Abstract
Manipulatie en de cultuur van de vroege muizenembryo's is een krachtige maar grotendeels onderbenut technologie verbeteren van de waarde van dit model systeem. Omgekeerd celcultuur is op grote schaal gebruikt in de ontwikkelingsbiologie studies. Het is echter belangrijk om te bepalen of in vitro gekweekte cellen werkelijk in vivo celtypen vertegenwoordigen. Enten cellen in embryo's, gevolgd door een evaluatie van hun bijdrage tijdens de ontwikkeling is een bruikbare methode om de mogelijkheden van in vitro gekweekte cellen te bepalen. In deze studie beschrijven we een werkwijze voor het enten van cellen in een bepaalde plaats van vroege muizenembryo's na implantatie, gevolgd door ex vivo kweken. We hebben ook een geoptimaliseerde electroporatie methode glascapillairen gebruik van bekende diameter, waardoor precieze lokalisatie en aanpassing van het aantal cellen waar exogeen DNA met zowel hoge transfectie-efficiëntie en lage celdood voeren. Deze technieken, die geen sp vereisenecialized apparatuur, geef experimentele manipulaties van de gastrulatie en vroege organogenese stadium muizenembryo mogelijk, waardoor analyse van betrokkenheid in gekweekte cel subpopulaties en het effect van genetische manipulatie in situ op celdifferentiatie.
Introduction
Celcultuur is op grote schaal gebruikt in de ontwikkelingsbiologie studies. Muis embryonale stamcellen (SER) en epiblast stamcellen (EpiSCs) kunnen differentiëren naar alle weefsels in vitro en een nuttig model voor de celdifferentiatie begin zoogdier embryogenese. De afleiding van deze cellijnen heeft opengesteld een kans voor in vitro manipulatie en gedetailleerd onderzoek van de gelokaliseerde signalering evenementen en transcriptionele netwerken die tijdens de vroege embryonale patroonvorming. Het blijft echter van belang de in vivo relevantie van elke manipulaties uitgevoerd in kweek te bepalen. De in vivo potentieel van pre-implantatie-embryo afgeleid muis SER is beoordeeld door de invoering van hen terug in pre-implantatie embryo's (morulae of blastocysts) 1. Echter, kunnen EpiSCs dat de epiblastcellen vertegenwoordigen postimplantatie embryo's niet efficiënt te integreren in de pre-implantatie embryo's 2,3. Onze previoons bevindingen blijkt dat EpiSCs efficiënt genereren chimeren en bijdragen aan alle kiembladen wanneer geënt na implantatie embryo 4. Zo is de beste manier om de in vitro gekweekte cellen te beoordelen is in te voeren naar hun corresponderende omgeving in vivo.
Elektroporatie is een veelgebruikte methode exogene moleculen te leveren aan doelcellen in zowel in vivo als in vitro experimenten. Elektrische energie kan een groot aantal poriën in het celmembraan, welke exogeen desoxyribonucleïnezuur (DNA) of ribonucleïnezuur (RNA) om de cellen te voeren kan genereren. Een van de grootste uitdagingen voor deze methode is om optimale cellevensvatbaarheid te combineren met een hoge efficiency electrotransfection 5,6. Voor elektroporatie van nucleïnezuren in embryonale weefsels, vergulde elektroden meest gebruikt, waardoor targeting van cellen in een groot ruimtelijk bereik 7-9. Om een meer loca bereikenseerd genoverdracht heeft een naaldvormige elektroden benut om een centraal elektrisch veld 10,11 realiseren. Met deze methode, de auteurs bleek dat na de elektroporatie, ongeveer 30-60 cellen had de DNA construct 11. Toch lijkt dat het nauwkeurig instellen van het aantal geëlektroporeerde cellen blijft moeilijk met een vaste breedte electrode. De capillaire elektroporatie techniek is gebruikt om plasmiden te leveren aan individuele cellen 12-14. Echter, deze techniek niet toegepast voor elektroporeren plasmiden ex vivo om embryo's. Recenter is een micro-inrichting gerapporteerd lokaal electroporate enkele distaal viscerale endoderm cellen (minder dan 4 cellen) in het vroege muizenembryo's 15 na implantatie. Het is echter nog niet bekend of dit apparaat efficiënt richten ectoderm en mesoderm ex vivo.
