Protocol
아래에 설명 된 모든 절차를 검토하고 노스 웨스턴 대학 기관 동물 사용 및 관리위원회의 승인을 멸균 조건 하에서 수행되고있다.
반딧불 루시 페라 제 표현 기자와 GL261 세포의 1. 변경
주 : HIV-1 계 렌티 바이러스 벡터는 비장 초점 형성 바이러스 (SFFV) 프로모터의 제어 하에서 반딧불 루시페라아제 (Fluc)을 표현한다. 광학 리포터 유전자는 벡터 플라스미드 pHRSIN-CSGW - dlNotI에 복제 된.
- 95을 함유하는 가습 분위기하에 37 ℃에서 10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신이 보충 된 RPMI 배지에 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 GL261 세포가 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 293-T 세포를 유지 % 공기와 5 %의 이산화탄소 (CO 2).
- 293-T 세포 배양은 T-75 플라스크에서 80 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, pH가 번 세포를 씻어osphate 완충 식염수의 Ca2 +와는 Mg2 +가없는 (PBS)는, 주 형틀이 약간 기울어 진 채 5 ㎖ 피펫으로 5 분, 씹다 37 ℃에서, 트립신 (0.05 %) 3 mL를 가진 세포를 배양하고있는 모든 세포를 수집 플라스크의 바닥에서. 15ml의 원뿔형 튜브에 트립신 세포 현탁액의 3 ㎖를 전송하고, 육체 RPMI 배지 (세포 현탁액 10 ㎖의 전체) (7)를 가하여.
- 5 ml의 피펫으로 웰 세포 현탁액을 혼합한다. 관으로부터 세포 현탁액 100 ㎕를 취하여 혈구를 이용한 세포의 수를 계산. 이렇게하려면 트리 판 블루 용액 300 μL와 세포 현탁액 100 μl를 혼합하고 혈구로 혼합물의 2 μL를 삽입합니다. 현미경 네 개의 개별 뷰에서 블루 염색하지 않고 세포의 수를 계산. 이 수가 104 세포 / ㎖를 나타내는 바와 같이, 각각의 뷰에서 세포 수의 평균.
- 한편, 30의 세포 현탁액을 포함하는 튜브를 원심7 분 0 XG. 미디어 대기음 1.0 × 106 / ㎖의 밀도로 GL261 세포 현탁액을 만들기 위해 신선한 RPMI 배지로 세포 펠렛을 재현 탁. 27.5 ml의 DMEM (1 일)와 T-175 플라스크에 넣고 RPMI 미디어 2.5 mL를 종자 2.5 × 10 6 GL261 세포.
- 24 시간 후, 20 ㎖ 신선한 DMEM (2 일)와 매체를 교체합니다.
- 상기 렌티 바이러스 벡터를 생산하고 5 분 동안 2 ml의 무 혈청 DMEM으로 54 μL 형질 감염 시약을 혼합한다. 형질 전환 시약 DMEM에 Fluc (pSIN-Fluc)의 3 개그-POL의 μg의, 수 포성 구내염 바이러스 G 봉투 (VSV-G)의 3 μg의, 4.5 μg의를 추가하고 실온에서 20 분 동안 품어. T-293 플라스크 (T-175)로 전체 DNA 혼합물을 삭제하고 48 시간 (2 일), 95 % 공기 및 5 % CO 2를 함유하는 가습 챔버 내에서 37 ℃에서 배양한다.
- (3 일) (약 30 ml를해야 293-T 세포 배양 배지의 총 부피) 형질 전환 후 24 시간 신선한 DMEM 10 ML을 추가합니다.
- 로 GL261 세포를 분할하려면24 웰 플레이트, 약간 기울어 진 술병을 들고하여 5 mL를 피펫으로 5 분, 씹다 37 ℃에서 트립신 (0.05 %) 5 ㎖와 세포를 품어의 Ca2 +와는 Mg2 +없는 PBS로 한 번 세포를 씻어 플라스크의 바닥으로부터 모든 세포를 수집하고, 단계 1.2에서와 혈구 세포를 통해 카운트. 한편, 7 분 동안 300 XG에서 튜브를 원심 분리. 미디어 대기음 2.5 × 104 / ㎖의 밀도로 GL261 세포 현탁액을 만들기 위해 신선한 RPMI 배지로 세포 펠렛을 재현 탁. 시드 24 웰 플레이트에 RPMI 매체의 1 ㎖ (3 일) 2.5 × 10 4 GL261 세포.
