metode for å teste denne hypotesen ved å utsette Arabidopsis thaliana å kunstig snudd GMF forhold. Vi brukte et tre-akset magnetometer og de innsamlede data ble brukt for å beregne størrelsen av GMF. Tre DC strømforsyninger ble koblet til tre Helmholtz spolepar og ble styrt av en datamaskin til å endre GMF forhold. Planter dyrket i Petri-plater ble utsatt for både normal og reversert GMF betingelser. Eksperimenter Sham eksponerings ble også utført. Synlige plantene ble fotografert under eksperimentet, og bilder ble analysert for å beregne rot lengde og bladområder. Arabidopsis total RNA ble ekstrahert og kvantitativeReal Time-PCR (qPCR) analyser som ble utført på genekspresjon av CRUCIFERIN 3 (CRU3), kobber transport protein1 (COTP1), Redox Responsive transkripsjons Factor1 (RRTF1), Fe superoksiddismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal askorbat peroksidase (TAPX), en cytosolisk askorbat Peroxidase1 (APX1), og NADPH / respiratorisk burst oxidase protein D (RbohD). Fire forskjellige referanse gener ble analysert for å normalisere resultatene av qPCR. Den beste av de fire genene ble valgt og den mest stabile genet for normalisering ble anvendt. Våre data viser for første gang at reversering av polariteten ved hjelp GMF treaksede spoler har betydelige virkninger på plantevekst og genekspresjon. Dette støtter hypotesen om at GMF reversering bidrar til å indusere endringer i planteutvikling som kan rettferdiggjøre en høyere seleksjonspress, til slutt fører til plant evolusjon.
Introduction
Jordens magnetfelt (eller ekvivalent det geomagnetiske feltet, GMF) er en uunngåelig miljøfaktor for alle organismer som lever på planeten, inkludert planter. Den GMF har alltid vært en naturlig del av jorden, så i løpet av evolusjonen, alle levende organismer opplevde sin handling. En økende mengde av bevis viser at GMF er i stand til å påvirke mange biologiske prosesser 1. Den GMF er ikke ensartet, og det er betydelige lokale variasjoner i dens størrelse og retning på overflaten av jorden. Den GMF på jordens overflate viser et bredt spekter av størrelser, alt fra mindre enn 30 jjT til nesten 70 jjT. Den GMF beskytter jorda og dens biosfæren fra de dødelige effektene av solvinden ved å avlede de fleste av sine ladede partikler gjennom magnetosfæren to.
Planter svare på miljømessige stimuli; og klassiske svar på abiotiske faktorer som lys og gravitasjon har vært thoroughly rives ved å definere den såkalte phototropic og gravitropic svar. Svært lite, eller ingenting, er kjent om mekanismene for persepsjon og respons av planter til magnetiske felt, til tross for mengde artikler publisert om dette emnet og nylig anmeldt en. I motsetning til gravitasjonsfelt, den GMF endret konsekvent under anlegget evolusjon og dermed representerer en viktig abiotiske stressfaktor som har nylig blitt ansett som en potensiell drivkraft til slutt bidra til å plante diversifisering og arts to. Geomagnetiske reversering (eller utflukter) er endringer i polariteten til GMF. Under Jordas livshistorie, GMF reversering skjedde flere ganger. Disse utsatt planeten til perioder med redusert GMF styrke under hver polaritet overgang. Noen forfattere har en hypotese om at disse overgangene perioder med lav GMF styrke kan ha tillatt ioniserende stråling fra solvinden å nå jordens overflate, og dermed indusere enkonsekvent stress til levende organismer, som kunne ha vært sterk nok til å indusere genet endringer til slutt fører til plante evolusjon to.
En detaljert analyse av eksperimenter som beskriver virkningen av magnetiske felter på planter viser et stort antall motstridende rapporter, karakterisert ved en mangel på troverdige biofysiske interaksjons mekanismer. Mange forsøk er rett og slett urealistisk, mens andre mangler en testbar hypotese og, til slutt, er unconvincing tre. Over de siste årene har utviklingen og status for forskning på effekten av magnetiske felt på anlegget blitt anmeldt 2,4-11. Nylig har effekten av både lav og høy magnetfelt blitt grundig diskutert en, med et særlig fokus på involvering av GMF reversering hendelser på anlegget evolusjon to.
