Abstract
وقد أظهرت الأبحاث في البرمجة قبل الولادة في خنزير أن جنس الجنين أو الجنين يمكن أن تؤثر على نتائج تنموية. ولذلك، فإن القدرة على تحديد جنس الجنين هي ضرورية في العديد من التجارب وخاصة فيما يتعلق بالتنمية في وقت مبكر. يوضح هذا البروتوكول على إعداد وغير مكلفة وسريعة وغير سامة من خنزير الحمض النووي الجيني للاستخدام مع PCR. يوم 30 الأجنة يجب جمعت إنسانية وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها سياسة الحيوان المؤسسي ولجان الرعاية لهذا البروتوكول. إعداد جنين كامل لهذه التقنية [سإكسينغ PCR القائم ينطوي ببساطة طحن الجنين المجمد إلى مسحوق ناعم باستخدام هاون قبل المبردة ومدقة. يتم تحريرها DNA PCR الجودة من كمية صغيرة من مسحوق الجنين عن طريق تطبيق حضانة الساخنة في كاشف تحلل القلوية. بعد ذلك، يتم خلط محلول الحمض النووي مع العازلة تحييد وتستخدم مباشرة لPCR. يتم إنشاء اثنين من أزواج التمهيدي لDETECر الجنس محدد تحديد المنطقة من كروموسوم Y- (SRY) والمنطقة ZFX من كروموسوم X- مع دقة عالية وخصوصية. ويمكن تطبيق البروتوكول نفسه إلى الأجنة ممدود الأخرى (يوم 10 إلى يوم 14) في وقت سابق من يوم 30. أيضا، يمكن أن يتم هذا البروتوكول مع لوحات 96 حفر آبار-عند فحص عدد كبير من الأجنة، مما يجعل من الممكن لأتمتة وعالية سرعة الكتابة الجنس.
Introduction
أصبح الخنزير المحلي على البحوث الأساسية موضوع في التنمية، وعلم الوراثة والتغذية في القطاعين الإنسان والماشية. إمكانات الخنازير كنماذج الطبية للبحوث البشري يمكن أن يعزى إلى أوجه الشبه بينهما الفسيولوجية. في الثروة الحيوانية، ويمكن التلاعب في نسبة الجنس تعزيز فعالية اختيار والتحسين الوراثي برامج 1. مبالغات الأجنة الفردية هو أداة أساسية تستخدم في العديد من التحقيقات التجريبية بما في ذلك ولكن لا تقتصر على النمط الجيني، التخلق وتعطيل الصبغي X من إزدواج الشكل الجنسي أثناء تطور الجنين في وقت مبكر 2.
الدراسات على الفئران تشير إلى أن النظام الغذائي للأم وعوامل أخرى قد يؤدي إلى اختلال التوازن بين الجنسين 3. في الخنازير، أسباب الجنس نسبة الخلل تشمل سلالة الأب 4، قدرة الرحم 5، وحالة زرع الأيضية 6. منذ الاختلافات التي لوحظت في الأجنة والفضلات يمكن أن تتأثر حد ذاتهاxual إزدواج الشكل، يجب أن يكون الباحثون على علم الجنس الجنين ونسب الجنس قبل التوصل إلى استنتاجات بشأن أبحاثهم. تطوير أدوات وبروتوكولات فعالة لمبالغات أجنة الخنازير في يوم 30 من التطوير سوف تتم مناقشتها هنا.
وقد وضعت أساليب مختلفة من الكتابة الجنس للدراسات الجينية في الكائنات نموذج والثروة الحيوانية. ولا سيما في مجال الثروة الحيوانية، وتحديد الأجنة في وقت مبكر من الذكور والإناث هو ممارسة شائعة جدا لتعزيز الانتقاء الجيني لبرامج التربية. وقد استخدمت الأجنة المبكرة تنميط نووي في خنزير باستخدام بالغيمزا 7 أو مضان مكثفة 8،9 تقنيات الكتابة الجنس. ومع ذلك، وهذه الأساليب هي مضيعة للوقت وغير مناسبة لفحص أعداد كبيرة من الأجنة بسرعة وبدقة.