- 48 시간 다음과 같은 형질의 293-T 플라스크 (T-175) 10 mL를 피펫으로 렌티 바이러스 상층 액 30ml를 수집하고 50 ML 원뿔 튜브에 뜨는을 전송합니다. 대기음 30 ml의 렌티 바이러스 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 50 ML의 주사기를 통해 상층 액, 1 mL를 분취 (4 일)에 바이러스 뜨는 나누어지는.
- (R)의 1 mL로 교체렌티 바이러스 상층 액 1 ㎖과 함께 GL261 세포 판 (24도)에서 PMI 매체는 가습 실 (4 일)에 37 ° C에서 품어.
- 렌티 바이러스 감염의 48 시간 후, 신선한 RPMI 1 ㎖ (6 일)와 매체를 교체합니다.
- 24 시간 후, GL261 세포 (7 일)의 렌티 바이러스 감염을 반복한다.
- 렌티 바이러스 감염의 2 차 48 시간 후, 신선한 RPMI 1 ㎖ (9 일)와 매체를 교체합니다.
- (GL261.luc 셀로 언급되는) 변형 된 루시퍼 GL261 세포 성장 및 T-75 플라스크에 세포 배양을 확장하는 것을 계속한다.
- GL261.luc 세포 배양은 T-75 플라스크에서 70 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, 트립신 처리에 의해 세포를 수확하고, 단계 120에서와 같이 계산에 의해 혈구. 졸업 밀도에서 24- 웰 플레이트 GL261.luc 셀 플레이트 (1.0 × 106 5.0 × 105, 2.5 × 105, 1.0 × 105, 5.0 × 104, 2.5 × 104 세포 / 웰) 및 humidi에서 37 ° C에서 부화3 시간 동안 95 % 공기 및 5 % CO 2를 함유하는 챔버 얘기들이었다.
- 셀룰러 루시퍼 라제 활성에 대하여 측정 값을 생물 발광 영상 (도 1)를 이용하여 U-87 MG (U87.luc) 세포 변성 루시페라아제한다.
- 이미지 소프트웨어를 시작합니다 (바탕 화면에 아이콘을 클릭) 이미징 시스템을 초기화 (버튼을 클릭 "초기화"). 초기화가 자동으로 시작되고 시스템 검진 및 -90 ℃로 냉각 할 수있는 카메라를 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 각 웰에 루시페린의 25 μL (D-루시페린 칼륨 염, 150 ㎎ / ㎏)를 추가합니다.
- 10 초 동안 판을 실온에서 1 분 동안 루시페린과 이미지로 세포를 품어. 이미징 시스템을 설정하려면, "발광", "10 초"노출 시간, "중간"비닝 (binning)을 선택합니다. 영상 스테이션의 24 웰 플레이트를 놓고 이미지를 시작합니다 "취득"버튼을 클릭합니다.
- 이미지를 성공적으로 인수 한 후에는 이미지 창 및 도구 PA가 표시됩니다화면에 lette. "ROI (관심 지역) 도구"를 클릭하고 슬릿 아이콘에서 6 × 4를 선택합니다. 24 웰 플레이트의 이미지 신호의 영역을 커버하고 측정 탭 (연필 아이콘)을 클릭하는 6 × 4 슬릿을 만듭니다. 평방 센티미터 (광자 / 초 / / SR cm 2) 당 스테 라디안 당 초당 광자 단위로 투자 수익 (ROI) 측정의 테이블 창을 준수하십시오.
- 사용 U87.luc 셀들은, 이전에 GL261.luc 형질 세포에서 루시퍼 라제 활성을 평가하기위한 대조군으로서, GL261 개질 11 여기 사용 된 것과 같은 렌티 변성.
체외 증식 분석 2.