De mest direkte måte å underbygge hypotesen om at GMF reverse påvirke anlegget utviklingen er å syntetisere en GMFreversering i laboratoriet ved å teste responsen av planter til normal og reversert magnetiske feltforhold. For å teste hypotesen, derfor bygde vi en triaksial åttekantede Helmholtz spiral-parene magnetfelt kompensasjonssystem (treaksiale spoler), som er i stand til å nøyaktig reversere den normale GMF forhold.
Vi brukte Arabidopsis thaliana som modell anlegg og vi testet virkningen av revers GMF på genekspresjon av noen viktige gener: CRUCIFERIN 3 (CRU3), som koder for et 12S kornlagrings protein som er tyrosin-fosforylert og dets fosforylering tilstand er modulert i respons til ABA i Arabidopsis thaliana frø 12,13; Copper Transport protein1 (COTP1), som koder for et heavy metal transport / avgiftning super protein med den dominerende funksjon i jord Cu oppkjøp og pollen utvikling 14; og Redox Responsive transkripsjon Factor1 (RRTF1),som koder for et medlem av ERF (etylen responsfaktor) familien B-tre av ERF / AP2 transkripsjonsfaktor familie som inneholder ett AP2 domene som lette synergis co-aktivering av genuttrykk stier og konferere kryss toleranse for abiotiske og biotiske streker 15.
Videre har vi også analysert fem gener som er involvert i oksidativt stress reaksjoner: Fe Superoxide Dismutase1, (FSD1), som koder for et cytoplasmisk enzym som enzymatisk og raskt omdanner superoksid anion (O 2 -) og vann (H2O) i hydrogenperoksyd (H 2 O 2) og molekylært oxygen (O2) 16; Catalase3 (CAT3), at det koder og enzymet som katalyserer nedbrytningen av H 2 O 2 til vann og oksygen 17,18; Thylakoidal Askorbat peroksidase (TAPX), som koder for en chloroplastic thylakoid peroksidase som scavenges H 2 O2 19; Askorbat Peroxidase1 (APX1), som koder for et cytosoliske peroksidase som scavenges H 2 O 2, og representerer en av de mulige mål for post-translasjonelle modifikasjoner som medieres av NO-avledede molekyler 20; og NADPH- Respiratory burst oxidase protein D (RbohD) som koder for et enzym som genererer O 2 - og spiller sentrale roller i regulering av vekst, utvikling og stressresponser i Arabidopsis 21.
Vårt felt-reversering metodikken gir det første bevis for at GMF reversering kan indusere en betydelig endring i morfologi og genuttrykk av A. thaliana røtter og skudd. Denne protokollen gir en innovativ måte å evaluere effekten av GMF reversering på anlegget morfologi og genekspresjon og kan brukes til å vurdere den potensielle effekten av GMF reversering på andre aspekter av anlegget atferd, og dermed lede diskusjonen om role av GMF reversering på anlegget evolusjon.
Protocol
1. Innstilling av Triaxial Coils
NOTE: Figur 1 viser de triaksiale spoler som brukes for å reversere GMF.
- Slå på tre-akset magneto, hvis sonde settes inn i den triaksiale spoler.
- Slå på datamaskinen og starte magneto programvare som gjør at data kan hentes fra tre akser magnetometer.
- Bruk komponentverdiene rapportert av magnetometeret til å beregne størrelsen av GMF. For eksempel, med magnetometerverdier: Bx = 6,39 jjT, Av = 36,08 jjT, Bz = 20,40 jjT beregne en feltstyrke på 41,94 jjT ved hjelp av følgende ligning: B = B GMF + B ekstra, hvor B ekstra = (Bx 2 + Ved 2 + Bz 2) ½ (dvs. 41,9 jjT i eksemplet).
- Slå på de tre DC strømforsyninger (dual range: 0-8V / 5A og raskere 0-20V / 2.5A, 50W) hver og en er koblet til tre par,es av Helmholtz spoler og koblet til en datamaskin via en GPIB tilkobling (Figur 1b).
- Set spenningene for strømforsyninger for å generere det ønskede magnetfelt med en omvendt magnetfeltvektor. For eksempel, med B GMF som i trinn 1.3, og med spolen størrelsen av instrumenteringen som er beskrevet her, angir spenningene V x = 0,00 V, V y = 30,52 V, V z = 0,00 V for å generere en ny resulterende B = B GMF + B treaksiale spoler = (6,38, -36,08, 20.39) jjT. dvs. et nytt felt med samme størrelsesorden som B GMF men peker til en annen retning.
- Bekreft det nye feltet med magneto programvare ved hjelp av metoden beskrevet i 1.3.