الأسلوب الأكثر فعالية الجنس في الكتابة هو تضخيم الحمض النووي باستخدام الحرارة مستقرة البلمرة DNA وزوج من الاشعال. [سإكسينغ الحمض النووي بطريقة PCR هو أكثر تحديدا، أسرع وأكثر دقة، ستتطلب نلي كمية ضئيلة من المواد الخلوية. تم إجراء أول سإكسينغ] الجنين PCR القائم على البشر 10، وبعد ذلك في الفئران 11، الأنعام 12، والجاموس والغنم 13 14 الأجنة ما قبل الزرع. في الخنزير، وقد تم تأسيسها في أقرب الجنس DNA طريقة الكتابة للأجنة ما قبل الزرع عبر زوج واحد من كروموسوم الاشعال DNA محددة 15. ومع ذلك، تم اختيار الاشعال PCR الأكثر شيوعا لتحديد الجنس من Y كروموسوم من الذكور محدد SRY الجين 16 وعدم الجنس المنطقة التمييزية من الجين الزنك الاصبع الموجود في كل من X و Y كروموسوم 17. وفي وقت لاحق، وقد تم تطبيق هذه الاشعال لتحديد جنس يوم 30 الأجنة في هذه الدراسة مع تحسين خصوصية الاشعال للكشف فقط كروموسوم X- من الجين الزنك الاصبع.
الحمض النووي الجيني من الأجنة ما قبل الزرع الخنازير يمكن استخلاصها من خلال تعريض أحد الكيسة سليمة لالعازلة مع proteinasه ك 16 أو عن طريق أخذ خزعة من عدد قليل من الخلايا من الانقسام في وقت مبكر الفردية الأجنة 15 واستخدامها لPCR المباشر. ومع ذلك، لم تفعل الإفراج عن الحمض النووي من دم الخنزير، الشعر، الأنسجة أو الحمل المستكن كبير على مدى بضعة سنتيمترات في الحجم على نحو فعال باستخدام بروتين طريقة K. تم إنشاء طرق استخلاص الحمض النووي لهذه المواد باستخدام إما تستغرق وقتا طويلا بروتوكولات الفينول / الكلوروفورم 6 أو مجموعات العمود مكلفة أساس 18. من أجل تجنب استخدام المواد الكيميائية السامة، هناك اتجاه لتطوير غير مكلفة، وطرق استخراج الحمض النووي سهلة وخالية من الفينول. تم تأسيس هذا النوع من بروتوكول لعزل PCR ذات جودة الحمض النووي الجيني من الماوس 19 و الزرد 20 الأنسجة باستخدام هيدروكسيد الصوديوم الساخن وتريس (البارع). وتقدم هذه الدراسة على بروتوكول للحصول على الحمض النووي مع تعديل البارع وإعادة تصميم أزواج التمهيدي دوبلكس للPCR الجنس كتابة مباشرة من الخلية لست] من يوم 30 الأجنة الخنزير معدقة عالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وفقا للمجلس الكندي للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان وبموافقة من سياسة الحيوان كلية ولجنة الرعاية الاجتماعية - تربية من جامعة ألبرتا، والموت الرحيم يزرع الحوامل من قبل الموظفين المدربين تدريبا في يوم تقريبا تم جمع 30 من الحمل والأجنة. استخدام قفازات الفحص في جميع الأوقات أثناء الإجراءات.
1. جمع العينات وتخزين العينات
- الموت ببطء زرع باستخدام الترباس الأسير تليها استنزاف. ارتداء قفازات الفحص لجمع مساحات الإنجابية والأجنة من كل زرع الموت الرحيم.
ملاحظة: مجموعة السريع العينات ونقل الأجنة لتجف والجليد أو النيتروجين السائل يؤدي في الأنسجة عالية الجودة للأعمال الجزيئية الأخرى مثل ميكروأري وQPCR. - تشريح الرحم وبلطف فصل كل الأجنة داخل أغشية المشيمة خارج الجنين الخاصة بهم من وراء جدار الرحم 21. تأكد من وجود أي تلوث الأنسجة الأمهات.
- إعادةطول الحبل ووزن كل الأجنة قابلة للحياة قبل التجميد.
- جمع كل جنين الفردي وعلى الفور اتمامه في رقائق الألومنيوم قبل المفاجئة تجميد مع النيتروجين السائل.
- نقل الأجنة المجمدة من النيتروجين السائل مباشرة إلى الثلاجة -80 درجة مئوية.