- GL261과 GL261.luc 세포 배양은 T-75 플라스크에서 70 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, 트립신 처리하여 세포주 모두를 수확하고, 단계 120에서와 같이 계산하고, 1,500 세포의 밀도로 96- 웰 플레이트에 플레이트 세포 또한 시간과 피펫 오차를 최소화하도록 멀티 채널 피펫을 사용하여 당 RPMI 배지 80 μL. 괜찮다ED (20) 우물의 총에 각 셀 라인. 세포에 의해 채워 우물의 증발을 제한하기 위해, 신선한 RPMI 배지 100 ㎕ 빈 우물을 입력합니다.
- 비색 세포 증식 분석법을 이용하여 세포 증식을 평가. 여기에서 우리는 MTS 세포 증식 분석을 사용합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여, 세포를 포함하는 96- 웰 플레이트의 각 웰에 MTS 시약 20 μL를 추가한다.
- 3 시간 동안 95 % 공기 및 5 % CO 2를 함유하는 가습 챔버 내에서 37 ℃에서 플레이트를 배양한다. 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정한다. 이것은 도금 후, 7 일 1, 2, 4에서 반복되고. 흡광도 값을 정규화하기 위해, 매일의 값은 1 일 (도 2)에서 얻어진 대응하는 수치로 나누어진다.
3. 종양 세포 주입
참고 : 모든 장비를 압력솥. 살균제 (2 % 클로르헥시딘 액)을 분무하여 수술 영역을 준비하고 absorben 커버T 커튼. 멸균 상태를 유지 수술시 무균 수술 장갑을 착용하고, 색 테이프로 두 영역으로 수술 영역을 나누기 위해. 지역 1 "클린"이라는 살균 공급을 포함합니다; 지역 2 "더러운"로 표시하고, 재료를 사용 포함되어 있습니다.
- 동물 수술에 앞서, 두개 내 주입을위한 세포 현탁액을 준비합니다. 70 %의 합류 T-75 플라스크 트립신에 의해 단계 1.2에서와 같이 혈구를 통해 세포를 계산하고, 2 + 칼슘없이 행크스 '균형 소금 용액에 1.0 × 10 5 세포 / μL의 농도에서 세포 현탁액을 만들어에서 수확 세포 마그네슘 2+ (HBSS).
- 0.9 %의 식염수에 자일 라진의 케타민 100 ㎎ / ㎏과 10 ㎎ / ㎏을 포함하는 200 μL 혼합물의 복강 내 주사로 쥐를 마취. 적절한 마취를 확인하려면, 마우스의 발가락을 꼬집어. 마우스가 완전 마취 경우, 마우스는 자극에 반응해서는 안된다.
- 0.1 미터를 관리피하 주사를 통해 G / kg의 부 프레 노르 핀은 수술 후 통증을 완화합니다.
- 2 % 클로르헥시딘 용액에 침지면 팁 어플리케이터 및 가위를 사용하여 깨끗한 동물의 머리의 상단 면도. 수술 중 적절한 윤활을 유지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
- 멸균 메스를 사용하여 두정 - 후두 뼈를 통해 약 1cm 길이 시상 절개를합니다. 브레 그마 시각화, 3 % 과산화수소 용액에 적신 솜 팁 어플리케이터 두개골의 표면을 닦아.
- 브레 그마의 오른쪽 바로 뒤에 관상 봉합 3mm 작은 구멍을 만들기 위해 무균 25-G 바늘 두개골을 뚫는다.
- 두개 내 주사 부위는 두개골 3 mm의 깊이에 있는지 확인하기 위해 가위를 사용하여 20 μL 피펫 팁의 끝이 뾰족 오프 3mm을 절감하고 피펫 팁에 주사기를 삽입합니다.
- 이전에 만든 구멍에 수직으로 주사기를 삽입하고 천천히 종양 세포 SUS를 주입1 분 동안 3 μL HBSS에 3.0 × 105 세포를 함유 연금. 다른 분 동안 자리에 바늘을 그대로두고 천천히 바늘을 빼냅니다.