- Expose planter til både normal og reversert GMF forhold ved hjelp petriplater som beskrevet i kapittel 2.
- Utføre eksperimenter narre eksponering ved å holde størrelsen av feltet er lik | B GMF | og holdeden vertikale komponent av feltet er lik den for GMF, men å forandre retningen (dvs. "nord, øst eller vest") av horisontalkomponenten av feltet med like strømmer i de triaksiale spoler i forhold til den reverse felt tilstand. Gjør dette ved å endre spenningen til spolene som beskrevet i 1.5.
Merk: Denne humbug eksponering utelukker potensielle subtil oppvarming eller vibrasjonseffekter fra enten spoler selv eller fra elektronikken brukes til å styre spolene. - Kjør dobbeltblinde forsøk ved å bruke feltforhold blindet fra utførende personell resten av forsøkene og / eller tolke dataene.
2. Utarbeidelse av plantemateriale og vilkår for plantevekst
- Bruk av Arabidopsis thaliana frø, ecotype Columbia 0 (Col 0), setter deretter inn i et 1,5 ml rør og overflate sterilisere ved behandling med en 5% (w / v) kalsiumhypokloritt oppløsning og 0,02% (v / v) Triton X-100 i 80% etanol (EtOH), i 10-12 minutter ved 25-28 ° C, med kontinuerlig risting. Deretter skylles to ganger med 80% EtOH, vask med 100% EtOH og til slutt skylles med sterilt destillert vann.
- Forbered en L av Murashige og Skoog 22 (MS) modifisert medium ved å legge til: 2,297 g MS (0,5 x MS Basal Salt Blanding), 10 g Sukrose, deionisert vann opp til en L, pH 5,8 til 6,0 justert med KOH. Legg 16 g agar og autoklav i 20 min, 120 ° C.
- Før størkning, hell 80 ml medium i hver (120 x 120 mm 2) firkantede Petri plater. Sow tretti sterile frø på plate, og deretter forsegle plater med en voksaktig film.
- Vernalize platene horisontalt i mørke ved 4 ° C i 2 dager for å forsterke og synkronisere spiring, og deretter utsette Petri-plater som enten normal eller reversert GMF.
- Expose frø i et klima kontrollert miljø ved 22 ° C i en vertikal stilling i parallelle eksperimenter både inni triaksiale spoler og utenfor triaksiale spolerunder en daglengde tidsplan for 8 timers mørke og 16 timer lys, ved hjelp av natrium lamper damp (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Bruk en blå gelatin film for spotlight for å redusere røde komponenten av lamper.
- Expose planter for 10 dager før RNA ekstraksjon til både normal (kontroll) og reversering (behandling) GMF forhold.
- Etter eksponering, ta bilder av petriskåler.
- Bruk ImageJ programvare for å beregne rot lengde og blad områder.
- I korte trekk måles siden av Petri-plate, og deretter åpne bildet av Petri platen og ved hjelp av "straight" linje mulighet for å trekke en linje som krysser nøyaktig platesiden.
- I "analysere" -menyen velger du "sett scale" og sett den faktiske avstanden i "kjent distanse" boksen (f.eks 120 mm), og sett i lengdeenhet (mm); til slutt klikker på "global" for å foreta innstillinger tilgjengelig for alle målinger.
- For root lengde, følger nøye formen på roten ved hjelp av frihånd verktøyet. Mål lengden ved å bruke "tiltak" i "analysere" -menyen. Fortsett å måle alle røtter i bildet og lagre filen for videre statistiske analyser.
- For bladareal, fra "image" -menyen bruker du justere alternativet og deretter "farge terskel". Velg den enkelte blad og i "analysere" -menyen, velg "analysere partikler". Redd individuelle målinger for statistiske analyser.
3. Arabidopsis Total RNA Utvinning, Kvantitativ Real Time-PCR (qPCR) Reaksjons betingelser og Primere for Arabidopsis
- Samle separat 30 skudd og 30 røtter og umiddelbart fryse i flytende nitrogen. Deretter male i flytende nitrogen med morter og støter.
- Isoler total RNA ved hjelp av en rensesett og RNase-Free DNase behandling kit ved å bruke produsentenseh instruksjoner.
- Sjekk prøven kvalitet og kvantitet ved hjelp av en RNA nano kit og kapillær gel elektroforese i henhold til produsentens instruksjoner. Bekreft kvantifisering av RNA spektrofotometrisk.
