Abstract
Manipulasjon og kultur av tidlige mus embryoer er en kraftig men stort sett lite benyttet teknologi å øke verdien av denne modellen system. Motsatt har cellekultur vært mye brukt i utviklingsbiologi studier. Imidlertid er det viktig å bestemme om in vitro-dyrkede celler virkelig representerer in vivo-celletyper. Å pode cellene i embryoer, etterfulgt av en vurdering av deres bidrag under utvikling er en nyttig metode for å bestemme den potensielle av in vitro dyrkede celler. I denne studien, beskriver vi en fremgangsmåte for å pode cellene i et definert område av tidlig fostertap mus embryo, etterfulgt av ex vivo kultur. Vi introduserer også en optimalisert elektroporering metode som benytter glasskapillærer med kjent diameter, slik at nøyaktig lokalisering og justering av antall celler som får eksogent DNA med både høy transfeksjonseffektivitet og lav celledød. Disse teknikkene som ikke krever noen specialized utstyr, render eksperimentelle manipulasjoner av gastrulation og tidlig stadium organogenese-mus embryo mulig, slik at analyse av satsing i dyrkede celle subpopulasjoner, og effekten av genetiske manipulasjoner in situ på celledifferensiering.
Introduction
Cellekultur har vært mye brukt i utviklingsbiologi studier. Muse embryonale stamceller (ESCs) og epiblast stamceller (EpiSCs) kan differensiere til alle tre bakterie lag in vitro, og er en nyttig modell for celledifferensiering i tidlig pattedyr embryogenese. Avledning av disse cellelinjer har åpnet opp en mulighet for in vitro manipulasjon og detaljert undersøkelse av de lokaliserte signalanlegg hendelser og transkripsjons nettverk som opererer under tidlig embryo mønster. Imidlertid er det viktig å bestemme in vivo relevansen av noen manipulasjoner utføres i kultur. Den in vivo potensialet preimplantation embryo-avledet mus ESCs har blitt vurdert ved å introdusere dem tilbake i preimplantation embryoer (morulae eller blastocysts) 1. Imidlertid kan EpiSCs som representerer de epiblast cellene i fostertap embryoer ikke integrere effektivt i preimplantation embryoer 2,3. Vår previooss funn har vist at EpiSCs effektivt kan generere chimeras og bidra til alle bakterie lag, når podet inn fostertap embryoer 4. Således er den beste måten for å evaluere in vitro dyrkede celler for å introdusere dem til deres korresponderende omgivelsene in vivo.
Elektroporering er en mye brukt metode for å levere eksogene molekyler inn målrettede celler både in vivo og in vitro-eksperimenter. Elektrisk energi kan generere et stort antall porer i cellemembranen, noe som gjør det mulig for eksogen deoksyribonukleinsyre (DNA) eller ribonukleinsyre (RNA) for å komme inn i cellene. En av de største utfordringene for denne teknikken er å kombinere optimal celle levedyktighet med høy electrotransfection effektivitet 5,6. For elektroporering av nukleinsyrer i embryonale vev, gullbelagt elektroder har oftest vært brukt, slik målretting av celler i et bredt spekter romlig 7-9. For å oppnå en mer localized genoverføring, har en nål formet elektrode blitt benyttet for å oppnå en fokal elektrisk felt 10,11. Ved hjelp av denne metoden, forfatterne viste at etter elektroporering, hadde rundt 30 til 60 celler tatt opp DNA-konstruksjon 11. Likevel synes det som nøyaktig justering av antall elektroporerte celler forblir vanskelig med en fast bredde elektrode. Den kapillære elektroporering teknikken har blitt brukt til å levere plasmider til enkeltceller 12-14. Imidlertid har denne teknikken ikke er søkt electroporating plasmider til embryoer ex vivo. Mer nylig har en microdevice blitt rapportert til lokalt electroporate noen distal viscerale endoderm celler (mindre enn 4 celler) i tidlig fostertap museembryoer 15. Men det er fortsatt ukjent om denne enheten kan effektivt målrette ektoderm og mesoderm ex vivo.
