Protocol
Alla förfaranden som beskrivs nedan har granskats och godkänts av Institutional Animal Användning och skötsel kommittén vid Northwestern University och har utförts i enlighet med steriliserade förhållanden.
1. Modifiering av GL261 celler med eldflugeluciferas uttrycker Reporter
OBS: HIV-1-baserade lentivirala vektorer uttrycker eldflugeluciferas (Fluc) under kontroll av mjälte fokusbildande virus (SFFV) promotor. Den optiska reportergen har klonats in vektorplasmiden pHRSIN-CSGW-dlNotI.
- Bibehåll 293-T-celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och GL261 celler i RPMI-medium kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin vid 37 ° C i en fuktig atmosfär innehållande 95 % luft och 5% koldioxid (CO 2).
- När 293-T-cell kulturen når 80% konfluens i en T-75-kolv, tvätta cellerna en gång med phosphate buffertlösning (PBS) utan Ca2 + och Mg2 +, inkubera cellerna med 3 ml trypsin (0,05%) vid 37 ° C under 5 minuter, triturera med en 5 ml pipett genom att hålla kolven något lutande och samla in alla celler från botten av kolven. Överför 3 ml trypsinbehandlas cellsuspensionen i en 15 ml koniska rör och tillsätt 7 ml av kött RPMI-medium (totalt 10 ml av cellsuspensionen).
- Blanda cellsuspensionen väl med en 5 ml pipett. Ta 100 pl av cellsuspensionen från röret och räkna antalet cellerna med användning hemocytometer. För att göra detta, blanda 100 | il av cellsuspensionen med 300 ul av lösning av trypanblått och sätt i 2 pl av blandningen i en hemocytometer. Räkna antalet celler utan blåfärgning från fyra separata vyer under ett mikroskop. Genomsnitt cellantalet från varje vy, eftersom detta nummer representerar 10 4 celler / ml.
- Samtidigt centrifugera röret innehållande cellsuspensionen vid 300 xg under 7 min. Aspirera media och resuspendera cellpelletar med färskt RPMI-medium för att göra en GL261 cellsuspension vid densitet av 1,0 x 10 6 / ml. Seed 2,5 x 10 6 GL261 celler med 2,5 ml RPMI-medium i en T-175-kolv med 27,5 ml DMEM (dag 1).
- Efter 24 timmar, byt medium med 20 ml färsk DMEM (dag 2).
- För att framställa den lentivirusvektor, blanda 54 | il transfektionsreagens med 2 ml serumfritt DMEM under 5 minuter. Lägg 3 pg av gag-pol, 3 pg av vesikulärt stomatitvirus G-höljet (VSV-G), och 4,5 | j, g av Fluc (PSIN-Fluc) i DMEM med transfektionsreagens, och inkubera under 20 min vid RT. Släpp hela DNA-blandningen in i 293-T-kolv (T-175) och inkubera vid 37 ° C i en fuktig kammare innehållande 95% luft och 5% CO2 under 48 h (dag 2).
- Tillsätt 10 ml färsk DMEM vid 24 h efter transfektion (total volym av 293-T-cellkulturmedium bör vara ungefär 30 ml) (dag 3).
- Om du vill dela GL261 celler i en24-brunnars platta, tvätta cellerna en gång med PBS utan Ca2 + och Mg2 +, inkubera cellerna med 5 ml trypsin (0,05%) vid 37 ° C under 5 minuter, triturera med en 5 ml pipett genom att hålla kolven något lutande , samla alla celler från botten av flaskan, och räkna celler via hemocytometer som i steg 1.2. Samtidigt Centrifugera röret vid 300 xg under 7 minuter. Aspirera media och resuspendera cellpelletar med färskt RPMI-medium för att göra en GL261 cellsuspension vid densitet av 2,5 x 10 4 / ml. Seed 2,5 x 10 4 GL261 celler med 1 ml RPMI-medium i en 24-brunnar (dag 3).
- Samla 30 ml av den lentivirala supernatanten med 10 ml pipett från 293-T-kolv (T-175) vid 48 h efter transfektion och överför supernatanten till 50 ml koniska rör. Aspirera 30 ml lentivirala supernatanten via en 50 ml spruta, genom ett 0,22 fim sprutfilter, och delprov den virala supernatanten i 1 ml alikvoter (dag 4).