- 3 % 과산화수소에 침지면 팁 어플리케이터 및 2 % 클로르헥시딘 용액 두개골을 면봉. 면 팁 어플리케이터 두개골의 표면을 건조시킵니다. 크기가 3 약 3mm 멸균 뼈 왁스를 잘라면 팁 어플리케이터의 측에 뼈 왁스를 연결합니다. 면 팁 어플리케이터 구멍을 충당하기 위해 뼈 왁스를 적용합니다.
- 집게를 사용하여 두개골을 통해 함께 두피의 각면을 그리고 주식은 상처를 닫습니다. 2 % 클로르헥시딘 용액에 담근면 팁과 상처를 청소합니다.
- 그들은 보행이 될 때까지 수술 후 모든 쥐를 모니터링하고 정상적인 활동을 유지합니다. 일반적으로, 회복 시간은 약 30 분이다. 그들이 완전히 마취에서 회복 될 때까지 다른 동물 케이지에 마우스를 반환하지 않습니다.
- 깨끗한 종이 타월에 살균제의 충분한 양 (0.05 % 디메틸 암모늄 클로라이드 용액)을 스프레이. 철저하게 동물 장치와 접촉 할 것 이미징 챔버 내부의 검은 색 시트, 코 콘 및 디바이더를 닦아 살균제에 젖은 종이 타월을 사용합니다. 철저하게 깨끗하고 마른 종이 타월로 모든 표면을 닦으십시오. 이 한 번 더 반복하고 5 분을 기다립니다.
- 단계 1.14.1과 촬상 국 초기화.
- 복강 주사에 의해 케타민 / 자일 라진 및 200 μL의 100 μL 루시페린 (D-루시페린 칼륨 염 150 ㎎ / ㎏)을 함유 300 μL 혼합물로 마우스를 마취.
- 주사 후 10 분을 기다린 후 쥐가 꼬리를 곤란하게하여 마취하에 완전히 있는지 확인합니다. 이미징 시스템을 설정하려면, "발광", "자동"노출 시간, "중간"비닝 (binning)을 선택합니다. 영상 stati에 마우스를 놓고과에하면 이미지를 시작합니다 "취득"버튼을 클릭합니다. 주사 후 시간이 각 이미지 세션과 일관성이 있음을 확인합니다.
- 이미지가 성공적으로 획득되면, 화상 창 및 도구 팔레트 나타나야. "투자 수익 (ROI) 도구"를 클릭하고 원 아이콘에서 "자동"을 선택합니다. ROI를 정의하기 위해, 이미지 신호의 영역을 둘러싸하고 SR 광자 / 초 / / ㎠의 단위로 ROI의 측정을 수행.
- 영상 실에서 쥐를 가지고 그들이 보행이 될 때까지 마우스를 모니터링하고 정상적인 활동을 유지합니다. 일반적으로 복구 시간은 약 15 분이다. 그들이 완전히 마취에서 회복 될 때까지 다른 동물 케이지에 마우스를 반환하지 않습니다.
- 동물은 다음과 같은 현상이 제시 될 때까지 일주일에 두 번 생물 발광 이미징에 의해 종양 성장을 모니터 : 체중 감소 (주입 전의 중량에 20 % 이상의 상대적인 손실) inappetance (24 시간 동안 완전한 거식증), 및 지속적인 purposefu 부족그들이 안락사해야하는 시간에 부드러운 자극 (최대 얻을 수있는 약한 시도)에 L 응답. 경추 탈구이어서 CO 2 챔버를 사용하여 이러한 증상이있는 동물을 안락사.
- 장소 안락사 챔버에 마우스 (과밀하지 챔버을) 유입은 5-6 분 동안 이산화탄소를 압축. 모든 동물은 무의식과 후 약 5 분 호흡을하지 않는 것을 관찰한다.
- 챔버에서 마우스를 가져 가라. 심장이 엄지와 집게 손가락 사이의 가슴을 느낌으로 치고 있지 않은지 확인하고, 깜빡임이 없음을 확인합니다.
- 평평한 표면에 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 억제하고 엄지와 다른 손의 첫 번째 손가락으로 꼬리의 한 손으로 두개골의 기지에서 목 뒤쪽과 기지를 파악.