- Bruk to mikrogram total RNA og tilfeldige primere ved hjelp av et cDNA Reverse Transcription Kit for å få First Strand cDNAs henhold til produsentens anbefalinger.
- Utføre alle eksperimenter på en Real-Time System bruker SYBR grønn jeg med ROX som en intern lasting standard.
- Utfør omsetningen med 25 ul av blanding bestående av 12,5 mL av 2x SYBR Grønn qPCR Master Mix, 0,5 mL av cDNA og 100 Nm primere. Bruk primere oppført i tabell 1. Inkluder i kontrollene ikke-RT kontroller (ved hjelp av total RNA uten revers transkripsjon å overvåke for genomisk DNA forurensning) og ikke-mal kontroller (vann i stedet for mal).
- Beregn primer effektivitet for alle grunning parene ved hjelp av standardkurve metoden 23.
- Bruk følgende PCR betingelser: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min ved 95 ° C, 40 sykluser av 15 sekunder ved 95 ° C, 30 sek ved 58 ° C og 30 sek ved 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3, TAPX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min ved 95 ° C, 40 sykluser av 15 sekunder ved 95 ° C, 20 sek ved 57 ° C og 30 sek ved 72 ° C.
- Les fluorescens etter hver gløding og forlengelsesfasen. For alle går, utfører et smeltekurve analyse fra 55 til 95 ° C ved å inkludere dissosiasjon segment i den termiske profilen. Bruk dissosiasjonskurve skjermen tilgang til via kategorien resultater for å vise dissosiasjon profilen (plott av den fluorescens som en funksjon av temperaturen). Sørg for at datasettet samlet inn under dissosiasjon segment av forsøket er valgt for analyse ved hjelp av Analyse / Setup-skjermbildet.
- Bestem linear rekke mal konsentrasjon til terskel syklus verdi (Ct-verdi) ved å utføre en tidoblet fortynningsserie (1- til 10 3-gangers) ved hjelp av cDNA fra tre uavhengige RNA ekstraksjon analyseres i tre tekniske replikater 24,25.
- Analysere alle forsterker tomter med Real-Time PCR instrument programvare for å få Ct verdier. Kalibrere og normal relative RNA-nivåer med nivået på de beste housekeeping gener som følger: 3.11.1) Åpne Amplification Tomter skjermen gjennom kategorien Resultater, velg rampe eller platå for hvilke data som skal analyseres ved hjelp av analyse Utvalg / installasjonsprogrammet og velg deretter DRN (baseline-korrigert normalisert fluorescens) fra Fluorescens menyen på kommandopanelet. Åpne Plate sampelverdier skjermen gjennom fanen resultater å vise Ct-verdiene for de samplede brønner.
- Bruke fire forskjellige referansegener [f.eks cytoplasmatiske glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, (GAPC2), ubiquitin specific protease 6 (UBP6), Actin1 (ACT1) og elongeringsfaktor 1B alfa-underenhet 2 (eEF1Balpha2)] for å normalisere resultatene av sanntid PCR. Velg den øverste rangert genet ved hjelp av en analyse programvare 26; og bruke den mest stabile genet for normalisering.
- Kort, organisere inndata på et Excel-ark med den første kolonnen som inneholder genet navn og første rad som inneholder eksempel navn. Deretter velger analyse programvare fra menylinjen. Bruk dialogboksen til å velge det innførte beløp.
- Deretter kontrollerer feltene Eksempel navn, genet navn og enkel utgang bare. Klikk på Start-knappen for å utføre analysen. Velg den øverste rangert genet (som har den minste stabilitet verdi) som kandidat genet mest stabilt uttrykt.
- Plott data ved å vise differensial ganger endring uttrykk i både skudd og røtter.
4. Statistiske analyser
- Uttrykke data som gjennomsnittsverdier ± standardfeil. Sammenlign control og behandlingsgruppene ved å utføre variansanalyse (ANOVA) og Tukey test med Bonferroni og Dunn-Sidak Justert Sannsynlighets test (0,95% konfidensintervall).