2. طحن الأجنة
- تسمية كل أنابيب العينة (15 مل) مع معرف عينة المطلوبة لعدد من العينات لتحليلها.
- ملء حاوية الحرارية مع الثلج الجاف لنصف كاملة وإدراج أنبوب عينة المسمى قبل في الثلج الجاف.
- ارتداء القفازات في فصل الشتاء مع زوج آخر من قفازات الفحص على رأس لنقل قذائف هاون قبل المبردة والمدقات من الفريزر -80 درجة مئوية لتجف الحاوية الجليد.
- وضع الجنين المجمد داخل هاون على الثلج الجاف.
- صب النيتروجين السائل كافية لتغطية الجنين وطحن مع مدقة إلى مسحوق ناعم.
- نقل مسحوق الجنين إلى أنبوب عينة المسمى قبل مع ميكرospatula (الشكل 1)، ووضع أنبوب في الفريزر -80 درجة مئوية.
- استخدام هاون قبل المبردة نظيفة ومدقة لكل الجنين وتغيير قفازات الفحص بعد طحن كل جنين لتجنب التلوث المتبادل بين العينات.
3. الجينوم تحضير الحمض النووي باستخدام التعديل هيدروكسيد الصوديوم الطريقة
- تسمية جميع أنابيب microcentrifuge (1.5 مل) اللازمة لعدد من العينات لتحليلها.
- نقل أنابيب العينات التي تحتوي على مسحوق الجنين من الفريزر -80 درجة مئوية إلى وعاء مع الثلج الجاف قبل البدء.
- ماصة 180 ميكرولتر من 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) في كل أنبوب microcentrifuge وصفت مسبقا.
- تشغيل حاضنة وقبل الحرارة إلى 95 درجة مئوية.
- استخدام المسواك لتحويل المبلغ الصحيح من مسحوق الجنين (حوالي 5-10 ملغ) (الشكل 2) من أنبوب العينة إلى أنبوب microcentrifuge وصفت ما قبل يحتوي على حل 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم.
- سحب شع نفس مسواك ببطء لتصور المحللة الحمض النووي باعتبارها لزجة، لزج، أبيض شفاف مثل مادة (الشكل 3).
- نقل أنابيب microcentrifuge مع المحللة الحمض النووي للحاضنة قبل ساخنة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. على الفور نقل أنبوب إلى مربع الستايروفوم مليئة الجليد.
- إضافة 20 ميكرولتر من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك مباشرة في أنبوب microcentrifuge ومزجها من خلال استغلال بلطف الأنبوب. استخدام ورقة الرقم الهيدروجيني للتأكد من درجة الحموضة ما يقرب من 8.0 (الشكل 4) قبل الطرد المركزي.
ملاحظة: عند التعامل مع عدد كبير من الاستعدادات العينة، كان مقبولا لاختيار عشوائيا بعض العينات للتأكد من درجة الحموضة. - أنبوب الطرد المركزي مع المحللة الحمض النووي في 2000 x ج في microcentrifuge لمدة دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة الحطام الأنسجة غير منحل.
- نقل 150 ميكرولتر من كبار طاف واضح في أنبوب جديد أو 96 لوحات جيدة.
ملاحظة: المحللة الحمض النووي واضح على استعداد لاستخدامها كقالب في الكمبيوترR رد فعل وأنها مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوعين، أو أنها يمكن أن تبقى عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة عام.
الاشعال PCR 4. تصميم جنس محددة
- الحصول على أرقام الانضمام لممارسة الجنس لحم الخنزير المنطقة تحديد Y (SRY) (NM_214452.3) ووالجينات (ZFX) بروتين اصبع الزنك العاشر مرتبطة (XM_005673501.1) من NCBI موقع http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
- نسخ ولصق هذه الأرقام الانضمام NCBI إلى أداة التصميم التمهيدي على الانترنت.
ملاحظة: أفضل المعلومات الاشعال بما في ذلك طول، تيم وGC٪ وكذلك حجم المنتج PCR (بي بي) سيتم إنشاؤها على شاشة الكمبيوتر (الشكل 5). - التحقق من صحة خصوصية هذه الاشعال باستخدام برنامج النوكليوتيدات انفجار (Blastn) ضد الحالية قاعدة بيانات الجينوم الخنازير 104 لضمان تقع هذه المتتاليات فقط على X و Y كروموسوم لSRY وZFX على التوالي (الشكل 6).
