Protocol
Alle prosedyrer som er beskrevet nedenfor er gjennomgått og godkjent av Institutional Animal bruk og vedlikehold Utvalget ved Northwestern University og har vært utført under steriliserte forhold.
1. Endring av GL261 celler med Firefly Luciferase Uttrykke Reporter
MERK: HIV-1-basert lentivirale vektorer uttrykke ildflue luciferase (Fluc) under kontroll av milten fokusdannende virus (SFFV) promoter. Den optiske reporter-genet er blitt klonet inn i vektorplasmid pHRSIN-CSGW-dlNotI.
- Oppretthold 293-T-celler i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og GL261 celler i RPMI-medium supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 95 % luft og 5% karbondioksyd (CO 2).
- Når 293-T-celle-kulturen når 80% sammenflytning i en T-75-kolbe, vaskes cellene én gang med phosphate buffersaltløsning (PBS) uten Ca2 + og Mg2 +, inkuberes cellene med 3 ml trypsin (0,05%) ved 37 ° C i 5 minutter, triturer med en 5 ml pipette ved å holde kolben litt skråstilt og samle alle cellene fra bunnen av kolben. Overfør 3 ml trypsinert cellesuspensjon inn i en 15 ml konisk rør og legg 7 ml av kjøtt RPMI medium (totalt 10 ml av cellesuspensjonen).
- Bland cellesuspensjonen godt med en 5 ml pipette. Ta 100 mL av cellesuspensjonen fra røret og telle antall celler som bruker hemocytometer. For å gjøre dette, bland 100 mL av cellesuspensjonen med 300 ul trypanblått løsning og sette inn 2 mL av blandingen i en hemocytometer. Telle antall celler uten blå flekker fra fire separate visninger under et mikroskop. Gjennomsnittlig cellen tall fra hver visning, så dette tallet representerer 10 4 celler / ml.
- I mellomtiden, sentrifuger røret som inneholder cellesuspensjonen ved 300 x g i 7 min. Aspireres media, og resuspender cellepelletene med friskt RPMI medium for å lage en GL261 cellesuspensjonen ved tetthet på 1,0 x 10 6 / ml. Seed 2,5 x 10 6 GL261 celler med 2,5 ml RPMI media i en T-175 kolbe med 27,5 ml DMEM (dag 1).
- Etter 24 timer erstatte mediet med 20 ml frisk DMEM (dag 2).
- For å produsere den lentiviral vektor, bland 54 ul transfeksjon reagens med 2 ml serumfritt DMEM i 5 min. Tilsett 3 ug av gag-pol, 3 ug av vesikulært stomatitis virus G konvolutt (VSV-G), og 4,5 ug av Fluc (pSIN-Fluc) i DMEM med transfeksjon reagens, og inkuber i 20 min ved RT. Slipp hele DNA-blandingen inn i 293-T-kolbe (T-175) og inkuber ved 37 ° C i et fuktet kammer inneholdende 95% luft og 5% CO2 i 48 timer (dag 2).
- Tilsett 10 ml friskt DMEM ved 24 timer etter transfeksjon (totalt volum på 293 T-cellekulturmediet bør være ca. 30 ml) (dag 3).
- Å splitte GL261 celler inn i en24-brønns plate, vaskes cellene en gang med PBS uten Ca2 + og Mg2 +, inkuberes cellene med 5 ml trypsin (0,05%) ved 37 ° C i 5 minutter, triturer med en 5 ml pipette ved å holde kolben svakt skråstilte , samle alle cellene fra bunnen av kolben, og telle celler via hemocytometer som i trinn 1.2. I mellomtiden, sentrifuger røret ved 300 xg i 7 min. Aspireres media, og resuspender cellepelletene med friskt RPMI medium for å lage en GL261 cellesuspensjonen ved tetthet på 2,5 x 10 4 / ml. Seed 2,5 x 10 4 GL261 celler med 1 ml RPMI media i en 24-brønns plate (dag 3).
- Samle 30 ml av lentiviral supernatant med 10 ml pipette fra 293-T kolbe (T-175) i 48 timer etter transfeksjon og overføre supernatanten til 50 ml konisk tube. Aspirer 30 ml lentiviral supernatanten ved hjelp av en 50 ml sprøyte, gjennom et 0,22 um sprøytefilter, og delmengde den virale supernatanten i 1 ml alikvoter (dag 4).