Representative Results
Formålet med denne protokollen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for å vurdere om reversering av det geomagnetiske felt (GMF) kan påvirke planteutvikling og genekspresjon av Arabidopsis thaliana ecotype Col 0. triaksial spoler som vist i figur 1A er brukt til å reversere GMF når settet med de passende drivspenninger (figur 1B), oppnådd som beskrevet i trinn 1.5 i protokollen. Dimensjonene av triaksiale spoler er ~ 2 x 2 x 2 m 3, som tillot tilstrekkelig plass med reversert GMF vilkår som vert flere Petri plater. Kontrollene ble dyrket i de samme miljøforhold og ved normale GMF verdier. Etter 10 dager med eksponering til normal og reversert GMF betingelser, fenotypen av planter viste åpenbare morfologiske endringer. Som vist i figur 2, kontrollplanter (dvs. dyrket i normale GMF forhold) viste liggende lengder med signifikant (Dunn-Sidak og Bonferroni Justert Prob <0,001;Student t = 10,68, df = 31) høyere verdier (29,41 mm; SEM = 1,04; N = 32) med hensyn til planter som er utsatt for reversert GMF (17,53 mm; SEM = 0,58; N = 36). I GMF-reverserte planter ble morfologien av skudd også endres ved å vise en nedsatt utvikling av paknings ekspansjon. Planter utsatt for normale forhold, viste en gjennomsnittlig bladareal på 4,95 mm 2 (SEM 0,025, N = 54), mens planter som utsettes for omvendte GMF forholdene viste signifikant (Dunn-Sidak og Bonferroni Justert Prob = <0,001; students t = 31,32, df = 53) nedre bladarealverdier (3,71 mm 2, SEM = 0,032; N = 54). Derfor, eksponering av Arabidopsis for reversert GMF betingelser induserte en reduksjon i både lengde og rot bladareal.
Leaf ekspansjon og rotvekst er avhengig av både divisjon og forlengelsen av celler 27. Derfor plante utvikling, produktivitet og generelle egnethet er avhengig av en optimal fotograf- og root-systemarkitektur <sup> 28. Den reduserte rot lengde og blad størrelse av planter som er utsatt for reversert GMF betingelser å indikere tilstedeværelse av et følersystem i stand til ikke bare å oppfatte variasjoner i magnetisk feltstyrke, men også for å reagere på endringer i det magnetiske felt "retning" i forhold til tyngdekraften. Hypotesen om at GMF reversering kan påvirke plantevekst finner overbevisende bevis i våre eksperimenter, som viser at GMF reversering forhold kan påvirke planteutvikling.
De morfologiske forandringer ble også ledsaget av endringer i genekspresjon. Blant husholdningsgener, den mest stabile genet var elongeringsfaktor 1B alfa-underenhet 2. Den første gruppen av gener (CRU3, COTP1, RRTF1) viste en dramatisk endring i genekspresjon (figur 3). Shoot uttrykk for alle tre gener betydelig høyere (P <0.05) med om lag 2,5 ganger i planter utsatt for reserved GMF forhold. Root ekspresjon av CRU3 ble oppregulert i røttene på plantene utsettes for normale GMF betingelser, men var signifikant (P <0,05) nedregulert i reversert GMF forhold. Det motsatte ble funnet for COTP1 og RRTF1, som ble nedregulert under normale forhold og oppregulert i nærvær av GMF reversering (figur 3).
Cruciferin (en 12 S globulin) er den mest tallrike lagring protein i frøene av A. thaliana og andre crucifers og syntetiseres som en forløper i grove endoplasmatiske retikulum. Det blir deretter transportert til protein lagrings vakuoler 13. Frøplante spiring krever nedbryting av cruciferin, som brukes som en første kilde av nitrogen. Nedregulering av cruciferin nedbrytning reduseres embryo utvikling ved å nedsette cellestrukturer eller cellekomponenter utviklings 29,30. Våre resultater viser at oppregulering av CRU3 korrelerer medet nedre blad ekspansjon og en redusert rot lengde, således indikerer at dette genet i følsomme for GMF reversering, og at dets overekspresjon kan bidra til reduksjon av planteutviklingen. Videre induserer GMF reversering en betydelig nedregulering av CRU3 i røtter, som korrelerer med en redusert rot lengde. Kobber er en viktig kofaktor for sentrale prosesser i planter, men det utøver skadelige effekter når i overkant; således, overuttrykke kobber transport kompromisser plantevekst. Effekten av GMF reversering var en betydelig overuttrykte COTP1 i både skudd og røtter, noe som forklarer den reduserte veksten anlegget. Ion spenning svekker kloroplast metabolisme, som er tett knyttet til redox tilstanden til cellen. I Arabidopsis transkripsjonsfaktor RRTF1 er viktig for ekspresjon av gener som er knyttet til evnen til å tilpasse seg endringer redoks-31. Derfor, når plantene blir utsatt for eksterne stimuli i stand til å endre sin fysiologiske og utviklingal-programmer en overekspresjon av dette viktige transkripsjonsfaktor er forventet. Reversering av GMF induserte en betydelig overuttrykte RRTF1 i både skudd og røtter, og dermed indikerer høyere oksidativt stressresponser av planter til reverseres GMF forhold.