- Byt ut 1 ml RPMI-medium i GL261 cellplattan (24 brunnar) med 1 ml av den lentivirala supematanten och inkubera vid 37 ° C i en fuktig kammare (dag 4).
- Efter 48 timmar av Lentiviral infektion, byt medium med 1 ml färsk RPMI (dag 6).
- Efter 24 timmar, upprepa lentiviral infektion av GL261 cellerna (dag 7).
- Efter 2: a 48 timmar av Lentiviral infektion, byt medium med 1 ml färsk RPMI (dag 9).
- Fortsätta att växa luciferas modifierade GL261-celler (som skall kallas GL261.luc celler) och expandera cellkultur till en T-75 kolv.
- När GL261.luc cellodling når 70% konfluens i en T-75-kolv, skörda cellerna genom trypsinisering och räkna genom hemocytometer såsom i steg 1,2. Plate den GL261.luc cell till en 24-brunnars platta vid examen densiteter (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, 2,5 x 10 4 celler / brunn) och inkubera vid 37 ° C i en humidierad kammare innehållande 95% luft och 5% CO2 under 3 timmar.
- Mät cell luciferasaktivitet relativt luciferas modifierade U-87 MG (U87.luc) celler med användning av bioluminiscens imaging (Figur 1).
- Starta bildbehandlingsprogram (klicka på ikonen på skrivbordet) och initiera avbildningssystemet (klicka på "Initiera" knappen). Initieringen startar automatiskt och kan ta flera minuter för systemet check-up och kameran svalna till -90 ° C.
- Tillsätt 25 | il luciferin (D-luciferin kaliumsalt, 150 mg / kg) i varje brunn.
- Inkubera cellerna med luciferin under 1 min vid RT och image plattan i 10 sek. För att ställa in bildsystemet, välj "Självlysande", "10 sec" exponeringstiden, och "Medium" binning. Placera 24-brunnar på bildstationen och klicka på "Hämta" knappen för att starta bilden.
- När bilden är framgångsrikt förvärvat, kommer du att se ett bildfönster och verktygs palette på skärmen. Klicka på "ROI (regioner av intresse) Verktyg" och välj 6 x 4 från ikonen slitsen. Skapa 6 x 4 slitsar för att täcka området signalen på bilden av 24-brunnar och klicka på fliken mätningar (pennikonen). Beakta ett fönster med en tabell över ROI-mätningar som enhet fotoner per sekund per steradian per cm (fotoner / sek / sr / cm 2).
- Använd U87.luc celler, som tidigare modifierats med samma lentivirus används här för GL261 modifiering 11, som en kontroll för att bedöma luciferasaktivitet i transducerade GL261.luc celler.
2. In vitro proliferationsanalys
- När GL261 och GL261.luc cellkulturer når 70% konfluens i en T-75-kolv, skörda båda cellinjerna genom trypsinisering och räknas som i steg 1,2 och platt celler till en 96-brunnsplatta vid en densitet av 1500 celler i 80 il RPMI-medium per brunn med en flerkanalig pipett för att minimera tiden och pipettering fel. Seed varje cellinje i 20 brunnar totalt. För att begränsa avdunstning i brunnarna befolkade av celler, fylla tomma brunnar med 100 ul färskt RPMI-medium.
- Utvärdera cellulär proliferation med hjälp av en kolorimetrisk cellprolifereringsanalys. Här använder vi MTS cellprolifereringsanalys. Med användning av en multikanalpipett, tillsätt 20 pl MTS reagens i varje brunn i 96-brunnsplatta som innehåller celler.
- Inkubera plattan vid 37 ° C i en fuktig kammare innehållande 95% luft och 5% CO2 under 3 timmar. Mät absorbansen vid 490 nm med användning av en mikroplattläsare. Detta upprepas på dag 1, 2, 4 och 7, efter plätering. För att normalisera absorbansvärden värdena för varje dag dividerat med motsvarande värden som erhålls vid dag 1 (Figur 2).
3. Tumör cellimplantation
Obs: Autoklav all utrustning. Förbered operationsområdet genom att spraya ett desinfektionsmedel (2% klorhexidin lösning) och täck med absorbent draperier. För att upprätthålla sterila betingelser, bära sterila kirurgiska handskar under operation, och delar upp operationsområdet i två områden genom färg tejp. Område 1 är märkt "Clean" och innehåller steriliserade leveranser; Område 2 är märkt "Dirty" och innehåller använt material.