- Bytt ut 1 ml av RPMI medium i GL261 celleplaten (24-brønn) med 1 ml av supernatanten lentiviral og inkuber ved 37 ° C i et fuktet kammer (dag 4).
- Etter 48 timer av lentiviral infeksjon, erstatte mediet med 1 ml frisk RPMI (dag 6).
- Etter 24 timer gjenta lentiviral infeksjon av GL261 celler (dag 7).
- Etter 2 nd 48 timer av lentiviral infeksjon, erstatte mediet med 1 ml frisk RPMI (dag 9).
- Fortsette å vokse luciferase modifisert GL261 celler (som skal refereres til som GL261.luc celler) og utvide cellekultur til en T-75-kolbe.
- Når GL261.luc cellekulturen når 70% konfluens i en T-75-kolbe, høste celler ved trypsinering og telle ved hemocytometer som i trinn 1.2. Plate den GL261.luc celle til en 24-brønns plate ved avgangs tetthet (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5 2,5 x 10 5 1,0 x 10 5 5,0 x 10 4, 2,5 x 10 4 celler / brønn) og Inkuber ved 37 ° C i en humidisert kammer inneholdende 95% luft og 5% CO2 i 3 timer.
- Måle luciferase celleaktivitet i forhold til luciferase modifisert U-87 MG (U87.luc) celler ved anvendelse av bioluminescens imaging (figur 1).
- Starte bildeprogramvare (klikk ikonet på skrivebordet) og initialisere bildesystem (klikk "Initial" -knappen). Initialisering vil starte automatisk og kan ta flere minutter for systemet check-up og kameraet kjøles ned til -90 ° C.
- Legg 25 ul av luciferin (D-Luciferin kaliumsalt, 150 mg / kg) i hver brønn.
- Cellene inkuberes med luciferin i 1 min ved RT og bilde på platen i 10 sek. Slik setter du opp imaging system, velg "Selvlysende", "10 sec" eksponeringstid, og "Medium" binning. Plasser 24-brønns plate på bilde stasjonen og klikk på "Acquire" -knappen for å starte bilde.
- Etter at bildet er ervervet, vil du se et bilde vindu og verktøy paLette på skjermen. Klikk "ROI (regioner av interesse) Verktøy" og velg 6 x 4 fra spalten ikonet. Lag 6 x 4 åpninger for å dekke det området av signalet på bildet av 24-brønns plate og klikker på målinger kategorien (blyantikonet). Observere et vindu med et bord av ROI målinger som enhet av fotoner per sekund per steradian per kvadrat cm (fotoner / sek / sr / cm 2).
- Bruk U87.luc celler, som på forhånd er modifisert med den samme lentivirus brukes her for GL261 modifikasjon 11, som en kontroll for å vurdere luciferaseaktivitet i transduserte GL261.luc celler.
2. In Vitro Proliferation Assay
- Når GL261 og GL261.luc cellekulturer nå 70% konfluens i en T-75-kolbe, høste begge cellelinjene ved trypsinering og teller som i trinn 1.2, og plate-celler i en 96-brønns plate ved en densitet på 1500 celler i 80 mL av RPMI medium per brønn med multikanalspipette å minimere tid og pipetteringsfeil. Seed hver cellelinje inn i 20 brønner totalt. For å begrense fordampningen i brønnene befolket av celler, fylle tomme brønner med 100 ul friskt RPMI-medium.
- Vurdere celleformering ved hjelp av en kolorimetrisk celleproliferasjonsanalyse. Her bruker vi MTS celleproliferasjonsmetoden. Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett 20 ul MTS reagens inn i hver brønn av 96-brønns plate som inneholder celler.
- Inkuber platen ved 37 ° C i et fuktet kammer inneholdende 95% luft og 5% CO2 i 3 timer. Mål absorbansen ved 490 nm ved anvendelse av en mikroplateleser. Dette gjentas på dag 1, 2, 4 og 7, etter utplating. For å normalisere absorbans-verdier, blir verdiene for hver dag dividert med de tilsvarende avlesninger som oppnås ved dag 1 (figur 2).
3. Tumor Cell Implantasjon
Merk: Autoklaver alt utstyr. Forbered kirurgiske området ved å spraye et desinfeksjonsmiddel (2% klorhexidin-oppløsning) og dekk med absorbenT gardiner. For å opprettholde sterile forhold, bruk sterile kirurgiske hansker under operasjonen, og dele den kirurgiske området i to områder av farge tape. Område 1 er merket "ren" og inneholder steriliserte forsyninger; Område 2 er merket "Dirty" og inneholder brukte materialer.