I denne studien beskriver vi to nye metoder for å vurdere cellulære og gen-funksjon i tidlig post-implantation embryoer. Vi først demonstrere hvordan å pode in vitro dyrkede celler inn i definerte områder i tidlige mus embryoer for å vurdere deres in vivo potensial. Integrasjonen av de podet celler og deres etterkommere, alle merket med en genetisk kode (for eksempel en grønn fluorescerende protein (GFP), kan bli ytterligere undersøkt ved farging av vev spesifikke proteiner fire. Dernest beskriver vi en forbedret metode for å gi nøyaktig DNA til lokaliserte områder i fosteret via elektroporering. Snarere enn å bruke en nålformet elektrode, innsatt vi en tynn tråd inne i en tynn glasskapillar, og viser at denne modifikasjon kan levere DNA til et lite antall celler med høy virkningsgrad og begrenset celledød. Videre viser vi at ved å bruke glasskapillærer med ulike åpningsstørrelser, kan vi kontrollere antall elektroporerte celler. Derfor tror vi denne metoden kan være til stor nytte for å studere tidlig embryo mønster som involverer små tall of celler.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar britiske hjemmekontoret forskrift med som spesifisert i dyr (Scientific Procedures) Act (1986) under Prosjekt Lisensnummer 60/4435. Å samle embryoer på bestemte utviklingsstadier, ble timet parr satt opp O / N. Midt på dagen på dagen for å finne en vaginal plugg ble betegnet embryonale dag (E) 0,5.
1. dissekere E7.5 eller E8.5 fostertap Embryoet for Ex Vivo Kultur
- Ofre gravide hunnmus ved halshugging.
- Isoler livmoren ved hjelp av saks, holder det med pinsett, og plasser i en 30 mm tallerken fylt med M2 medium.
- Nøye rive fra hverandre myometriet bruker to par fine tang.
- Skrelle bort decidua, være forsiktig med å punktere extraembryonic hulrom.
- Fjern Reichert membran ved å knipe den med pinsett og sakte skille det fra embryo.
- Sjekk embryoene under en dissekerestereomikroskop for å sikre at plommesekken, amnion og ectoplacental kjegle er intakte.
- Overfør embryoene til en ren tallerken av M2 ved hjelp av en pipette og sted på en 30 mm plastpetriskål lokk på isen (den "ice plattformen ') til delvis chille embryoer.
- Om nødvendig, lagre embryoer i M2 på en is plattform for opp til 1,5 timer, f.eks., Under medie forberedelse eller manipulasjon av små grupper av ~ 3-4 embryoer ved RT.
Merk: Recovery og disseksjon av gnager embryoer har blitt beskrevet i detalj tidligere 7,8,16.
2. Forbered Embryo Kultur Medium
- Fersk tine enten kommersielt tilgjengelige rotteserum (se Glanville-Jones et al. 13 for spesifikasjoner), eller rotteserum fremstilt på huset i henhold til Copp og Cockroft 16 som ble varmeinaktivert i 30 min ved 56 ° C og frosset i 1 ml porsjoner på -80 ˚C
Merk: Kommersielt tilgjengelig rotteserum som er akseptabelt for kultur perioder med 24-36 hr, selv om serum utarbeidet i huset er, etter vår erfaring, overlegen for kultur perioder på opptil 48 timer. - Fersk forberede et overskudd (f.eks., 10 ml) av definerte kosttilskudd som består av Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 2 mM L-glutamin og en mM natrium pyruvat.
- Beregn volum av kulturmediet som er nødvendig i henhold til antall embryoer fra hvert trinn som skal dyrkes (se punkt 3). Bland rotteserum med de definerte kosttilskudd for å utgjøre 50% kulturmediet (1: 1 (v / v) rotteserum: definert bilag) og / eller 75% kulturmedium (3: 1 (v / v) rotteserum: defineres kosttilskudd).
- Bestå embryo dyrkningsmediet gjennom et 0,45 um filter og tilsett 10 000 IU / ml penicillin og 10 ug / ml streptomycin.
Merk: Fersk tint L-glutamin og natriumpyruviat løsning er avgjørende for embryo utvikling i ex vivo kultur.
- For embryoer E7.5: statisk kultur ved anvendelse av 4-brønners plater i en inkubator forsynt med 5% CO2 i luft ved 37 ° C i 24 timer. Culture opptil to embryoer pr brønn i 1 ml 50% kulturmedium.