In deze studie beschrijven we twee nieuwe methoden om de cellulaire en gen-functie in de vroege post beoordelen-implantation embryo. We tonen eerst hoe in vitro gekweekte cellen te enten in bepaalde plaatsen in het begin van muizenembryo's om hun in vivo potentieel te beoordelen. De integratie van de geënte cellen en hun nageslacht, alle gelabeld met een genetisch label (bijvoorbeeld een groen fluorescent eiwit (GFP), kunnen verder door immunokleuring van weefselspecifieke eiwitten onderzocht 4. Ten tweede, beschrijven we een verbeterde werkwijze precies DNA leveren gelokaliseerde sites in het embryo via elektroporatie. In plaats van een naaldvormige elektroden, hebben wij een dunne draad in een fijne punt glascapillair en tonen aan dat deze modificatie kan leveren DNA een klein aantal cellen met een hoge efficiëntie en beperkte celdood. Bovendien tonen wij met glazen capillairen met verschillende afmetingen opening, kunnen we het aantal geëlektroporeerde cellen te controleren. Daarom geloven wij deze methode kan van groot nut zijn voor de vroege embryonale patroonvorming bestuderen van kleine aantallen of cellen.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Britse ministerie van Binnenlandse Zaken Regulations uitgevoerd zoals aangegeven in de Dieren (Scientific Procedures) Act (1986) onder nummer Project Licence 60/4435. Om embryo's te verzamelen op specifieke ontwikkelingsstadia, werden getimed paringen opgezet O / N. S middags op de dag van het vinden van een vaginale plug werd aangeduid embryonale dag (E) 0.5.
1. Opheldering van de E7.5 of E8.5 postimplantatie embryo's voor Ex Vivo Cultuur
- Offeren de zwangere vrouwelijke muizen door cervicale dislocatie.
- Isoleer de baarmoeder met een schaar, vast te houden met een pincet en plaats in een 30 mm schotel gevuld met M2 medium.
- Scheur voorzichtig uit elkaar het myometrium gebruik van twee paar fijne tang.
- Afpellen de decidua, zorg dat u de extra-embryonale gaatjes prikken.
- Verwijder de Reichert's membraan door knijpen met een tang en langzaam scheidt van de embryo.
- Controleer de embryo's onder een dissectiestereomicroscoop dat de dooierzak, amnion en ectoplacental kegel intact.
- Overdracht van de embryo's om een schone schotel van M2 met een pipet en plaats op een 30 mm plastic petrischaal deksel op ijs (de 'ice-platform ") gedeeltelijk chill embryo's.
- Desgewenst opslag embryo M2 op een ijs platform tot 1,5 uur, bijv. Tijdens Mediavoorbereiding of manipuleren van kleine hoeveelheden ~ 3-4 embryo bij kamertemperatuur.
Opmerking: Herstel en dissectie van knaagdieren embryo's is eerder in detail beschreven 7,8,16.
2. Bereid de Embryo Cultuur Medium
- Vers ontdooien hetzij in de handel verkrijgbare rat serum (zie Glanville-Jones et al. 13 voor specificaties) of rat serum bereid in-house volgens Copp en Cockroft 16 die warmte geïnactiveerd werd gedurende 30 min bij 56 ° C en in 1 ml ingevroren fracties bij -80 ° C
Opmerking: de handel verkrijgbare rattenserum is aanvaardbaar voor periodes cultuur van 24-36 uur, hoewel serum bereid in-huis is, in onze ervaring, superieur voor periodes cultuur tot 48 uur. - Vers bereiden overmaat (bijv., 10 ml) van gedefinieerde supplementen bestaande uit Glasgow minimum essentieel medium (GMEM), 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 2 mM L-glutamine en 1 mM natriumpyruvaat.
- Bereken het volume kweekmedium dat nodig is volgens het aantal embryo's van elke fase die zullen worden gekweekt (zie sectie 3). Meng de rat serum met de gedefinieerde supplementen te maken van 50% kweekmedium (1: 1 (v / v) rattenserum: gedefinieerd supplementen) en / of 75% kweekmedium (3: 1 (v / v) rattenserum: gedefinieerd supplementen).
- Leid de embryo kweekmedium door een 0,45 urn filter en voeg 10.000 IU / ml penicilline en 10 ug / ml streptomycine.
Opmerking: Vers ontdooid L-glutamine en natriumpyruvaat oplossing is cruciaal voor embryonale ontwikkeling in ex vivo kweken.
- Voor E7.5 embryo: statische kweek gebruikt 4 putjes in een met 5% CO 2 toegevoerd in lucht bij 37 ° C gedurende 24 uur incubator. Culture maximaal twee embryo per putje in 1 ml 50% kweekmedium.