5. الجينوم الحمض النووي PCR مباشرة من الحمض النووي لست]
- استعمالفقط 1 ميكرولتر من المحللة DNA كقالب ل15 ميكرولتر تفاعل PCR.
ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها طريقة فحص إنتاجية عالية لوحات 96-جيدا PCR بطريقة مماثلة باستخدام ماصة الأقنية. - قم بما يلي لمجرد PCR الأول: إعداد أنبوب PCR واحد للسيطرة سلبية أي قالب واثنين من أنابيب إضافية لعناصر إيجابية بإضافة 1 ميكرولتر (0.5 نانوغرام) من الحصول عليها تجاريا الجنس المعروف الحمض النووي الجيني الخنازير. وفي وقت لاحق، وتشمل عينة من آخر تحليل [سإكسينغ ناجحة كعنصر تحكم إيجابية وتشغيل جنبا إلى جنب مع تفاعل PCR جديد لتحديد الجنس.
- استخدام أي HotStart الجاهزة PCR الإنزيم وإعداد مزيج الرئيسي بإضافة الاشعال والمياه مجانا nuclease اعتمادا على عدد من ردود الفعل PCR. إضافة 1 ميكرولتر من المحللة الحمض النووي في أنبوب PCR الموجودة من قبل مع 14 ميكرولتر من مزيج الرئيسي PCR. إضافة الاشعال مثل هذا التركيز النهائي للالاشعال من اثنين من الجينات الجنس محدد هو 0.3 ميكرومتر في مجموعه 15 ميكرولتر PCR صeaction.
- إعداد برنامج PCR التالية في cycler الحرارية: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 35 دورات كل منها ذوبان خطوة 20 ثانية 98 درجة مئوية، تليها خطوة الصلب 15 ثانية عند 65 درجة مئوية، تليها خطوة استطالة 15 ثانية عند 72 درجة مئوية. في الخطوة الأخيرة، احتضان ردود الفعل ل 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية، والاستمرار في احتضان عند 4 درجات مئوية حتى إزالة أنبوب PCR للتحقق من هلام الكهربائي لتحديد الجنس.
ملاحظة: شروط الاسترداد والأمثل وفقا لدليل لعدة PCR المذكورة في الجدول المواد. - إضافة كمية مناسبة من غير سامة الدفيئة SYBR الفلورسنت هلام الحمض النووي وصمة عار عند إعداد 2٪ TBE هلام الاغاروز.
ملاحظة: يمكن أن تكون بديلا بروميد إيثيديوم لوصمة عار الفلورسنت الدفيئة إذا لم يكن متوفرا. - إضافة 1.5 ميكرولتر من صبغ تحميل (10X) في أنبوب PCR ومزيج جيد من قبل pipetting المخزن المؤقت رد فعل PCR صعودا وهبوطا.
- تحميل 10 ميكرولتر من العينة إلى البئر وصالامم المتحدة agarose هلام مع إعدادات الجهد المناسب (جهاز هلام صغير في 100 فولت، جهاز هلام 96-جيدا في 150 V حتى الفرقة صبغ يدير نصف الطريق من خلال هلام).
- مراقبة وضبط العصابات شدة تحت الإعداد ضوء الفلورسنت باستخدام الليزر الماسح الضوئي والتقاط صورة من هلام. ملاحظة: يمكن أن تكون بديلا تصوير هلام المشترك للهلام بروميد إيثيديوم.
- تحديد جنس الأجنة الخنازير عن طريق تحديد الأجنة مع فرقة واحدة بوصفها أنثى وشريطين كما ذكر (الشكل 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد نتيجة ممثل تحديد الجنس من 345 الحمض النووي لست] فحص بواسطة PCR في الشكل 7 وتلخيصها في الجدول 1.
كما يمكن أن يرى في الشكل 7، ودرجة الحرارة التمهيدي الصلب عند 65 درجة مئوية هي الظروف المثلى في هذا البروتوكول PCR توليد كثافة مماثلة والأحجام amplicon مبنية (الشكل 5) بين عينات مختلفة.