- For embryoer E8.5: bruke en valse kulturapparat 8 som roterer med 35 omdr / min med kontinuerlig gassing med 5% CO2 i luft ved 37 ° C i 24 timer (1 ml av 50% kulturmedium pr embryo).
- For embryoer E9.5: bruke en valse kultur anordning som roterte med 35 omdr / min som omfatter gasser som følger med 5% CO2, 40% O 2 55% N2 ved 37 ° C i 24 timer (1 ml av 75% kulturmedium per embryo).
Merk: Kultur embryo innen tre timer etter euthanizing musene som lengre perioder i M2 påvirke utviklingen. Se Copp og Cockroft 16 for fremgangsmåten for ex vivo embryokultur.
4. Grafting dyrkede celler i E7.5 eller E8.5 Mouse Embryoer
- Fysisk skrape EpiSCs, som ubiquitously uttrykker GFP, fra en 6-brønn kultur plate ved hjelp av en 20-200 mL pipette tips og plassere dem i et 30 mm fatet inneholder embryoene
Merk: For å sette inn celleklumper i embryoene, bør cellene være fysisk skrotet snarere enn trypsinisert. - Fest en hånd, trakk pode kapillær til aspirator røret for å lage en munn pipette.
- Forsiktig suge munnen pipetten for å trekke en eller flere celle klumper av størrelse> 20 celler inn i pode kapillar.
- Forsiktig blåse ut cellene, til delvis spre store klumper.
- Velge en celle inneholdende klump ~ 10-20 celler og suge inn i pode kapillær igjen, holder det i nærheten av åpningen av kapillaren. Vær forsiktig med å flytte celleklump i og ut av kapillær gjentatte ganger, for å unngå brudd opp i mindre biter.
- Hold embryo løst på plass med en pinsett og sett podingkapillær inn i regionen av interesse for å lage en åpning.
- Forsiktig utvise klump ut av pode kapillær, forlater kort streng med 10-20 celler fast i embryoet.
- Gjenta pode prosedyren for ønsket antall embryoer. Bruk seriestørrelser på 3-4 embryoer for bekvemmelighet.
- Leaving embryoer i samme skål av M2 medium, image de podet embryoer ved hjelp av en fluorescens forbindelse dissekere mikroskop med kamera, holde bildebehandling tid til et minimum for å unngå eksponering av embryoene til sterkt lys og varme.
Merk: Bestem avbildnings ganger empirisk da disse vil være avhengig av spesifikasjonene for kameraet og mikroskop, så vel som naturen og fluorescensintensiteten av fluoroforen. - Overfør embryoet i en pastette med et minimalt volum av M2 medium for å pre-ekvilibrert kulturmedium (se punkt 3) umiddelbart etter avbildning.
Merk: Nøye undersøke morfologi av embryoene etter pode. Bare kultur intacT embryoer.
5. Håndlaget Electroporation Materialer og Apparatus Setup (Forbered følgende i forkant av elektroporering Experiments):
- For DNA injeksjon pipetter: trekke DNA injeksjon pipetter ved hjelp av en horisontal mikropipette avtrekker. Injeksjons pipetter bør ha en fin spiss med en åpning mindre enn 10 um for å unngå vevsskade ved injeksjon av DNA inn i embryonale hulrom.
- For glasskapillar elektroporering: bruke en microforge å skjære åpningen av DNA injeksjons pipetter til en indre diameter på enten 20 eller 30 mikrometer. For å unngå at celleskade når kapillaren er i berøring med embryoet for elektroporering, må spissen av glasskapillar skjæres rent og ikke ha skarpe kanter, brutt.
- For håndlaget kapillær elektrode (anode) (figur 1): sette inn et 0,2 mm diameter platinatråd inn i en elektroporasjon glasskapillar med en fast åpning på 20 eller 30 mikrometer i diameter til å fokusere de utvalgteric strøm og leverer plasmid DNA til et lite område av interesse i embryo.
- For håndlaget L-formet elektrode (katode) (figur 1): bøyes en 0,2 mm platinatråd diameter som skaper en "L" -form, med den horisontale del av "L" i området rundt 1 mm i lengde.
- Fest hver platina elektroden til en tynn isolert ledning og sette det inn i en mikroinjeksjon nåleholder dekket av isolasjonstape.