- Voor E8.5 embryo: gebruik een roller cultuur inrichting 8 roteert met 35 omw / min met doorlopende vergassing met 5% CO2 in lucht bij 37 ° C gedurende 24 uur (1 ml 50% kweekmedium per embryo).
- Voor E9.5 embryo: gebruik een roller kweek inrichting roterend met 35 omw / min opnemen gassen met 5% CO2, 40% O2 55% N 2 toegevoerd bij 37 ° C gedurende 24 uur (1 ml 75% kweekmedium per embryo).
Opmerking: Cultuur embryo's binnen 3 uur na euthanizing de muizen zo langdurig in M2 negatieve invloed hebben op de ontwikkeling. Zie Copp en Cockroft 16 voor de methode van ex vivo embryo cultuur.
4. Grafting gekweekte cellen in E7.5 of E8.5 muizenembryo's
- Fysiek schrapen EpiSCs, die alom uiten GFP, van een 6-well cultuur plaat met behulp van een 20-200 ul pipet tip en plaats ze in een 30 mm schotel met de embryo's
Opmerking: Om de cel klonten in de embryo's in te voegen, cellen worden fysiek eerder dan gesloopt getrypsineerd. - Bevestig een hand getrokken enten capillair naar de beluchtingsbuis een mond pipet te maken.
- Zachtjes zuigen de mond pipet om een of meer celklonten van grootte> 20 cellen te trekken in het enten capillair.
- Blaas de cellen, gedeeltelijk verspreiden grote klonten.
- Selecteer één cel clump bevattende ~ 10-20 cellen opnieuw te zuigen in de enten capillair, waardoor het dicht bij de opening van het capillair. Wees niet naar de cel klomp bewegen in en uit de capillaire herhaaldelijk om break-up in kleinere stukken te vermijden.
- Houd de embryo losjes vast met een pincet en plaats het entencapillair in het gebied van belang om een opening te creëren.
- Zachtjes verdrijven de klomp uit het enten capillaire, het verlaten van de korte keten van 10-20 cellen in het embryo ingediend.
- Herhaal het enten procedure voor het gewenste aantal embryo. Gebruik seriegroottes van 3-4 embryo's voor het gemak.
- Het verlaten van embryo's in dezelfde schotel van M2 medium, beeld geënte embryo met fluorescentie- verbinding ontleden microscoop met camera, houden imaging tot een minimum blootstelling van de embryo's overmatig licht en warmte te voorkomen.
Opmerking: Bepaal belichtingstijden empirisch omdat deze afhankelijk van de specificaties van de camera en microscoop, alsmede de aard en de fluorescentie-intensiteit van de fluorofoor. - Overdracht van de embryo in een pastette met een minimaal volume van M2 medium tot pre-evenwicht gebracht kweekmedium (zie paragraaf 3) onmiddellijk na de beeldvorming.
Opmerking: onderzoekt de morfologie van de embryo's zorgvuldig na enten. Alleen de cultuur van de INTACt embryo.
5. Handmade Elektroporatie Materialen en Apparatuur Setup (Bereid de volgende vooraf Electroporation Experimenten):
- Voor DNA-injectie pipetten: trek DNA-injectie pipetten met een horizontale micropipet trekker. Injectie pipetten zou een fijne punt te hebben met een opening van minder dan 10 pm tot weefselbeschadiging te voorkomen bij het injecteren van DNA in het embryonale holtes.
- Voor glas capillair elektroporatie: gebruik een microforge de opening van DNA injectie pipetten met een inwendige diameter van 20 of 30 urn gesneden. Om cellulaire schade te vermijden wanneer de capillair in contact met de embryo voor elektroporatie, moet het uiteinde van het glazen capillair gesneden zuiver en geen scherpe, gebroken hoeken bevatten.
- Voor handgemaakte capillaire elektrode (anode) (Figuur 1): Plaats een 0,2 mm diameter platina draad in een elektroporatie glazen capillair met een vaste opening 20 of 30 urn diameter uitverkoren richtenric stroom en levert het plasmide-DNA om een klein gebied van belang in het embryo.
- Voor handgemaakte L-vormige elektrode (kathode) (Figuur 1): buig een 0,2 mm diameter platinadraad creëren van een "L" -vorm, het horizontale deel van de "L" ongeveer 1 mm.
- Bevestig elke platina-elektrode om een dunne geïsoleerde draad en steek deze in een micro-injectie naald houder onder isolatie tape.
- Monteer de naald houders op standaard houders micromanipulatie instrument.