Interessante resultater oppnås ved å analysere de fem gener som er involvert i oksidativt stress. Generelt har alle genene hentet og analysert i skuddene ingen signifikant forskjell (P> 0,05) når plantene ble dyrket i normal eller reverseres GMF forhold (figur 4 og figur 5). Men en betydelig nedregulering ble alltid observert i røtter av planter som er utsatt for reversert GMF betingelser. Spesielt CAT3 viste den høyeste nedregulering (figur 5), fulgt i rekkefølge av nedregulering av APX1, FSD1, RBOHD og TAPX (figur 4).
Cross toleranse til enbiotiske og biotiske spenning tilveiebringes ved aktivering av forskjellige gener som er involvert i en rekke biokjemiske reaksjonsveier. RRTF1 transkripsjonsfaktor letter den synergis ko-aktivering av gen-ekspresjon av disse banene 15,31, og kan potensielt er involvert i oksidativt stress 32. Derfor er oppregulering av RRTF1 forventet når oksygenfjerningen reduseres. Nedregulering av rot-inaktiverende enzymer som korrelerer med oppregulering av RRTF1, som virker i respons til økt oksidativt stress. Den dramatiske roten nedregulering av CAT3, APX1 og TAPX indikerer redusert evne til rot-celler for å absorbere H 2 O 2, som er ledsaget av en redusert evne til å dismutate den superoksid anion ved nedregulering av FSD1. De oksidativt stress reaksjoner er høyere i røtter, som synes å være det viktigste området for reversert GMF oppfatning.
Figur 1. geomagnetiske felt kompensasjonssystem. (A) treaksede spoler (som omfatter et par av åttekantede spoler for hver av de tre vinkelrette akser) som brukes til å reversere den geomagnetiske feltvektor. (B) En datastyrt strømforsyningen er forbundet med hvert par av Helmholtz-spoler. (Spenninger i disse tallene er vilkårlig) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Effekter av geomagnetiske felt reversering på Arabidopsis morfologi. Etter ti dager med eksponering, kontrollanlegg (dvs. de som utsettes for normale GMF forhold) viser en signifikant større rot lengde og mer expanded brosjyrer sammenlignet med planter som ble eksponert for reversert GMF forhold. Metric bar = 18 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Effekter av geomagnetiske felt reversering på Arabidopsis genuttrykk. Etter ti dager med eksponering, ble total RNA fra kontroll og behandlede planter ble ekstrahert og analysert ved hjelp av Real-Time PCR-analyse for ekspresjon. Effekten av reversering av GMF var å indusere en drastisk endring i genuttrykk av alle genene som ble testet CRU3, Cruciferin 3;. COTP1, Kobber Transport protein1; RRTF1, Redox Responsive transkripsjon Factor1. Linjene indikerer standardfeil; stjernene indikerer signifikant (p <0,05) forskjell mellom plmaur utsatt for reverseres og normale GMF forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Effekter av geomagnetiske felt reversering på Arabidopsis antioksidant-relaterte genuttrykk. Etter ti dager med eksponering, er total RNA av kontroll og behandlede planter isolert og ansatt genuttrykk analyse for bruk av Real-Time PCR. Effekten av reversering av GMF var å indusere ingen vesentlige endringer i shoot genekspresjon; ble imidlertid en drastisk nedregulering observert i roten genuttrykk av planter dyrkes under reverseres GMF forhold TAPX, Thylakoidal askorbat Peroxidase;. APX1, Askorbat Peroxidase1; FSD1, Fe Superoxide Dismutase1; RbohD, NA. DPH / Åndedretts burst oxidase protein D Barer indikere standard feil; stjernene indikerer signifikant (p <0,05) forskjeller mellom planter utsettes for reversert og normale GMF forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Effekter av det geomagnetiske feltet reversering på Arabidopsis Katalase 3 (CAT3) genuttrykk. Etter ti dager med eksponering, er total RNA av kontroll og behandlede planter isolert og ansatt genuttrykk analyse for bruk av Real-Time PCR. Effekten av reversering av GMF var å indusere ingen vesentlige endringer i shoot genekspresjon; ble imidlertid en drastisk nedregulering observert i roten genuttrykk av planter dyrket under reverseres GMF forhold. Linjene indikerer standard error; stjernene indikerer signifikant (p <0,05) forskjeller mellom planter utsettes for reversert og normale GMF forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi har nylig viste at en fantastisk korrelasjon mellom GMF føringer og den tiden da avledning av det meste av familiære angiosperm linjene skjedde to. Men til tross for stimulerende hypoteser og mengde studier på effekten av varierte GMF intensiteter, antagelsen om at GMF reversering kan selv forårsake betydelige endringer i plante genekspresjon og morfologi har aldri blitt demonstrert. Her viser vi for første gang, en metode som anvender en Helmholtz triaksial åttekantede spiral for å reversere GMF i vårt laboratorium, og at reverseringen av det omgivende magnetiske feltet kan forårsake fenotypiske endringer og modulering av genekspresjon i planter.