- Monter nål holdere på standard micromanipulation instrumentholdere.
- Kople kretsen som vist i figur 1: koble kapillær elektrode til anoden av strømforsyningen; koble L-formet elektrode til anoden av multimeter; koble katoden i mulimeter til katoden av strømforsyningen.
6. Electroporation E7.5 eller E8.5 Mouse Embryoer
- Fyll elektroporering glasskapillar med PBS til innen 1-2 mm fra toppen og sett StraiGHT platina elektrode (anode) i glasskapillar inntil den når bunnen av kapillaren.
- Forankre den L-formede elektrode (katode) på overflaten av en 30 mm petriskål fylt med PBS.
- Overfør embryo fra M2 medium inn i PBS-fylt elektroporering parabolen.
- Stikk kanylen fra side epiblast inn i amnionhule av embryoet. Ved hjelp av en pneumatisk pico pumpe, injisere DNA-løsning (pCAG-Cre: GFP eller pCAG-GFP 1-1,5 mikrogram / ml med 0,01% grønn konditorfarge fargestoff) i hulrommet til den er helt full. For E7.5-E8.5 embryoer, er mindre enn 5 pl DNA løsning som kreves for ett embryo. Bruk det grønne fargestoffet som en indikator, være forsiktig for ikke å sprekke embryo.
- Posisjonere nøye embryoet mellom elektrodene og flytte kapillær elektroden til den nøyaktige posisjon hvor DNA-er som skal leveres.
Merk: Orienteringen av embryoet, avhenger av det område hvor DNA-er som skal elektroporert. - Electroporangere embryoet ved hjelp av 200 volt (V) i 6 pulser, hver på 50 ms varighet med en 1 sekund intervall mellom hver puls.
- Overfør embryo til pre-ekvilibrert kulturmedium umiddelbart etter elektroporering. Om ønsket, gjentas prosessen for neste embryo.
Merk: Legg kulturmediet i en steril beholder og legg den i kulturinkubatoren til pre-likevekt mediet. - For å oppdage elektroporerte celler 2 timer etter kultur, overføre embryoene til et rent 30 mm petriskål av M2 medium med en pastette. Bilde embryoene som i trinn 5.9 bruker en fluorescens forbindelse dissekere mikroskop.
- Overfør embryoene tilbake til kultur ved hjelp av en pastette umiddelbart etter bildebehandling.
- For å detektere døde celler forårsaket ved elektroporering, beis embryoene med en vidt røde cellemembran-ugjennomtrengelig atom fargestoff (1: 200 i embryodyrkningsmedium) ved 37 ° C i 10 minutter, 2 timer etter elektroporering (Valgfritt)
- Å telle elektroporerte celler, reparere Embryos i 4% paraformaldehyde (PFA) for 2-4 timer ved 4 ˚C, flekke kjernen med en ultrafiolett eller langt-rød fluorescerende atom counterstain og bilde embryoene som bruker et konfokal mikroskop (valgfritt).
Merk: Embryonic vekst påvirkes negativt hvis igjen for lenge i PBS. Derfor sørge for at tiden det tar å electroporate hver embryo er minimert (<5 min per embryo).
Representative Results
Negl
EpiSCs at ubiquitously uttrykker EGFP (R04-GFP, avledet fra E6.5 epiblast, og C2, stammer in vitro fra mESCs) 4 ble manuelt skrapt fra kulturen fatet og podet inn i ulike områder av E7.5 embryoer (Figur 2A). Embryoene ble dyrket ex vivo og analysert etter 24 timer. Fordelingen av donorcellene ble bestemt ved fluorescens mikroskopi. Dersom donorceller innarbeidet, de prolifererte og deres derivater dispergert inne i verts embryoer (figur 2B). Det har blitt observert at transplantater inneholdende 10-16 celler inkorporert effektivt i verts embryoer (figur 2A og 2B), derimot, pode flere celler ikke resulterer i bedre chimaerism. I stedet podet celler produseres uinkorporerte klumper (Figur 2C og 2D).