- Sluit de schakeling volgens figuur 1: sluit de capillaire elektrode de anode van de voeding; Sluit de L-vormige elektrode de anode van de multimeter; Sluit de kathode van de mulimeter met de kathode van de stroomvoorziening.
6. Elektroporatie E7.5 of E8.5 muizenembryo's
- Vul het elektroporatie glazen capillair met PBS om binnen 1-2 mm van de top en steek de StraiGHT platina elektrode (anode) in de glazen capillair totdat de onderkant van de capillair bereikt.
- Anker de L-vormige elektrode (kathode) op het oppervlak van een 30 mm petrischaal gevuld met PBS.
- Transfer het embryo uit M2 medium in de PBS-gevulde elektroporatie schotel.
- Steek de injectienaald tegen zijdelingse epiblast in de amnionholte van het embryo. Met behulp van een pneumatische pomp pico, injecteren DNA-oplossing (pCAG-Cre: GFP of pCAG-GFP 1-1,5 ug / ml met 0,01% groene kleurstof kleurstof) in de holte totdat deze helemaal vol. Voor E7.5 E8.5-embryo's, minder dan 5 pl DNA-oplossing vereist een embryo. Met behulp van de groene kleurstof als een indicator, wees voorzichtig het embryo niet te barsten.
- Positie voorzichtig embryo tussen de elektroden en zet de capillaire elektrode naar de juiste plaats waar het DNA wordt afgegeven.
Opmerking: De oriëntatie van het embryo is afhankelijk van het gebied waar het DNA wordt geëlektroporeerd. - Electropowaardeert het embryo met behulp van 200 volt (V) in 6 pulsen, die elk 50 ms duur met 1 sec interval tussen elke puls.
- Breng de embryo vooraf geëquilibreerd kweekmedium direct na elektroporatie. Indien gewenst, herhaal het proces voor de volgende embryo.
Opmerking: Voeg het kweekmedium in een steriele container en zet het in de incubator voor een pre-evenwicht het medium. - Om geëlektroporeerde cellen te detecteren 2 uur na de cultuur, de overdracht van de embryo's om een schone 30 mm petrischaal van M2 medium met behulp van een pastette. Beeld de embryo's in stap 5.9 met fluorescentie- verbinding dissectiemicroscoop.
- Breng de embryo's terug naar de cultuur met een pastette onmiddellijk na beeldvorming.
- Om dode cellen veroorzaakt door elektroporatie detecteren vlekken de embryo's met een ver-rode celmembraan-doorlaatbare nucleaire kleurstof (1: 200 in embryo kweekmedium) bij 37 ° C gedurende 10 min 2 uur na elektroporatie (optioneel)
- Om de geëlektroporeerde cellen te tellen, bevestig de embryos in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 2-4 uur bij 4 ° C, vlekken op de kern met ultraviolette of ver-rode fluorescente nucleaire tegenkleuring beeld en de embryo's met behulp van een confocale microscoop (optioneel).
Opmerking: Embryonale groei nadelig beïnvloed als te lang gelaten in PBS. Daarom is ervoor te zorgen dat de tijd genomen om elk embryo electroporate wordt geminimaliseerd (<5 min per embryo).
Representative Results
Het enten
EpiSCs dat alom uiten EGFP (R04-GFP, afkomstig van E6.5 epiblast en C2, afgeleid in vitro uit mESCs) 4 werden handmatig geschraapt van de cultuur schotel en geënt op verschillende sites van E7.5 embryo's (Figuur 2A). De embryo's werden ex vivo gekweekt en na 24 uur geanalyseerd. De verdeling van de donorcellen werd vastgesteld door fluorescentie microscopie. Als donorcellen opgenomen, zij verspreidden en derivaten daarvan gedispergeerd in de ontvangende embryo's (Figuur 2B). Er is waargenomen dat transplantaten met 10-16 cellen efficiënt verwerkt in de ontvangende embryo (Figuur 2A en 2B), echter enten meer cellen niet leidt tot betere chimerisme. In plaats daarvan, geënte cellen geproduceerd zonder rechtspersoonlijkheid klompjes (figuur 2C en 2D).