- 머리를 제지하고 신속하게 뒤로 꼬리를 잡아 당깁니다. 그 두개골은 엄지와 첫 번째 손가락을 사용하여 첫 번째 경추에서 분리되어 있는지 확인합니다.
- 표준단계 2.3 (그림 3A)과 생물 발광 영상의 첫 번째 날에 얻은 대응하는 측정 값에 대한 매일 ALIZE 발광 값.
- 통계적인 분석을 위해, 카플란 - 마이어 추정 (12)을 이용하여 생존 곡선을 생성하고, 로그 - 랭크 테스트 (13)을 이용하여 생존 곡선 사이의 차이를 비교한다.
Representative Results
GL261 세포는 시험관 내 생물 발광 1. 촬상 인간 아교 모세포종 세포주 U87.luc 양성 대조군의 수준과 유사한 강력한 루시페라아제 발현 (도 1)를 보여주는 단계에서 상술 한 바와 같이 루시페라아제는 렌티 바이러스를 포함하여 감염시켰다. 예상대로, 감염되지 않은 GL261 세포는 어떤 배경 루시 페라 제 표현을 보여 없습니다. 이 단계에서는 아직 종래 안정 루시퍼 라제 발현을 확인 감염된 세포주를 사용하여 추가 연구를 수행하는 것이 중요 간단하다.
두개 내 주입 후 루시 페라 제 표현.
두개 내 주입하기 전에, 우리는 GL261 세포 (그림 2)에 비해 GL261.luc의 체외 성장 속도의 차이를 입증하지 않습니다. 두개 내 성장 및 생존 분석을 위해, 세포에 주입 하였다 BRGL261.luc 종양을 갖는 마우스에서 3 단계 종양 성장 프로토콜에 따라, C57BL / 6 마우스의 AINS 직렬 프로토콜을 사용하여 단계 4 생물 발광 영상을 분석 및 검출 종양 성장 (도 3a)을 입증 하였다. 신속하고 일관 GL261.luc 종양을 갖는 마우스는 죽어가는되었고 안락사시켰다. 중요한 GL261.luc 동물 베어링 GL261 종양 (도 3b) 사이의 전체 생존율에는 차이가 없다. 생체 내 생물 발광 촬상 따라서 실험 아교 모세포종 치료에 반응을 모니터링하는 데 사용될 수있다. 신속한 신뢰성 종양 성장 및 생존율은 짧은 상대적으로 짧은 시간에 많은 양의 데이터를 얻을 수있다.
GL261.luc 세포도 1 루시페라아제 활성. U87.luc는 GL261.luc 및 GL261 (대조군) 세포의 밀도로 플레이 팅 하였다1.0 × 106, 5.0 × 105, 2.5 × 105, 1.0 × 105, 5.0 × 104, 2.5 × 104 세포 / 웰에서 좌우. 발광 (광자 / 초 / / SR CM 2) 루미나 이미징 역으로 측정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 루시 페라 제 발현은 GL261 세포 증식에 영향을주지 않는다. GL261.luc 세포는 발생하지 않는다 증식의 차이는 MTS 세포 증식 분석에 의해 입증 된 바와 같이. 평균 흡광도 값을 비교함으로써 결정되는 그래프는 일 (1)에 대하여 배 증가를 나타낸다 (제 1 일 평균값 thespecified 시점에서 비교를위한 부대 t의 -test 값 (± SEM을 의미)각 셀 라인 사이 : P = 0.7796) (14). 오차 막대는 평균 값이 하루에 사통 샘플에서 (± SEM을 의미)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 루시 페라 제 발현은 생체 내 종양 성장과 동물의 생존에 영향을 미치는 것이 아닙니다. (A) 생물 발광 모니터링 C57BL / 6 마우스에서 두개 내 GL261.luc 종양의 진보적 인 성장을 보여줍니다. (B) Kaplan-Meier 생존 분석은 하나 GL261 (실선) 또는 GL261.luc 세포의 두개골 이식 마우스에 대한 전체 생존율의 차이를 보여줍니다 없습니다 (점선).이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
동계 면역 C57BL / 6 마우스에 두개골 내에 이식 할 때 GL261 쥐의 신경 교종 세포는 인간의 신경 교종 이종 이식 동물 모델에 비해 몇 가지 장점을 제공합니다. 이종 이식 종양의 대부분은 정확하게 침략 인간의 질병을 요점을 되풀이하지 않는 캡슐화 된 병변으로 성장. 반면, GL261 종양뿐만 아니라 인접한 뇌에 침략을 보여줍니다뿐만 아니라, 혈관 신생, 유사 분열, 그리고 깊은 괴사 7. 가장 중요한 것은 종양 면역학 또는 면역 전략 15, 16, C57BL / 6 마우스가 그대로 면역 시스템 (8)을 유지 공부를 할 때. 이전의 연구는 면역 사이토 카인 TGF-β의 강력한 표현을 보여 주었다 및 두개 내 종양은 인간 아교 모세포종 (9), (10)과 유사한 면역 억제 T-조절 세포가 포함되어 있습니다.