- Före djur kirurgi, förbereda en cellsuspension för intrakraniell injektion. Harvest celler från en 70% konfluent T-75-kolv genom trypsinisering och räkna celler via hemocytometer som i steg 1,2 och göra en cellsuspension med en täthet av 1,0 x 10 5 celler / | al i Hanks balanserade saltlösning utan Ca2 + och Mg2 + (HBSS).
- Söva möss med intraperitoneal injektion av 200 | j, l blandning innehållande 100 mg / kg av ketamin och 10 mg / kg xylazin i 0,9% saltlösning. För att bekräfta korrekt anesthetization, nypa tån på musen. Om musen är helt under narkos ska musen inte svarar på stimulus.
- Administrera 0,1 mig / kg buprenorfin via subkutan injektion för att lindra postoperativ smärta.
- Raka toppen av huvudet av djuren med hjälp av Clippers och ren med en bomullspinne applikator doppad i 2% klorhexidin lösning. Applicera ögonsalva att upprätthålla tillräcklig smörjning under operationen.
- Gör en sagittal snitt ca 1 cm lång över parieto-occipital ben med en steril skalpell. Att visualisera bregma, torka av ytan av skallen med en bomullspinne applikator indränkt i en 3% väteperoxid lösning.
- Borra skallen med en steril 25-G-nål för att göra ett litet hål 3 mm till höger om bregma och precis bakom den koronala sutur.
- För att säkerställa att intrakraniell injektionsställe är till ett djup av 3 mm från skallen, skär 3 mm från den spetsiga änden av en 20 mikroliter pipettspets med sax och för in en spruta in i pipettspetsen.
- Sätt sprutan vinkelrätt mot hålet tidigare skapade, och långsamt injicera tumörcellen suspension innehållande 3,0 x 10 5 celler i 3 il HBSS, över en 1-minutersperiod. Låt nålen på plats för ytterligare en minut, och sedan sakta dra ut nålen.
- Tvätta av skallen med bomullsspets applikator doppad i 3% väteperoxid och klorhexidin lösningen 2%. Torka ytan av skallen med bomulls-tip applikator. Klipp ut den sterila benvax ca 3 mm 3 i storlek och fästa benet vax på ändsidan av bomull-tip applikator. Applicera benvax att täcka hål med bomull spets applikator.
- Rita varje sida av hårbotten tillsammans över skallen med hjälp av pincett, och häfta att stänga såret. Rengöra såret med bomullsspets doppad i 2% klorhexidin lösning.
- Övervaka alla möss postoperativt tills de blir ambulerande och behålla normal aktivitet. Normalt är återhämtningstiden ca 30 min. Skicka inte tillbaka mössen till buren med andra djur tills de har återhämtat sig helt från anestesi.
- Spraya en generös mängd desinfektionsmedel (0,05% dimetyl-ammoniumklorid) på en ren pappershandduk. Använd desinfektionsmedel indränkta pappershandduk för att noggrant torka av svarta blad, noskoner och avdelare inuti avbildning kammaren där djuren kommer att vara i kontakt med enheten. Noggrant torka alla ytor med en ren, torr pappersduk. Upprepa detta en gång och vänta 5 min.
- Initiera avbildningsstationen som i steg 1.14.1.
- Söva musen med en 300 | j, l blandning innehållande 200 pl ketamin / xylazin och 100 pl av luciferin (D-luciferin kaliumsalt, 150 mg / kg) genom intraperitoneal injektion.
- Vänta 10 minuter efter injektionen och bekräfta om mössen är helt under anestesi genom att nypa i svansen. För att ställa in bildsystemet, välj "Självlysande", "Auto" exponeringstiden, och "Medium" binning. Placera möss på bild statipå och klicka på "Hämta" knappen för att starta bilden. Säkerställa att tiden efter injektion är i överensstämmelse med varje bildsession.
- När bilden är framgångsrikt förvärvat, bör ett bildfönster och verktygspaletten visas. Klicka på "ROI Tools" och välj "auto" från ikonen cirkeln. För att definiera ROI, omger området signalen på bilden, och sedan ta mätningar av ROI som enhet fotoner / sek / SR / cm2.