For å oppnå GMF reversering (eller modifikasjon) over et tilstrekkelig volum for plantevekstforsøk (2 x 2 x 2 m 3), vi bygget et åttekantet Helmholtz-spolesystem. Dette systemet er ikke kommersielt tilgjengelig (vanligvis Helmholtz-spolene er ringformet og mindre)og kostnadene for byggingen var betydelig. Viktigere, leverer dette systemet robust feltet modifikasjon, med eksepsjonell tids stabilitet og homogenitet i de modifiserte magnetiske felt.
Systemet er konstruert og bygget for å redusere verdien av den GMF til en tusendel av det normale forhold, eller å reversere noen av de tre dimensjonene av det magnetiske felt. Imidlertid ikke utformingen av spolene ikke tillater å generere en høy magnetisk feltstyrke. Derfor er dette instrumentet i sin nåværende form ikke er egnet for forsøk utformet for å evaluere effekten av høy magnetisk feltstyrke på planter eller andre organismer.
I laboratoriet har endring av GMF ligner på dem beskrevet i denne metoden er oppnådd ved forskjellige metoder, inkludert skjerming ved å omgi den eksperimentelle sonen ved ferromagnetiske metallplater med høy magnetisk permeabilitet, som avviker magnetiske felt og konsentrerer dem i metallet selv. The fordel ved å anvende Helmholtz spoler er at systemet tillater plantene å bli utsatt for mer naturlige betingelser (lys, luftsirkulasjon, etc.), noe som gjør det ideelt ikke bare for in vitro-studier (som ved bruk av petriskåler), men også for in vivo plantevekst og utvikling av eksperimenter. Dimensjonene av systemet skaper et mellomrom som tillater en undertrykkelse opp til <1/1000 th av den naturlige GMF gjennom en 25 x 25 x 25 cm 3 sfærisk volum (se figur 1A), noe som tillater å arrangere flere Petri-plater eller noen små potter for plantevekst.
Metoden som presenteres her har blitt brukt til plantebiologi studier; imidlertid tillater systemet en rekke forsøk, herunder virologi og mikrobiologi, samt studier på nematoder (f.eks Caenorhabditis elegans), leddyr og små dyr (inkludert mus og rotter). Derfor tester av den hypotese at reversering av GMF er i standå indusere morfologiske og transkripsjonelle endringer kan også utvides til mange andre levende systemer, kanskje til og med til slutt til menneskeceller.
Den GMF er i stadig endring og varierende. Derfor, i våre eksperimenter en stor utfordring er å tilveiebringe en konstant kompensasjon av GMF for å oppnå de ønskede nye GMF verdier. Dette kan bare oppnås ved en kontinuerlig kontroll av magnetiske felt verdier ved lesing av magnetometerverdier og spenningskompensasjon. Derfor kan systemet kompensere for den langsomt varierende del av GMF, men det gjør ingenting for høyere frekvenssvingninger.
Som konklusjon, bruk av treaksede spoler for å reversere GMF vektoren var medvirkende til å vise at denne reversering av GMF vektoren er i stand til å indusere plante morfologiske endringer og differanse genekspresjon. De oppnådde med den presenterte metoden resultatene gir en overbevisende bevis til støtte for hypotesen om at GMF reversals kan ha vært en av drivkreftene for anleggs utvikling over geologiske tidsskalaer 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
| DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
| Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Ethanol | Sigma | 2860 | |
| GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
| RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
| RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
| 2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Petri dish square (120 x120 mm2) | Sigma | Z692344 |
References
- Maffei, M. E. Magnetic field effects on plant growth, development, and evolution. Front. Plant Sci. 5, (2014).
- Occhipinti, A., De Santis, A., Maffei, M. E. Magnetoreception: an unavoidable step for plant evolution. Trends Plant Sci. 19 (1), 1-4 (2014).