Electroporation
Til enssess effektiviteten i vår elektroporering system, vi leverte GFP-uttrykke plasmider (pCAG-GFP og pCAG-Grobunn: GFP) til bestemte områder i embryoet. I samsvar med en tidligere studie 11, ble GFP + celler påvises i embryoer 1-2 timer etter elektroporering (Figur 2E og 2G). Når distale epiblast celler på slutten primitive streak scenen embryo ble elektroporert, merkede celler bidratt til den nevrale ektoderm etter 24 timer i kultur (Figur 2E og 2F). Dette resultatet samsvarer godt med kjente fate kart epiblast celler i gastrulation scene embryoer 17. Tilsvarende, når den GFP ekspresjonsplasmidet ble elektroporert i primitive strek ved E8.5 (2-5 somites), GFP + -celler bidratt til den paraksiale mesoderm (figur 2G og 2H), i samsvar med kjente skjebne kart over sen primitive strek 18 . Videre har vi observert bidrag til alle tre bakterie lag fra elektroporerte celler (figur 2I-K),som tyder på at elektroporering prosedyren ikke kompromiss celle atferd in vivo. Men vi har også lagt merke til at mens epiblast (E7.5) eller primitive strek celler (E8.5) var målrettet, ble noen endoderm celler også elektroporert (Figur 3C og tabell 1).
En av de store fordelene ved å bruke en kapillær elektrode er at antall elektroporerte celler kan kontrolleres, ganske enkelt ved å endre diameteren av åpningen. For å bestemme antall elektroporerte celler, ble embryoer fast to timer etter elektroporering og avbildes i wholemount på et konfokal mikroskop. Antallet GFP + celler ble tellet manuelt i konfokale z-stabler. Tabell 1 viser at, for et gitt trinn, øke åpningen størrelsen på glasset kapillær fra 20 til 30 um resulterer i DNA opptak av flere celler. Når en enkelt åpning størrelse ble sammenliknet mellom trinnene (E7.5 E8.5 versus), ble flere celler funnet å være elektroporert ved den sistnevnte fasen. Denne effekten kan skyldes en høyere konsentrasjon av DNA tilstede i amnionhule i E8.5. På grunn av at DNA-oppløsning ble blandet med grønn mat fargestoff, kan vi bruke den grønne farge for å vurdere DNA-konsentrasjonen i amnionhule. I mikroskopet, er det klart at, sammenlignet med E8.5 embryoer, er den grønne fargen etter DNA-injeksjon mye lettere i hulrommet i E7.5 embryoer. Selv om den samme konsentrasjonen av DNA-løsningen ble injisert i E7.5 E8.5 og embryoer, mer DNA-oppløsningen var i amnionhule av E8.5 embryoer for å fylle den helt, fordi de er større i størrelse. Etter uttak av injeksjonsnålen, er det alltid en viss grad av lekkasje av DNA-oppløsningen fra amnionhule, og siden punktering hullet er større i forhold til størrelsen av amnionhule i tidligere embryoer, er det sannsynlig at det var proporsjonalt mer lekkasje fra E7.5 E8.5 enn embryoer, som fører til en lavere DNA-konsentrasjon. Det annet antall transfekterteceller kan også være på grunn av forskjellige diametre eller indusert trans spenning (ITV) terskler av celler på ulike stadier.
En ulempe ved elektroporering er forbundet celledød. Lik den tradisjonelle forgylt eller nålformede elektroder, elektroporering ved anvendelse av en kapillær elektrode også fører til celledød. Etter elektroporering den målrettede regionen viste mørkere i farge i forhold til naboområdene (figur 3A og 3B), noe som indikerer at en viss grad av celledød må ha funnet sted i dette området. For å bestemme antall døde celler forårsaket av elektroporering måten videre, ble embryoer farget med et fluoriserende cellemembran-ugjennomtrengelig atom fargestoff. Kjerner av døde celler ble merket med en membran-ugjennomtrengelig langt-rød fluorescens fargestoff. Fargingen bekreftet at dette kapillære elektroporering teknikken resulterer bare i et lite antall døde celler i nærheten av elektroporering området (figur 3D og Taold 1).
Vi la merke til at selv om døde celler vises ved elektroporering området, GFP + celler og døde celler er også mest eksklusive fra hverandre (figur 3E og 3F). Dessuten, når den laterale hale epiblast ved E8.5 ble elektroporert med pCAG-GFP og et glass kapillær åpning av 20 pm, et stort antall GFP + celler ble detektert etter 48 timer i kultur (figur 3G og 3H). Tatt sammen tyder disse resultater på de fleste GFP + celler påvises 2 timer etter elektroporering fremdeles er levedyktige i løpet av ytterligere kulturen.