Elektroporatie
Eeneoordeel de efficiëntie van onze electroporation systeem, leverden we GFP-expressie plasmiden (pCAG-GFP en pCAG-Cre: GFP) aan specifieke plaatsen in het embryo. Consistent met een eerder onderzoek 11, werden GFP + cellen waargenomen in embryo 1-2 uur na elektroporatie (Figuur 2E en 2G). Wanneer distale epiblast cellen op het einde van de primitieve streep stadium embryo werden geëlektroporeerd, gelabelde cellen bijgedragen aan de neurale ectoderm na 24 uur in de cultuur (figuur 2E en 2F). Dit resultaat komt goed overeen met bekende lot kaarten van epiblast cellen in gastrulatie stadium embryo's 17. Ook wanneer het GFP-expressieplasmide werd geëlektroporeerd in de primitieve streep bij E8.5 (2-5 somieten), GFP + cellen bijgedragen tot het paraxiale mesoderm (figuur 2G en 2H), in overeenstemming met bekende lot kaarten van wijlen primitieve streep 18 . Bovendien zagen we bijdrage aan alle drie de kiem lagen van geëlektroporeerde cellen (figuur 2I-K),suggereert dat de elektroporatieprocedure celgedrag geen gevaar in vivo. Maar ook gemerkt dat hoewel epiblast (E7.5) of primitiefstreek cellen (E8.5) waren gericht, wat endoderm cellen werden geëlektroporeerd (Figuur 3C en Tabel 1).
Een van de grote voordelen van een capillair elektrode dat het aantal geëlektroporeerde cellen kan worden gecontroleerd, door eenvoudig de diameter van de opening. Om het aantal geëlektroporeerde cellen te bepalen, werden embryo's gefixeerd 2 uur na elektroporatie en afgebeeld in wholemount op een confocale microscoop. Het aantal GFP + cellen handmatig geteld in de confocale z-stacks. Tabel 1 laat zien dat voor een bepaald stadium, waardoor de openingsafmeting van het glazen capillaire 20-30 urn resulteert in DNA-opname door meer cellen. Wanneer een enkele openingsafmeting vergeleken tussen trappen (E7.5 versus E8.5), werden meer cellen gevonden wordt geëlektroporeerd in het laatste stadium. Dit effect kan te wijten zijn aan een hogere concentratie van DNA in de amniotische holte E8.5. Omdat de DNA-oplossing werd gemengd met de groene voedselkleurstof, kunnen we de groene kleur gebruikt om de DNA-concentratie beoordeelt de amnionholte. In de microscoop blijkt dat, vergeleken met E8.5 embryo, de groene kleur na DNA-injectie veel lichter in de holte van E7.5 embryo. Hoewel dezelfde concentratie van de DNA-oplossing werd geïnjecteerd in E7.5 en E8.5 embryo, meer DNA-oplossing werd in de amnionholte van E8.5 embryo's om ze volledig te vullen omdat ze groter in omvang. Na terugtrekken van de injectienaald, er altijd een zekere mate van lekkage van DNA-oplossing uit de amnionholte, en aangezien de punctie opening groter in vergelijking met de omvang van de amnionholte eerdere embryo's, is het waarschijnlijk dat er verhoudingsgewijs meer lekken van E7.5 dan E8.5 embryo, wat leidt tot een lagere DNA-concentratie. Het verschillend aantal getransfecteerdecellen kunnen ook het gevolg zijn van de verschillende diameters of teweeggebrachte transmembraan spanning (ITV) drempels van cellen in verschillende stadia.
Een nadeel van elektroporatie is de bijbehorende celdood. Net als bij de traditionele vergulde of naaldvormige elektroden, elektroporatie met behulp van een capillaire elektrode veroorzaakt ook de celdood. Na elektroporatie het doelgebied donkerdere kleur verscheen in vergelijking met naburige gebieden (figuur 3A en 3B), wat aangeeft dat een zekere mate van celdood moet hebben plaatsgevonden op dit gebied. Om verder te bepalen aantal dode cellen als gevolg van de elektroporatieprocedure, werden embryo's gekleurd met een fluorescent celmembraan ondoorlatend nucleaire kleurstof. De kernen van dode cellen werden gelabeld met een membraan ondoorlaatbare ver-rode fluorescentie kleurstof. De kleuring bevestigd dat dit capillair electroporatietechniek resulteert slechts in een klein aantal dode cellen bij de elektroporatie (figuur 3D en Table 1).
We hebben gemerkt dat, hoewel de dode cellen verschijnen op de elektroporatie site, GFP + cellen en dode cellen zijn ook de meest exclusieve van elkaar (figuur 3E en 3F). Wanneer bovendien de caudale laterale epiblast bij E8.5 geëlektroporeerd met pCAG-GFP en een glazen capillaire opening van 20 urn, een groot aantal GFP + cellen werd gedetecteerd na 48 uur in kweek (Figuur 3G en 3H). Samengenomen suggereren deze resultaten meeste GFP + cellen waargenomen 2 uur na elektroporatie blijven levensvatbaar bij de verdere kweek.