- Før dyr kirurgi, forberede en cellesuspensjon for intrakranielle injeksjon. Høste celler fra en 70% konfluent T-75 kolbe ved trypsinering og telle celler via hemocytometer som i trinn 1.2, og lage en cellesuspensjon med en densitet på 1,0 x 10 5 celler / mL i Hanks 'Balanced Salt Solution uten Ca2 + og Mg 2+ (HBSS).
- Bedøve mus med intraperitoneal injeksjon av 200 pl blanding inneholdende 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin i 0,9% saltvann. For å bekrefte riktig anesthetization, klype tå av musen. Hvis musen er helt under narkose, bør musen ikke reagerer på stimulans.
- Forvalte 0,1 mg / kg buprenorfin via subkutan injeksjon for å lindre postoperativ smerte.
- Barbere toppen av hodet av dyrene ved hjelp clippers og rent med en bomulls-tip applikator dyppet i 2% klorheksidin løsning. Påfør øye salve for å opprettholde tilstrekkelig smøring under operasjonen.
- Lag en sagittal snitt ca 1 cm lang over parieto-nakkeknøl med en steril skalpell. For å visualisere bregma, tørker overflaten av hodeskallen med en bomulls-tip applikator dynket i en 3% hydrogen peroxide løsning.
- Bor skallen med en steril 25-G nål for å lage et lite hull 3 mm til høyre for bregma, og like bak den koronale sutur.
- For å sikre at intrakranial injeksjonssted er til en dybde på 3 mm fra skallen, kuttet 3 mm utenfor den spisse enden av et 20 mL pipettespissen ved hjelp av en saks, og sette inn en sprøyte inn i pipettespissen.
- Stikk sprøytevinkelrett på hullet tidligere opprettet, og sakte injisere tumorcelle suspensjon som inneholder 3,0 x 10 5 celler i 3 mL HBSS, over en 1 min periode. La nålen på plass i et minutt, og deretter sakte trekker ut nålen.
- Vattpinne skallen med bomullsspiss applikator dyppet i 3% -ig hydrogenperoksyd, og 2% klorheksidin-løsning. Tørk overflaten av skallen med bomull-tip applikator. Skjær ut steril bein voks ca 3mm 3 i størrelse og feste bein voks på slutten siden av bomull-tip applikator. Påfør beinet voks for å dekke hullet med bomull-tip applikator.
- Tegn på hver side av hodebunnen sammen over kraniet ved hjelp av pinsett, og stift for å lukke såret. Rens såret med en bomulls-tip dyppet i 2% klorheksidin løsning.
- Overvåke alle musene postoperativt til de blir ambulant og beholde normal aktivitet. Vanligvis er restitusjonstid omtrent 30 min. Ikke returnere musene til buret med andre dyr før de har fullt restituert fra anestesi.
- Spray en generøs mengde desinfeksjonsmiddel (0,05% -dimetylammoniumklorid løsning) på et rent papirhåndkle. Bruk desinfeksjonsmiddel-gjennomvåt papir håndkle til å tørke grundig svart ark, nese kjegler og skillevegg inne i avbildningskammeret hvor dyrene kommer i kontakt med enheten. Tørk grundig av alle overflater med en ren, tørr tørkepapir. Gjenta dette en gang til og vente 5 min.
- Initialbildestasjonen som i trinn 1.14.1.
- Bedøve musen med en 300 pl blanding inneholdende 200 ul av Ketamin / Xylazin og 100 ul av luciferin (D-Luciferin kaliumsalt, 150 mg / kg) ved intraperitoneal injeksjon.
- Vent 10 minutter etter injeksjon og bekrefte om musene er helt under anestesi ved å knipe halen. Slik setter du opp imaging system, velg "Selvlysende", "Auto" eksponeringstid, og "Medium" binning. Plasser mus på bilde statipå og klikk på "Acquire" -knappen for å starte bilde. Sørg for at tiden etter injeksjon er i samsvar med hver avbildning sesjon.
- Etter at bildet er ervervet, bør et bilde vindu og verktøypaletten. Klikk "ROI Verktøy" og velg "auto" fra ikonet sirkel. Å definere ROIs, omringe området signal på bildet, og deretter ta målinger av avkastningen som enhet av fotoner / sek / SR / cm 2.