Vi scoret antall GFP + celler etter 24 timers ex vivo kultur. Seks embryoene ble elektroporert med pCAG-GFP på E7.5, ved hjelp av en kapillær åpning av 20 pm diameter. 107 ± 31 (gjennomsnitt ± SD) GFP + celler / embryo ble oppdaget. Siden i begynnelsen av kultur (2 timer), ble 9 celler elektroporert i gjennomsnitt per embryo (
Figur 1. kretsdiagram som viser electroporation oppsettet. Embryoet inneholdende DNA-oppløsning i sin amnionhule ble plassert mellom de to elektrodene. Gjeldende ved de valgte parametrene ble levert av en firkantet bølge pulsgenerator (strømforsyning). Et multimeter var koblet i serie for å oppdage den elektriske strømmen som går embryoet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fordelingen av podet eller elektroporerte celler i verts embryoer. (Ah) GFP fluorescens overlegg (grønn) på lysfelt bilder av wholemount embryoer (gråtone) (A) 10-16 GFP + EpiSCs ble podet inn i bortre delen av en sen -streak stadium embryo. (C) En større klump av GFP + EpiSCs ble podet inn i det distale området av en midtrekke trinns embryo. (B og D) Fordelingen av EpiSCs avledede celler (grønt) i vertsembryoer (vist i A og C) etter 24 timer i kultur. (B) GFP + cellene dispergert i verts embryo, noe som antyder korrekte integrering av donorcellene. (D) Pode større celleklumper resulterte i ikke-inkorporerte klump-dannelse i verts embryo. (EK) pCAG-Cre: GFP plasmid ele ctroporated inn i bestemte områder av villtype embryoer. Electroporating den distale delen av et tidlig stadium knopp embryo (E) eller primitive strek av et 2-5 somite stadium embryo (G) resulterte i GFP + celler i disse regionene 2 timer etter inngrepet. (F og H) Fordelingen av GFP + celler i vertsembryoer etter 24 timer i kultur, som viser at elektroporerte celler som bidrar til neuroectoderm (sort pil) (F) og paraksiale mesoderm (hvit pil) (H). (IK) DAB immunofarging for GFP + celler viser at de elektroporerte cellene kan gi opphav til neuroectoderm (I), mesoderm (J) og endoderm (J og K) etter 24 timer i kultur. Scale bar (AH) = 250 mikrometer; skala bar (IK) = 100 mikrometer. Merk: Figur 1A og 1B er gjengitt fra vår forrige publisering fire.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Fordeling av GFP + celler og døde celler i embryoene etter elektroporering (AC) pCAG-Cre. GFP plasmid elektroporert inn hale laterale epiblast celler av en E8.5 (2-5 somitt scenen) embryo (kapillær åpning størrelse .: 20 pm) (A) 2 timer etter inngrepet, målrettet regionen viste en mørk farge (hvit pil) sammenlignet med andre deler av embryo. Inset viser en forstørrelse av elektroporert regionen. (B) Lysfelt bilde (gråtoner) kledde med den grønne fluorescerende kanalen viser elektroporerte celler (grønt). (C) A confocal z-skive som viser atto endoderm celler (grønn) tok også opp plasmidet når haleside epiblast celler ble målrettet. De cellekjerner er vist med rødt (DF) pCAG-Cre. GFP plasmid ble elektroporert i kaudal aspekt av noden til en E8.5 embryo (kapillar åpningsstørrelse: 30 um). Embryo ble dyrket i 2 timer. Elektroporerte celler er vist i grønt og døde celler i rødt. (D) elektroporert inneholder både GFP + celler samt døde celler. Området i det hvite feltet ble ytterligere analysert i et konfokalt mikroskop. Manuell telling av z-stack viste at det var 33 GFP + celler og 23 døde celler i dette området. Bare to celler var begge positivt for begge fluoroforer. (E og F) XYZ visning av en confocal z-slice fra hvit eske regionen i D viser GFP + celler er atskilt fra de døde cellene. Kjernene er vist i blått (G og H) pCAG-Cre. GFP plasmid ble elektroporert inn noen cells i caudal laterale epiblast av en E8.5 embryo (kapillær åpning størrelse: 20 um) og avbildes etter to (G) og (H) 48 timers ex vivo kultur Note: (H) Et embryo ble kuttet i to etter kultur. Hode og hjerte regioner ble fjernet. Skala bar (A, B, D, G og H) = 250 um; skala bar (C, E og F) = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Diameter av åpningen av kapillarrøret | Embryo scenen | Electroporation effektivitet: nei. embryoer som inneholder GFP + celler etter 2t / total nei. av electroporated embryoer (nr. GFP + embryoer som utviklet normalt etter 24 eller 48t kultur) | Gjennomsnittlig antall GFP + celler per embryo ± sd (n = no. Av undersøkte embryo) | AntallGFP + endodermal celler per hvert embryo ± sd (n = no. Av undersøkte embryo) |