We scoorden het aantal GFP + cellen na 24 uur ex vivo cultuur. Zes embryo's werden geëlektroporeerd met pCAG-GFP bij E7.5, met een capillaire opening van 20 urn diameter. 107 ± 31 (gemiddelde ± sd) GFP + cellen / embryo's werden gedetecteerd. Sinds het begin van de cultuur (2 uur), werden 9 cellen geëlektroporeerd gemiddeld per embryo (
Figuur 1. Circuit diagram dat de elektroporatie setup. Het embryo bevattende DNA-oplossing in de amnionholte is gepositioneerd tussen de twee elektroden. Stroom bij de gekozen parameters werd geleverd door een vierkante golf pulsgenerator (voeding). Een multimeter werd in serie geschakeld om de elektrische stroom die het embryo te detecteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. De verdeling van de geënte of geëlektroporeerde cellen in de gastheer embryo's. (AH) GFP fluorescentie overlays (groen) op helderveld beelden van wholemount embryo's (grijswaarden) (A) 10-16 GFP + EpiSCs werden geënt in het distale gebied van een late -streak stadium embryo. (C) Een grotere groep van GFP + EpiSCs werd geënt in het distale gebied van een mid-streak stadium embryo. (B en D) De verdeling van EpiSCs afgeleide cellen (groen) in de ontvangende embryo's (weergegeven in A en C) na 24 uur in kweek. (B) GFP + cellen gedispergeerd in de ontvangende embryo, wat erop wijst correcte integratie van de donorcellen. (D) Enten grotere celklonten geleid feitelijke clump formatie in het ontvangende embryo. (EK) pCAG-Cre: GFP plasmide ele ctroporated in specifieke gebieden van de wild-type embryo's. Electroporating het distale gebied van een vroege embryo knopstadium (E) of de primitieve streep van 2-5 somiet stadium embryo (G) resulteerde in GFP + cellen in deze regio 2 uur na de procedure. (F en H) De verdeling van GFP + cellen in de ontvangende embryo na 24 uur in kweek tonen dat geëlektroporeerde cellen bijdragen tot de neuroectoderm (zwarte pijl) (F) en paraxiale mesoderm (witte pijl) (H). (IK) DAB immunokleuring voor GFP + cellen blijkt dat de geëlektroporeerde cellen aanleiding tot neuroectoderm (I) oplevert, mesoderm (J) en endoderm (J en K) na 24 uur in kweek. Schaalbalk (AH) = 250 pm; schaal bar (IK) = 100 micrometer. Opmerking: Figuur 1A en 1B worden herdrukt van onze vorige publicatie 4.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Verdeling van GFP + cellen en dode cellen in de embryo's na elektroporatie (AC) pCAG-Cre. GFP plasmide geëlektroporeerd in de caudale laterale epiblast cellen van een E8.5 (2-5 somiet fase) embryo (capillaire opening grootte :. 20 urn) (A) 2 uur na de procedure, het doelgebied liet een donkere kleur (witte pijl) in vergelijking met andere delen van het embryo. Inzet toont een vergroting van het gebied geëlektroporeerd. (B) het Helderveld (grijswaarden) bedekt met groen fluorescerend kanaal waarop de geëlektroporeerde cellen (groen). (C) Een confocale z-slice blijkt dattwee endoderm cellen (groen) nam ook het plasmide als het caudale laterale epiblast cellen waren gericht. De celkernen zijn in het rood (DF) pCAG-Cre. GFP plasmide werd geëlektroporeerd in de caudale aspect van het knooppunt van een E8.5 embryo (capillaire opening grootte: 30 pm). Het embryo werd gekweekt gedurende 2 uur. Geëlektroporeerde cellen worden in het groen en dode cellen rood. (D) De geëlektroporeerde gebied bevat zowel GFP + cellen en dode cellen. Het gebied in de witte doos werd verder geanalyseerd in een confocale microscoop. Handmatige telling van de z-stack bleek dat er 33 GFP + cellen en 23 dode cellen in dit gebied. Slechts twee cellen waren beide positief voor beide fluoroforen. (E en F) XYZ weergave van een confocale z-segment van het witte omkaderde gebied D tonen GFP + cellen zijn gescheiden van de dode cellen. De kernen worden in blauw (G en H) pCAG-Cre. GFP-plasmide werd geëlektroporeerd in een enkele celIs in de caudale laterale epiblast een E8.5 embryo (capillaire opening size: 20 pm) en afgebeeld na twee (G) en 48 (H) uur ex vivo kweken Opmerking: (H) Het embryo werd gescheiden in twee na kweek. Het hoofd en het hart regio's werden verwijderd. Schaalbalk (A, B, D, G en H) = 250 pm; schaal bar (C, E en F) = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Diameter van de opening van het capillair | Embryonale stadium | Elektroporatie efficiency: neen. embryo's bevattende GFP + cellen na 2h / totaal. van geëlektroporeerd embryo's (nr. GFP + embryo's die normaal ontwikkeld na 24 of 48 uur cultuur) | Gemiddeld aantal GFP + cellen per embryo ± SD (n = geen. Van de onderzochte embryo's) | AantalGFP + endodermale cellen per elk embryo ± SD (n = geen. Van de onderzochte embryo's) |