- Harris, S. R., et al. Effect of magnetic fields on cryptochrome-dependent responses in Arabidopsis thaliana. J. Royal Soc. Interf. 6 (41), 1193-1205 (2009).
- Phirke, P. S., Kubde, A. B., Umbarkar, S. P. The influence of magnetic field on plant growth. Seed Sci. Technol. 24 (2), 375-392 (1996).
- Abe, K., Fujii, N., Mogi, I., Motokawa, M., Takahashi, H. Effect of a high magnetic field on plant. Biol. Sci. Space. 11, 240-247 (1997).
- Volpe, P. Interactions of zero-frequency and oscillating magnetic fields with biostructures and biosystems. Photochem. Photobiol. Sci. 2 (6), 637-648 (2003).
- Belyavskaya, N. A. Biological effects due to weak magnetic field on plants. Adv. Space. Res. 34 (7), 1566-1574 (2004).
- Weber Bittl, R., S, Transient radical pairs studied by time-resolved EPR. Biochim. Biophys. Acta- Bioenerg. 1707 (1), 117-126 (2005).
- Pazur Galland, P., A,
- Minorsky, P. V. Do geomagnetic variations affect plant function. J. Atm. Solar-Terrestr. Phys. 69 (14), 1770-1774 (2007).
- Burda Vanderstraeten, J., H, Does magnetoreception mediate biological effects of power-frequency magnetic fields. Sci. Tot. Environ. 417, 299-304 (2012).
- Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination. Plant Physiol. 138 (2), 790-802 (2005).
- Wan, L. L., Ross, A. R. S., Yang, J. Y., Hegedus, D. D., Kermode, A. R. Phosphorylation of the 12 S globulin cruciferin in wild-type and abi1-1 mutant Arabidopsis thaliana (thalecress) seeds.. Biochem J. 404, 247-256 (2007).
- Sancenon, V., Puig, S., Mira, H., Thiele, D. J., Penarrubia, L. Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 51 (4), 577-587 (2003).
- Foyer, C. H., Karpinska, B., Krupinska, K. The functions of Whirly1 and Redox-Responsive Transcription Factor 1 in cross tolerance responses in plants: A hypothesis. Philos.Trans.Royal Soc.B-Biol.Sci. 369 (1640), 20130226 (2014).
- Myouga, F., et al. A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (11), 3148-3162 (2008).
- Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., Noctor, G. Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. J. Exper. Bot. 61 (15), 4197-4220 (2010).
- Bassham Contento, A. L., C, D. Increase in catalase-3 activity as a response to use of alternative catabolic substrates during sucrose starvation. Plant Physiol. Biochem. 48 (4), 232-238 (2010).
- Kangasjarvi, S., et al. Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses. Biochem. J. 412, 275-285 (2008).
- Begara-Morales, J. C., et al. Dual regulation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine nitration and S-nitrosylation. J. Exper. Bot. 65 (2), 527-538 (2014).
- Li, N., et al. AtrbohD and AtrbohF negatively regulate lateral root development by changing the localized accumulation of superoxide in primary roots of Arabidopsis. Planta. 241 (3), 591-602 (2014).
- Skoog Murashige, T., F, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nuc. Acids Res. 29 (9), (2001).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Phillips, M. A., D'Auria, J. C., Luck, K., Gershenzon, J. Evaluation of candidate reference genes for real-time quantitative PCR of plant samples using purified cDNA as template. Plant Mol. Biol. Rep. 27 (3), 407-416 (2009).
- Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).
- Tsukaya, H. Developmental genetics of leaf morphogenesis in dicotyledonous plants. J. Plant Res. 108 (1092), 407-416 (1995).
- Szymanowska-Pulka, J. Form matters: morphological aspects of lateral root development. Ann. Bot. 112 (9), 1643-1654 (2013).
- Black Bewley, J. D., Seeds, M. Physiology of development and germination. , Plenum Press. New York. (1994).
- Kato-Noguchi, H., Ota, K., Kujime, H., Ogawa, M. Effects of momilactone on the protein expression in Arabidopsis germination. Weed Biol. Manage. 13 (1), (2013).
- Khandelwal, A., Elvitigala, T., Ghosh, B., Quatrano, R. S. Arabidopsis transcriptome reveals control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor. Plant Physiol. 148 (4), 2050-2058 (2008).
- Haddad, J. J. Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology. Respirat. Res. 3 (1), (2002).