| 20 pm | E7.5 (LS-LB) | 7/9 (7) | 9 ± 3 (n = 4) | 4 ± 2 (n = 4) |
| 30 um | E7.5 (LS-LB) | 13/15 (12) | 17 ± 2 (n = 4) | 6 ± 1 (n = 4) |
| 20 pm | E8.5 (2-5 somites) | 12/13 (10) | 21 ± 4 (n = 4) | 11 ± 4 (n = 4) |
| 30 um | E8.5 (2-5 somites) | 2/2 (2) | 33 og 26 (n = 2) | 14 og 16 (n = 2) |
Tabell 1. Electroporation effektivisere pCAG-Cre: GFP plasmid i museembryoer.
Forkortelse: LS, sent primitive streak scenen; LB: sent knopp scenen. Embryoer er iscenesatt i henhold tilNedturer og Davies 12
Discussion
Negl
Den kritiske trinn for celle pode eksperimenter er innsetting av en sammenhengende rekke celler ideelt i en enkelt handling, for å unngå breakup av klumpen. Denne teknikken krever litt øvelse i å kontrollere munnen pipette. Dersom donorceller innlemme godt i verten, vil deres derivater dispergeres i embryo. For å kunne fastslå om spredt donor avledet-cellene differensieres hensiktsmessig i verten, kan immunofarging utføres på embryo deler. Dersom donorcellene er ikke kompatible med verten miljøet, de enten ikke kan registreres (etter hvert som de blir utstøtt fra embryo) eller danner klumper uinkorporerte i embryoer etter kulturen. Hvis begge spredte celler og celleklumper ble observert, kan dette tyde på at for mange celler ble podet og overdreven donorceller som ikke kan samhandle med omkringvertsceller medførte klump formasjon. I dette tilfellet ytterligere transplantater inneholdet mindre antall celler kan utføres.
Den viktigste begrensning for cellen podingen teknikk er at det ikke er mulig å bestemme det fulle potensiale in vivo av celler ex vivo, siden mus kultur over perioder lengre enn 48 timer er ikke blitt oppnådd. Imidlertid, hvis den kombineres med ultralyd-styrt celleinjeksjon, kan det være mulig å overføre dyrkede celler til embryoene in utero. For å oppsummere, celle pode eksperimenter har blitt mye brukt i vår gruppe og har gitt oss verdifulle ledetråder om in vivo potensialet i ulike celletyper 4,21,22. Det er en teknikk av generell anvendbarhet for å vurdere potensialet for in vivo in vitro dyrkede celler i tidlige embryoer fostertap.
Electroporation
Selv om det i denne studien har vi bare vist at det er effektivt å bruke kapillær elektroporering teknikk for å målrette epiblast, jegt er også mulig å bevisst målrette andre bakterie lag som endoderm celler. Det kritiske trinnet for kapillær electroporation teknikk er å minimere tiden det tar å electroporate hvert embryo (<5 min per embryo) siden PBS er meget suboptimal for tidlig mus embryo. Våre data ovenfor, har vist at i de fleste områder i embryoer, ikke elektroporering påvirker ikke embryo vekst. Men elektroporering i node forårsaket unormal utvikling og førte til tidlig død av embryo. Dette er sannsynligvis på grunn av skade eller død av cellene som danner viktige signalsentre 23. Derfor ville denne regionen må unngås med denne teknikken. En ytterligere påminnelse er at, som nevnt i resultatene delen, mens epiblast eller primitive strek cellene var målrettet, noen endoderm celler ble også elektroporert. Dette kan være fordi DNA kommer til endoderm gjennom hullene under epiblast epitel. Endoderm består av epitelceller og i vår erfaring thESE celler har en større tilbøyelighet til å ta opp DNA. Derfor, ved anvendelse av denne teknikken for skjebne kartlegging, er det viktig å vurdere hvilke celler innledningsvis tar opp DNA.