| 20 pm | E7.5 (LS-LB) | 7/9 (7) | 9 ± 3 (n = 4) | 4 ± 2 (n = 4) |
| 30 pm | E7.5 (LS-LB) | 13/15 (12) | 17 ± 2 (n = 4) | 6 ± 1 (n = 4) |
| 20 pm | E8.5 (2-5 somieten) | 12/13 (10) | 21 ± 4 (n = 4) | 11 ± 4 (n = 4) |
| 30 pm | E8.5 (2-5 somieten) | 2/2 (2) | 33 en 26 (n = 2) | 14 en 16 (n = 2) |
Tabel 1. Elektroporatie efficiëntie van pCAG-Cre: GFP plasmide muizenembryo's.
Afkorting: LS, laat primitieve streep stadium; LB: laat knopstadium. Embryo's worden opgevoerd volgensDowns en Davies 12
Discussion
Het enten
De kritische stap voor cellulaire transplantatie experimenten is het inbrengen van een samenhangende reeks cellen idealiter in één handeling te verbreken van de klont te vermijden. Deze techniek vereist enige oefening bij het beheersen van de mond pipet. Als donorcellen omvatten zowel in de gastheer, hun derivaten dispergeren in het embryo. Om verder te bepalen of de gedispergeerde donor-afgeleide cellen differentiëren adequaat in de gastheer, kan immunokleuring worden uitgevoerd op het embryo secties. Als donorcellen zijn niet compatibel met de nieuwe omgeving, ofwel kunnen ze niet worden gedetecteerd (zoals ze worden uitgestoten uit het embryo) en vormen klonten niet opgenomen in de embryo's na kweek. Als beide verspreid cellen en celklonten werden waargenomen, kan dit erop wijzen dat er te veel cellen werden geënt en overmatig donorcellen die niet kan interageren met omliggende gastheercellen resulteerde in klomp formatie. In dit geval zijn aanvullende grafts bevatteneen kleiner aantal cellen kan worden uitgevoerd.
De belangrijkste beperking van de cel enten techniek is dat het niet mogelijk is om het volledige potentieel in vivo aangezien muizen cellen ex vivo kweken over perioden langer dan 48 uur niet is bereikt bepalen. Echter, in combinatie met ultrageluid geleide celinjectie, kan het mogelijk zijn om gekweekte cellen te dragen aan het embryo in de baarmoeder. Samenvattend cel enten experimenten op grote schaal gebruikt in onze groep en ons waardevolle aanwijzingen over de in vivo capaciteit van verschillende celtypes 4,21,22 gegeven. Het is een techniek van algemeen nut voor de in vivo potentie van in vitro gekweekte cellen in vroege na implantatie embryo beoordelen.
Elektroporatie
Hoewel in deze studie hebben we alleen aangetoond dat het efficiënt de capillaire elektroporatie techniek om de epiblast targeten it is ook mogelijk opzettelijk richten andere kiembladen zoals endoderm cellen. De kritische stap voor de capillaire elektroporatie techniek is de tijd voor elk embryo (<5 min per embryo) electroporate minimaliseren aangezien PBS erg suboptimaal voor vroege muizenembryo's. De bovenstaande gegevens blijkt dat in de meeste gebieden van de embryo, elektroporatie laat de embryo ontwikkeling. Echter, elektroporatie in het knooppunt veroorzaakte abnormale ontwikkeling en leidde tot de voortijdige dood van het embryo. Dit is waarschijnlijk te wijten aan schade of de dood van de cellen die belangrijke signaalfunctie centra 23 vormen. Daarom zou dit gebied te vermijden met deze techniek. Een ander nadeel is dat, zoals vermeld in de sectie resultaten, terwijl epiblast of primitieve streep cellen waren gericht, wat endoderm cellen werden geëlektroporeerd. Dit kan zijn omdat DNA reikt tot het endoderm door openingen onder epiblast epitheel. Endoderm is opgebouwd uit epitheliale cellen en in onze ervaring these cellen hebben een grotere neiging tot het nemen van DNA. Bij de toepassing van deze techniek lot mapping, is het belangrijk te bepalen welke cellen oorspronkelijk DNA opnemen.