يتم عرض اثنين من المنتجات تضخيم SRY (400 بي بي) وZFX (506 بي بي) في الصورة هلام (الشكل 7). وأظهرت الأجنة الذكور اثنين شظايا الحمض النووي مع حجم الصحيح من الجزء العلوي (400 بي بي) وانخفاض (506 بي بي) العصابات. وتبين أن شدة هذه العصابات اثنين لتكون على قدم المساواة في الأفراد الأكثر الذكور. أظهر جميع الأجنة الإناث سوى جزء واحد الحمض النووي المقابلة لهذا الجين ZFX تقع فيكروموسوم اكس.
لست] الحمض النووي التي تم الحصول عليها من تعديل 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم يمكن استخدامها مباشرة لPCR مع نسبة نجاح عالية ودقة. لم لست] DNA لا تظهر أي رد فعل PCR تثبيط بعد فحص 345 الأجنة. وكان ثلاثة أشخاص فقط لا تلاعب وكانت نسبة الأجنة الإناث أعلى قليلا من الذكور (الجدول 1).
الشكل 1: نقل الأجنة مسحوق نقل مسحوق الجنين إلى أنبوب 15 مل.
الشكل 2: جمع ونقل مسحوق الأجنة مع المسواك (أ) مبلغ المفرط للجنين مسحوق التمسك مسواك. (ب) المبلغ الصحيح لل مسحوق الجنين التمسك مسواك على أن يتم تحويلها إلى حل تحلل كاشف القلوية. (ج) مبلغ كاف من مسحوق الجنين التمسك مسواك.
الشكل (3): الحمض النووي التصور تقنية ببطء سحب ما يصل مسواك، بعد إضافة مسحوق الجنين، لتحديد ما إذا كان الحمض النووي الجنين قد حلت باعتبارها لزجة لزج أبيض شفاف مثل مادة.
الرقم 4: الرقم الهيدروجيني تأكيد (أ) الرقم الهيدروجيني للمحلول هيدروكسيد الصوديوم (القلوية تحلل الكاشف) هو 12.0. (ب) بعد عازلة بالإضافة تحييد لتحلل العازلة، دلالة اللون الأس الهيدروجيني ورقة خضراء، وينبغي أن يكون الأس الهيدروجيني حوالي 8.0.
= "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الرقم 5: أسماء تسلسل-جنس محدد معلومات التمهيدي، سلاسل وطول amplicon تم الحصول عليها من أداة التصميم التمهيدي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: رسم خرائط الترب-جنس معين الخنازير على كروموسوم X و Y. (A) المكان من الأمام وعكس الاشعال محددة على الجين ZFX. (ب) موقع وإلى الأمام وعكس الاشعال محددة على الجين SRY. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7: PCR التضخيم من الجينات-جنس معين الخنازير من يوم 30 الأجنة يشار إلى 2٪ هلام TBE الاغاروز ملطخة SYBR الحمض النووي جل وصمة عار مع الضوابط الإيجابية المعروفة مع الذكور والإناث حرف. وأشارت شريطين كما الذكور وفرقة واحدة الإناث. وأشارت نجمة داود الحمراء تلوث عينة من الممكن في البئر مع مظهر أقل الفرقة خافت جدا (400 بي بي) مقارنة مع الشريط العلوي (506 بي بي) المنتج PCR الناجمة عن SRY الاشعال Y محددة. السهم الأحمر يشير إلى أي قالب PCR السيطرة السلبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مبالغات PCR | عدد جنين | |
| ♀ | 185 | 53.60٪ |
| ♂ | 157 | 45.50٪ |
| غير معروف | 3 | 0.90٪ |
| مجموع | 345 | 100٪ |
الجدول 1: النسبة المئوية للأنثى، ذكر وغير معروف بعد PCR مبالغات بين 345 يوم 30 الأجنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معظم البروتوكولات القائمة المتصلة الخنازير الأجنة الحمض النووي الجنس في الكتابة هي مناسبة فقط للمرحلة الأولى مرحلة ما قبل الزرع 15،16. لقد نجحت في تطوير بروتوكول مناسبة لفحص الجنين الخنازير في أواخر الحمل. استنادا إلى دراسات مع مراحل نمو مماثلة من الأجنة من الدراسات السابقة 6،18، ويعتبر هذا البروتوكول ليكون أكثر أمنا والتكلفة المنخفضة.
هذا البروتوكول هو أيضا مناسبة لعدد كبير من العينات لكتابة الجنس باستخدام PCR عن طريق تحويل من لست] الحمض النووي في 96 لوحة جيدا. يسمح شكل لوحة فحص عالية الإنتاجية عن طريق السماح بنقل 1 ميكرولتر من المحللة الحمض النووي للتفاعل PCR باستخدام ماصة الأقنية.