- Ta musene ut av bildekammeret og overvåke mus før de blir ambulant og beholde normal aktivitet. Typisk utvinning tid er ca 15 min. Ikke returnere musene til buret med andre dyr før de har fullt restituert fra anestesi.
- Overvåk tumorvekst ved bioluminescens avbildning to ganger i uken inntil dyrene presentere følgende symptomer: vekttap (tap av mer enn 20% i forhold til vekten før implantering), appetittmangel (komplett anorexia i 24 timer), og mangel på vedvarende purposeful respons til skånsom stimuli (svak forsøk på å få opp), ved hvilket tidspunkt de skal avlives. Avlive dyr med disse symptomene ved hjelp av en CO 2 kammer etterfulgt av halsdislokasjon.
- Plasser mus inn i eutanasi kammeret (skal ikke overbefolket kammeret) og tilsig komprimert CO 2 for 5-6 min. Observere at alle dyr er bevisstløshet og ikke puste etter ca 5 min.
- Ta musene ut av kammeret. Sørg for at hjertet ikke slår av følelsen i brystet mellom tommelen og pekefingeren, og sjekk at det ikke er blunkerefleksen.
- Dempe mus i en utsatt stilling på en flat overflate og gripe baksiden av halsen ved bunnen av skallen med én hånd og basen av halen med tommelen og pekefingeren på den andre hånden.
- Beherske hodet og raskt trekke halen bakover. Sørg for at skallen er separert fra den første halsvirvelen ved hjelp av tommelen og pekefingeren.
- NormAlize luminescens verdier for hver dag mot tilsvarende avlesninger som oppnås ved den første dag av biolumine avbildning som i trinn 2.3 (figur 3A).
- For statistisk analyse, generere overlevelseskurver ved hjelp av Kaplan-Meier estimatoren 12 og sammenligne forskjellene mellom overlevelseskurver med en log-rank test 13.
Representative Results
GL261 celler ble infisert med luciferase som inneholder lentivirus som beskrevet ovenfor i trinn 1. In vitro bioluminescens avbildning viser robust luciferase uttrykk lignende nivåer i den positive kontrollen U87.luc human glioblastoma cellelinje (figur 1). Som forventet, uinfiserte GL261 celler demonstrere ingen bakgrunn luciferase uttrykk. Dette trinnet er enkel, men viktig å utføre før videre studier ved hjelp av den infiserte cellelinje for å bekrefte stabil luciferase uttrykk.
Luciferaseekspresjon etter intrakraniell implantasjon.
Før implantasjon intrakranial, demonstrerte vi ingen forskjell in vitro vekst av GL261.luc forhold til GL261 celler (figur 2). For intrakranialt vekst og overlevelse analyse ble celler injisert inn i brains av C57BL / 6 mus som per protokoll trinn 3. tumorvekst hos mus med GL261.luc svulster ble serie analysert for Bioluminescens avbildning ved hjelp protokollen trinn 4 og demonstrert påvisbar tumorvekst (figur 3A). Mus med GL261.luc svulster raskt og konsekvent ble døende og ble avlivet. Viktigere er det ingen forskjell i total overlevelse mellom GL261.luc og GL261 tumorbærende dyr (figur 3B). In vivo Bioluminescens bildebehandling kan derfor brukes til å overvåke respons på eksperimentelle glioblastom behandlinger. Rapid pålitelig tumorvekst og kort samlet overlevelse kan gi store mengder data i en relativt kort tidsperiode.