Ook moet worden opgemerkt dat, hoewel pCAG-GFP en pCAG-Cre: GFP plasmiden efficiënt kunnen worden geleverd met behulp van de elektroporatie parameters die in dit onderzoek is de efficiëntie van andere DNA-constructen kunnen variëren en moet individuele optimalisatie. Veranderingen in DNA-concentratie, elektroporatie spanning of het aantal pulsen kunnen worden gemaakt als plasmiden blijken moeilijk te transfecteren zijn.
Om samen te vatten, kunnen onze geoptimaliseerde capillaire elektroporatie systeem efficiënt en reproduceerbaar te leveren GFP of Cre: GFP plasmiden in een zeer klein aantal cellen in het embryo met een beperkte celdood. Aangezien deze methode niet duur of zeer gespecialiseerde apparatuur nodig is, kan het van groot nut voor cell tracking studies of bij het testen van het effect van ectopische expressie of voorwaardelijke verwijdering o wordenf genen in de vroege embryo's, wordt als elektroporatie uitgevoerd in embryo's uitvoeren floxed voorwaardelijke mutant allelen. Daarom is deze electroporatietechniek een nuttig functionele hulpmiddel om een cel per cel basis de rol van cel-intrinsieke factoren in de context van gelokaliseerde wildtype embryonale omgevingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Dumostar | T5390 | |
| Dissecting stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Stereomicroscope system with fluorescence | Nikon | AZ100 | |
| Inverted microscope with a digital camera | Olympus | Olympus BX61 | |
| Inverted confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
| Low melting point agarose | Life Technologies | 16520-050 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 11397863 | |
| 30mm Petri dishes | Fisher Scientific | 121V | |
| 4-well plates | Thermo scientific | 179820 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pipettes | NICHIRYO | Nichipet | |
| tips | Greiner Bio One | 685280 | |
| Cell culture incubator | SANYO | MCO-17AIC | |
| Roller culture apparatus | BTC Engineering | ||
| Syringe filters 0.45µm, sterile | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
| Sodium pyruvate solution | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
| Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
| Gas Cartridge for Portable Meker Burner | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
| Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Microforge | De Fonbrune | BS030301 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV830 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| ECM 830 square wave pulse generator | BTX | 45-0002 | |
| Green food coloring dye | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
| A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye | Biotium | 40060-T | |
| pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
| pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
| Multimeter | Excel | XL830L | |
| Micromanipulators | Leitz | ||
| 0.2mm diameter platinum wire | Agar Scientific | E404-2 | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | |
| Goat anti-Chicken IgY, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
| Liquid DAB+ Substrate Chromogen System | Dako | K3467 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
| A far-red fluorescence nuclear counterstain | Life Technologies | T3605 |
References
- O'Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists. Pulmonary med. , 894063 (2012).
- Brons, I. G., et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature. 448, 191-195 (2007).
- Tesar, P. J., et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature. 448, 196-199 (2007).
- Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation. Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).
- Sadik, M. M., et al. Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation. Biophys. J. 106, 801-812 (2014).
- Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).
- Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo. Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).
- Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation. JOP. 6, 128-135 (2005).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7, 107 (2007).
- Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation. Genesis. 35, 57-62 (2003).
- Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum. CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893 (2007).
- Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae. Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Nolkrantz, K., et al. Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary. Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).
- Mazari, E., et al. A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage. Development. 141, 2349-2359 (2014).
- Copp, A. J., Cockroft, D. L. Postimplantation mammalian embryos : a practical approach. , IRL Press. (1990).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).
- Wilson, V., Beddington, R. S. Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak. Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis. Dev Cell. 17, 365-376 (2009).
- Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent. Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).
- Tsakiridis, A., et al. Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors. Development. 141, 1209-1221 (2014).
- Gouti, M., et al. In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity. PLoS biology. 12, e1001937 (2014).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120, 613-620 (1994).