- Ta mössen ur avbildning kammaren och övervaka mössen tills de blir ambulerande och behålla normal aktivitet. Typiskt återhämtningstid är ca 15 min. Skicka inte tillbaka mössen till buren med andra djur tills de har återhämtat sig helt från anestesi.
- Övervaka tumörtillväxt genom mareld avbildning två gånger i veckan tills djur presentera följande symtom: viktnedgång (förlust på mer än 20% i förhållande till vikten före implantation), aptitlöshet (komplett anorexi under 24 timmar), och brist på ihållande purposeful svar på mild stimuli (svag försök att få upp), vid vilken tidpunkt de ska avlivas. Avliva djur med dessa symtom med hjälp av en CO 2 kammare följt av halsdislokation.
- Placera möss in i dödshjälp kammaren (inte överfulla kammaren) och inflöde komprimerad CO2 under 5-6 minuter. Observera att alla djur är medvetslöshet och inte andas efter ca 5 min.
- Ta mössen ut ur kammaren. Se till att hjärtat inte slår genom att känna på bröstet mellan tummen och pekfingret och kontrollera att det inte finns någon blinkreflexen.
- Hindra musen i liggande ställning på en plan yta och ta tag i baksidan av halsen vid basen av skallen med en hand och basen av svansen med tummen och pekfinger på den andra handen.
- Hindra huvudet och snabbt dra svansen bakåt. Se till att skallen är separerad från den första halskotan med tummen och pekfingret.
- NormAlize luminiscens värden för varje dag mot motsvarande värden som erhålls vid den första dagen av mareld avbildning som i steg 2,3 (figur 3A).
- För statistisk analys, generera överlevnadskurvorna med hjälp av Kaplan-Meier estimatorn 12 och jämföra skillnaderna mellan överlevnadskurvorna med hjälp av en log-rank test 13.
Representative Results
GL261-celler infekterades med luciferas innehållande lentivirus såsom beskrivits ovan i steg 1. In vitro-bioluminescens avbildning visar robusta luciferas uttryck liknande nivåer i den positiva kontrollen U87.luc human glioblastom-cellinje (figur 1). Som väntat, oinfekterade GL261 celler visar ingen bakgrunds luciferasuttryck. Detta steg är enkel men avgörande för att utföra innan ytterligare studier med den infekterade cellen linjen för att bekräfta stabilt luciferasuttryck.
Luciferasuttryck efter intrakraniell implantering.
Innan intrakraniell implantering visade vi ingen skillnad i in vitro tillväxt på GL261.luc jämfört med GL261 celler (Figur 2). För intrakraniell tillväxt och överlevnad analys, celler injiceras i brains av C57BL / 6-möss som per protokoll steg 3. Tumörtillväxt i möss med GL261.luc tumörer serie analyserades med avseende mareld avbildning med protokoll steg 4 och visade detekterbar tumörtillväxt (figur 3A). Möss som bär GL261.luc tumörer snabbt och konsekvent blev döende och avlivades. Viktigt, är det ingen skillnad i total överlevnad mellan GL261.luc och GL261 tumörbärande djur (Figur 3B). In vivo mareld avbildning kan därför användas för att övervaka svar på experimentella glioblastom behandlingar. Snabb tillförlitlig tumörtillväxt och kort överlevnad kan ge stora mängder data i en relativt kort tid.