ومع ذلك، ينبغي أن يتم على عدة خطوات تشارك في الإجراء بعناية. من أجل إجراء تعديل 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم طريقة تحلل بشكل أكثر كفاءة، وإلى أن تقوم على أساس الجنين المجمد بشكل فردي إلى مسحوق ناعمباستخدام قبل المبردة (-80 درجة مئوية) هاون ومدقة. تجنب إراقة مسحوق الجنين على الثلج الجاف، وذلك برفق وببطء كشط مسحوق في أنبوب 15 مل، كما هو مبين في الشكل 1. تغيير قفازات الفحص بعد ينصح بشدة كل عينة لتجنب مسحوق على قفاز نقل لنموذج جنين أخر.
كمية مناسبة من مسحوق الجنين التي يمكن ان تضاف الى حل تحلل 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم تعديل في الشكل 2B. ويرد مبلغ المفرط من مسحوق الجنين في الشكل 2A ويجب تجنبها. وبالمثل، في الشكل 2C، وكمية من مسحوق الجنين يمكن أن تكون كافية لإجراءات المصب. على الرغم من أن وزنها مسحوق الجنين لكل عينة من الممكن، فإنه ليس من العملي عند فحص جنس الجنين في دراسة واسعة شملت أكثر من مائة الأجنة.
كمية من الحمض النووي يمكن التحقق بشكل واضح استخدام المسواك للتحقق من وز زجةمادة ooey مثل كما هو مبين في الشكل (3)، وإذا كان من المشكوك فيه ما إذا تم إضافة كمية مناسبة من مسحوق في الخطوة السابقة.
إضافة كمية مناسبة من حل معادلة مهمة بعد الناشر مسحوق الجنين. ويبين الشكل (4) وتغيير درجة الحموضة بعد وقبل إضافة حل التعادل. هذه الخطوة مهمة للتأكد من أن درجة الحموضة القلوية قليلا (حوالي 8.0)، وبالتالي على غرار معظم مخازن تفاعل PCR.
خصوصية الاشعال بنسبة ضئيلة هي العنصر الأكثر أهمية بالنسبة للدقة [سإكسينغ الحمض النووي خلال PCR. ويمكن التأكد من خصوصية الاشعال بنسبة ضئيلة من خلال برنامج NCBI Blastn. سيتم الكشف عن موقع واحد على الكروموزوم (اكس) في المنطقة 3 'غير الترميز من الجينات ZFX لكل تسلسل التمهيدي (الشكل 6A) للإناث. تم الكشف عن حالة مماثلة فقط على الصبغي Y في المنطقة ترميز الجين SRY (الشكل 6B
نسبة الخطأ بسبب عدم تحديد الجنس يمكن أن تكون منخفضة جدا (<1٪) كما هو مبين في الجدول رقم 1، عندما تسير جميع الخطوات بعناية وبشكل صحيح. ومع ذلك، في بعض الحالات النادرة، التلوث المتبادل بين لست] الحمض النووي اثنين من عينات مختلفة ممكن ويمكن الكشف عن PCR كما هو مبين مع نجمة داود الحمراء في هلام (الشكل 7). هذا النوع من نمط النطاقات في الإناث يمكن أن تفسر على أنها التلوث مع عينة الذكور.
فمن غير المرجح أن ظهور الشريط السفلي باهتة جدا ويرجع ذلك إلى المنافسة التمهيدي للمواد PCR. في هذه الحالة amplicon أصغر (400 بي بي) المتعلقة الجين SRY سوف تولد المزيد من PCR المنتجات أسرع من أعلى الفرقة المقابلة لهذا الجين ZFX. في هذا البروتوكول، وعيب واحد هو تقرير من التلوث من عينة الذكور مع الإناث. لأن هدفنا الرئيسي هو ليس الكمي في عدد النسخ لكل الجينات المستهدفة، وهي صغيرةأن كمية من مسحوق من عينة الإناث لا يكون من السهل تصور على هلام.