여기에 설명 된 간단한 기술은 GL261 세포에 의해 루시 페라 제의 안정적 발현 할 수 있습니다. 우리는 최근 미 신고되었습니다시험 관내 및 GL261 세포에 비해 GL261.luc 세포의 생체 내 성장 LAR은 유사한 종양 조직 학적 특성 및 면역 세포에 더하여 17 침투. GL261.luc 세포 안정적 따라서 광자 검출 광 화학적 에너지 변환 루시페린 기질의 산화를 촉매하는 루시퍼 라제를 발현. 루시페린 안전하게 동물에게 복강 내 투여 또는 정맥 내 주사 후 혈액 뇌 장벽을 통과 할 수있다. 이러한 생쥐 작은 동물 연구에서, 생물 발광을 비 침습적 방식으로 (11)에 외부 적으로 검출 될 수있다. 따라서, 종양의 성장은 직렬 동물의 희생 또는 비용 MRI 또는 CT 촬영에 대한 필요없이 평가 될 수있다.
프로토콜의 중요한 단계는 생체 내 실험을 시작하기 전에 시험 관내에서 렌티 바이러스 형질 도입, 또한 루시퍼 라제를 안정적으로 발현 대조까지도 포함한다. 전달의 손실 requi 수 있습니다반복 렌티 바이러스 감염 재. 발현 벡터에 항생제 내성 유전자의 도입은 또한 루시퍼 라제 발현을 선택하는 데 사용될 수있다. 세심한 기술 재현성 다른 처리 군의 비교를 허용하도록 정확한 해부학 적 위치에있는 세포의 수를 일치 배치 두개 내 주입을 위해 요구된다. 현재 연구 및 루시퍼 라제 발현 GL261 셀의 이전 연구 간의 주요한 차이점은 정위 프레임 (18)의 사용에 비해 세포를 주입하는 프리 핸드 기술의 사용이다. 우리는 이전에 한 손 기술 (19)과 일치 주입 결과를 보여 주었다. 자유로운 손 기술의 장점은 다른 치료제의 높은 처리량 분석을 수행 할 수있는 능력이다. 우리의 손에, 우리는 1 시간에 약 60 동물을 이식 할 수 있습니다.
기술을 습득 한 후, 미래 기술의 응용은 무한하다. GL261의 demonstr로축열 상승 유사 분열 및 인간 아교 모세포종 유사한 빠른 종양 성장은, 항 - 증식 치료제가 평가 될 수있다. GL261 종양이 침습성 및 혈관 신생이다 마찬가지로, 항 침습 및 항 - 혈관 신생 요법이 사용될 수있다. 인간 표적 겨냥 화학 치료제의 효과를 평가하는 경우에는주의가 사용되어야한다. 루시퍼 라제를 발현하는 20 인간 아교 모세포종 이종 이식편을 이용한 이전 연구에 비하여, 이것은 우리의 모델의 제한으로 간주 될 것이다. 또한, 종양 성장의 면역 요법 전략의 효과 GL261 이종 이식 모델에서 연구 될 수있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
| Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| 24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
| 96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
| Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
| 28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
| 2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
| Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
| 25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
| Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
| Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
| Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
| Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
| PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
| Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
| Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
| Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
| Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |
References
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