Figur 1. Luciferasaktivitet i GL261.luc celler. U87.luc, GL261.luc och GL261 (negativ kontroll) -celler ströks vid densiteter1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, och 2,5 x 10 4 celler / brunn från vänster till höger. Luminiscens (fotoner / sek / sr / cm2) mättes med lumina bildbehandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. luciferasuttryck påverkar inte GL261 cellproliferation. GL261.luc celler inte orsakar en skillnad i spridning, vilket framgår av MTS cellprolifereringsanalys. Diagrammet visar faldig ökning, jämfört med dag 1, enligt bestämning genom jämförelse av medelvärdet absorbansvärdet (medelvärde ± SEM) vid thespecified tidpunkt till medelvärdet vid dag 1 (oparade t-test-värden för jämförelsermellan varje cellinje: P = 0,7796) 14. Felstaplar representerar medelvärden (medelvärde ± SEM) från fyrfaldiga prover på varje dag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. luciferasuttryck dosen inte påverka på in vivo tumörtillväxt och djuröverlevnad. (A) Bioluminescence övervakning visar progressiv tillväxt av intrakraniell GL261.luc tumör i C57BL / 6-möss. (B) Kaplan-Meier överlevnadsanalys visar ingen skillnad i total överlevnad för möss implanterade intrakranialt med antingen GL261 (heldragen linje) eller GL261.luc celler (streckad linje).Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
GL261 murina gliomceller, när de implanteras intrakraniellt i syngena immunokompetenta C57BL / 6-möss, erbjuder flera fördelar jämfört med gliom xenograft djurmodeller för mänskliga. Många av xenotransplanterat tumörer växa som inkapslade lesioner som inte exakt rekapitulera det invasiva mänskliga sjukdomen. Däremot GL261 tumör visar inte bara invasion i angränsande hjärnan, men även kärlnybildning, mitotiska siffror och djup nekros 7. Viktigast när man studerar tumörimmunologi eller immunoterapeutiska strategier 15, 16, C57BL / 6 mus behåller ett intakt immunsystem 8. Tidigare studier har visat robust uttryck av det immunsuppressiva cytokinet TGF-β och intrakraniella tumörer innehåller immunosuppressiva T-regulatoriska celler liknande humana glioblastom 9, 10.
Den enkla teknik som beskrivs här möjliggör stabil expression av luciferas från GL261 celler. Vi har nyligen rapporterat simiLAR in vitro och in vivo-tillväxten av GL261.luc celler jämfört med GL261 celler, förutom liknande tumör histologiska egenskaper och immuncell infiltrera 17. GL261.luc celler stabilt uttrycka luciferas som katalyserar oxidationen av substratet luciferin omvandlar kemisk energi till fotoner och därför detekterbart ljus. Luciferin kan administreras säkert till djur och korsar blod-hjärnbarriären efter intraperitoneal eller intravenös injektion. I små forskningsdjur, såsom möss, kan den bioluminescens detekteras externt på ett icke-invasivt sätt 11. Därför kan tumörtillväxt seriellt bedömas utan behov av djuroffer eller kostsamma MRI eller CT.
De kritiska stegen i protokollet innebär inte bara lentiviral transduktion, men också kontroll av stabilt uttryck av luciferas in vitro innan några in vivo-försök. Förlust av transduktion kan behöver utförasre upprepa lentivirus infektion. Införande av en antibiotikaresistensgen i expressionsvektorn kan också användas för att selektera för luciferasuttryck. Noggrann teknik krävs för intrakraniell implantation att reproducerbart placera en konsekvent antalet celler i en exakt anatomisk plats för att möjliggöra jämförelser av olika behandlingsgrupper. En stor skillnad mellan den aktuella studien och tidigare studier av luciferas som uttrycker GL261 celler är användningen av fria händer teknik för att implantera celler jämfört med användning av en stereotaktisk ram 18. Vi har tidigare visat konsekventa implantation resultat med den fria handen tekniken 19. Fördelen med den fria handen teknik är förmågan att utföra med hög kapacitet analyser av olika behandlingsmedel. I våra händer, kan vi implantera cirka 60 djur i en timme.
Efter att behärska tekniken, de framtida tillämpningar av tekniken är obegränsade. Som GL261 demonstratörerrar förhöjda mitoser och snabb tumörtillväxt liknar mänsklig glioblastom, kan antiproliferativa behandlingar utvärderas. På liknande sätt kan anti-invasiva och antiangiogena terapier användas som GL261 tumörer är invasiva och angiogen. Försiktighet bör iakttas vid bedömningen av effekten av kemoterapeutiska medel som syftar till att mänskliga mål. Jämfört med tidigare studier där man använt humana glioblastom xenografter uttrycker luciferas 20, skulle detta betraktas som en begränsning av vår modell. Dessutom kan studerade effekten av immunterapeutiska strategier för tumörtillväxt i GL261 xenotransplanterat modellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
| Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| 24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
| 96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
| Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
| 28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
| 2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
| Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
| 25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
| Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
| Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
| Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
| Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
| PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
| Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
| Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
| Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
| Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |
References
- Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
- Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
- Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
- Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
- Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
- Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
- Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
- El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
- Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207 (1972).
- Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. Statistical Methods in Medical Research. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).
- Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
- Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
- Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403 (2011).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).