Figur 1. Luciferase-aktivitet i GL261.luc celler. U87.luc, GL261.luc og GL261 (negativ kontroll) celler ble sådd ut med en tetthet på1.0 x 10 6, 5,0 x 10 5 2,5 x 10 5 1,0 x 10 5 5,0 x 10 til 4, og 2,5 x 10 4 celler / brønn fra venstre mot høyre. Luminescens (foton / sek / sr / cm 2) ble målt ved lumina bildebehandling stasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Luciferase uttrykk ikke påvirker GL261 celleproliferasjon. GL261.luc celler ikke forårsake Forskjellen i proliferasjon som demonstrert ved MTS-celleproliferasjonsanalyse. Grafen viser gangers økning i forhold til dag 1, som bestemt ved å sammenligne den gjennomsnittlige absorbans verdi (gjennomsnitt ± SEM) ved thespecified tidspunkt til gjennomsnittsverdien på dag 1 (uparet t-test verdier for sammenligningermellom hver cellelinje: P = 0,7796) 14. Feilfelt representerer gjennomsnittsverdiene (gjennomsnitt ± SEM) fra kvadruplikeres prøver på hver dag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Luciferase uttrykk dose ikke innvirkning på in vivo-tumorvekst og overlevelse dyr. (A) Bioluminesens overvåking viser progressive veksten av intrakranielle GL261.luc svulst i C57BL / 6 mus. (B) Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viser ingen forskjell i total overlevelse for mus implantert intracranially med enten GL261 (heltrukket linje) eller GL261.luc celler (stiplet linje).Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
GL261 murine gliomceller når implantert intracranially inn i syngeniske immunkompetente C57BL / 6-mus, gir flere fordeler sammenlignet med humane glioma xenotransplantat dyremodeller. Mange av xenopodet svulster vokse som innkapslede lesjoner som ikke nøyaktig rekapitulere invasiv sykdom hos mennesker. I motsetning til dette, GL261 tumor viser ikke bare invasjonen i tilstøtende hjernen, men også neovaskularisering, mitotiske figurer, og dyp nekrose 7. Viktigst når studere tumor immunologi eller immunterapeutiske strategier 15, 16, C57BL / 6 mus beholder et intakt immunsystem 8. Tidligere studier har vist sterk ekspresjon av det immunosuppressive cytokinet TGF-β og intrakranielle tumorer inneholder immunosuppressive T-regulatoriske celler som ligner på human glioblastoma 9, 10.
Den enkle teknikken beskrevet her gir mulighet for stabil uttrykk for luciferase av GL261 celler. Vi har nylig rapportert similar in vitro og in vivo vekst av GL261.luc celler sammenlignet med celler GL261, i tillegg til tilsvarende tumor histologiske karakteristika og immunceller infiltrere 17. GL261.luc celler som stabilt uttrykker luciferase som katalyserer oksidering av substratet luciferin omdanne kjemisk energi til fotoner og derfor påvisbar lys. Luciferin trygt kan administreres til dyr og krysser blod-hjernebarrieren etter intraperitoneal eller intravenøs injeksjon. I små forsøksdyr så som mus, kan Bioluminescens påvises utad i en ikke-invasiv måte 11. Derfor kan tumorvekst bli serielt vurderes uten behov for dyreoffer eller kostbare MR eller CT-avbildning.
De kritiske trinnene i protokollen omfatter ikke bare den lentiviral transduksjon, men også kontroll av stabil ekspresjon av luciferase in vitro før begynnelsen noen in vivo-forsøk. Tap av transduksjon kan Kravre gjenta lentivirusinfeksjon. Innføring av en antibiotisk resistens-gen i ekspresjonsvektoren kan også brukes til å selektere for luciferase ekspresjon. Grundig teknikk er nødvendig for intrakraniell implantasjon til reproduserbart å plassere et konsistent antall celler i en presis anatomiske stedet for å tillate sammenligning av forskjellige behandlingsgrupper. En viktig forskjell mellom denne studien og tidligere studier av luciferase celler som uttrykker GL261 er bruken av en fri hånd teknikk for implantering av celler sammenlignet med anvendelsen av en stereotaktisk ramme 18. Vi har tidligere vist konsistente implantasjon resultater med den frie hånden teknikk 19. Fordelen med den frie hånd teknikk er muligheten til å utføre høy gjennomstrømning analyser av forskjellige behandlingsmidler. I våre hender, kan vi implantere ca 60 dyr i en time.
Etter å mestre teknikken, de fremtidige anvendelser av teknikken er ubegrensede. Som GL261 demonstrates forhøyede mitoser og rask tumorvekst lik menneskets glioblastom, kan anti-proliferative behandlinger vurderes. På samme måte kan anti-invasive og antiangiogene terapi brukes som GL261 svulster er invasiv og angiogent. Forsiktighet bør da vurdere effekten av kjemoterapeutika rettet mot menneskelige mål brukes. Sammenlignet med tidligere studier benyttet humane glioblastom xenografter uttrykker luciferase 20, vil dette anses som en begrensning av vår modell. Dessuten kan virkningen av immunterapeutiske strategier for tumorvekst bli studert i GL261 xenografted modell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
| Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| 24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
| 96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
| Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
| 28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
| 2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
| Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
| 25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
| Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
| Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
| Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
| Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
| PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
| Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
| Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
| Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
| Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |
References
- Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
- Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
- Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
- Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
- Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
- Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
- Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
- El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
- Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207 (1972).
- Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. Statistical Methods in Medical Research. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).
- Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
- Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
- Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403 (2011).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).