Det bør også bemerkes at selv om pCAG-GFP og pCAG-Cre: kan GFP plasmider effektivt leveres ved hjelp av electroporation parametrene som er vist i denne studien, kan effektiviteten av andre DNA-konstruksjoner varierer og må individuell optimalisering. Endringer i DNA-konsentrasjon, elektroporering spenning eller det antall pulser som kan bli gjort dersom plasmider er funnet å være vanskelig å transfektere.
For å oppsummere, kan vår nettside optimalisert kapillær elektroporering systemet effektivt og reproduserbart levere GFP eller Cre: GFP plasmider i en svært få celler i embryoet med begrenset celledød. Etter denne metoden ikke krever dyrt eller høyt spesialisert utstyr, kan det være til stor nytte for celle sporing studier, eller i å teste virkningen av ektopisk ekspresjon eller betinget sletting of gener i tidlige embryoer, er hvis elektroporering utføres i embryoer bærer floxed betingede mutante alleler. Derfor gir denne teknikken elektroporasjon et nyttig verktøy for å forstå funksjonelt på en celle-for-celle-basis rollene til celle-indre faktorer i sammenheng med lokaliserte villtype embryoniske miljø.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Dumostar | T5390 | |
| Dissecting stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Stereomicroscope system with fluorescence | Nikon | AZ100 | |
| Inverted microscope with a digital camera | Olympus | Olympus BX61 | |
| Inverted confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
| Low melting point agarose | Life Technologies | 16520-050 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 11397863 | |
| 30mm Petri dishes | Fisher Scientific | 121V | |
| 4-well plates | Thermo scientific | 179820 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pipettes | NICHIRYO | Nichipet | |
| tips | Greiner Bio One | 685280 | |
| Cell culture incubator | SANYO | MCO-17AIC | |
| Roller culture apparatus | BTC Engineering | ||
| Syringe filters 0.45µm, sterile | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
| Sodium pyruvate solution | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
| Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
| Gas Cartridge for Portable Meker Burner | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
| Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Microforge | De Fonbrune | BS030301 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV830 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| ECM 830 square wave pulse generator | BTX | 45-0002 | |
| Green food coloring dye | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
| A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye | Biotium | 40060-T | |
| pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
| pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
| Multimeter | Excel | XL830L | |
| Micromanipulators | Leitz | ||
| 0.2mm diameter platinum wire | Agar Scientific | E404-2 | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | |
| Goat anti-Chicken IgY, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
| Liquid DAB+ Substrate Chromogen System | Dako | K3467 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
| A far-red fluorescence nuclear counterstain | Life Technologies | T3605 |
References
- O'Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists. Pulmonary med. , 894063 (2012).
- Brons, I. G., et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature. 448, 191-195 (2007).
- Tesar, P. J., et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature. 448, 196-199 (2007).
- Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation. Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).
- Sadik, M. M., et al. Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation. Biophys. J. 106, 801-812 (2014).
- Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).
- Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo. Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).
- Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation. JOP. 6, 128-135 (2005).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7, 107 (2007).
- Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation. Genesis. 35, 57-62 (2003).
- Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum. CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893 (2007).
- Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae. Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Nolkrantz, K., et al. Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary. Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).
- Mazari, E., et al. A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage. Development. 141, 2349-2359 (2014).
- Copp, A. J., Cockroft, D. L. Postimplantation mammalian embryos : a practical approach. , IRL Press. (1990).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).
- Wilson, V., Beddington, R. S. Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak. Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis. Dev Cell. 17, 365-376 (2009).
- Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent. Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).
- Tsakiridis, A., et al. Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors. Development. 141, 1209-1221 (2014).
- Gouti, M., et al. In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity. PLoS biology. 12, e1001937 (2014).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120, 613-620 (1994).