بروتوكول الحمض النووي [سإكسينغ المقدمة هنا هو الأكثر تكلفة طريقة فعالة لتحديد جنس الجنين في أواخر الحمل، ويمكن تطبيقها على الآخرين الحيوانات الماشية الكبيرة مثل الأبقار والماعز والأغنام. أيضا، تم تطبيق مماثل طريقة الحمض النووي [سإكسينغ الخنازير المتعلقة يزرع الأيضية حالة 18. التحقيق في الأبحاث آخر باستخدام الحمض النووي [سإكسينغ يمكن تطبيقها على دراسة آلية يطبع الجينومية خلال البرمجة قبل الولادة التنمية ما بعد الولادة في خنزير 22. وهناك مجموعة واسعة من التطبيقات في مجال الثروة الحيوانية باستخدام الحمض النووي PCR سإكسينغ] ممكن مثل برامج التربية اختيار ما قبل ممارسة الجنس، وآثار جينية التغذية والأمراض المعدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أن نعترف التعاون والمساهمات المالية من وكالة تمويل البحوث التالية: ألبرتا الثروة الحيوانية واللحوم وكالة المحدودة، CRC لحم الخنزير، ألبرتا لحم الخنزير، Hypor شركة هندريكس علم الوراثة وNSERC CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
References
- Seidel, G. E. Economics of selecting for sex: the most important genetic trait. Theriogenology. 59, 585-598 (2003).
- Gutiérrez-Adán, A., et al. Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development. Reprod. Domest. Anim. 41, Suppl 2. 54-62 (2006).
- Rosenfeld, C. S., Roberts, R. M. Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review. Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).
- Gorecki, M. T. Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758). Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).
- Chen, Z. Y., Dziuk, P. J. Influence of initial length of uterus per embryo and gestation stage on prenatal survival, development, and sex ratio in the pig. J. Anim. Sci. 71, 1895-1901 (1993).
- Vinsky, M. D., Novak, S., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Foxcroft, G. R. Nutritional restriction in lactating primiparous sows selectively affects female embryo survival and overall litter. Reprod. Fertil. Dev. 18, 347-355 (2006).
- Cassar, G., King, W. A., King, G. J. Influence of sex on early growth of pig conceptuses. J. Reprod. Fertil. 101, 317-320 (1994).
- Zudova, D., Rezacova, O., Kubickova, S., Rubes, J. Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 102, 179-183 (2003).
- Hornak, M., Oracova, E., Hulinska, P., Urbankova, L., Rubes, J. Aneuploidy detection in pigs using comparative genomic hybridization: from the oocytes to blastocysts. PLoS One. 7, (2012).
- Handyside, A. H., Pattinson, J. K., Penketh, R. J., Delhanty, J. D., Winston, R. M., Tuddenham, E. G. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet. 1, 347-349 (1989).
- Wilton, L. J., Shaw, J. M., Trounson, A. O. Successful single-cell biopsy and cryopreservation of preimplantation mouse embryos. Feri. Steril. 51, 513-517 (1989).
- Peura, J. M., Turunen, M., Janne, J. A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction. Theriogenology. 35, 547-555 (1991).
- Rao, K. B., Pawshe, C. H., Totey, S. M. Sex determination of in vitro developed buffalo (Buhalus buhalis.) embryos by DNA amplification. Mol. Reprod. Dev. 36, 291-296 (1993).
- Herr, C. M., Matthaei, K. I., Petrzak, U., Reed, K. C. A rapid Y-chromosome-detecting ovine embryo sexing assay. Theriogenology. 33, 245 (1990).
- Fajfar-Whetstone, C. J., LaneRayburn, A., Schook, L. B., Wheeler, M. B. Sex determination of porcine during preimplantation embryos via y-chromosome specific DNA sequences. Animal Biotechnology. 4, 183-193 (1993).
- Pomp, D., Good, B. A., Geisert, R. D., Corbin, C. J., Conley, A. J. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim. Sci. 73, 1408-1415 (1995).
- Aasen, E., Medrano, J. F. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Biotechnology (N Y). 8, 1279-1281 (1990).
- Oliver, G., et al. Restricted feed intake in lactating primiparous sows. II. Effects on subsequent litter sex ratio and embryonic gene expression. Reprod Fertil. Dev. 23, 899-911 (2011).
- Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R. L., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29, 52-54 (2000).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos. Biotechniques. 43, 610-614 (2007).
- Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts. Animal. 8, 293-299 (2014).
- Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L. Prenatal programming of postnatal development in the pig. Control of Pig Reproduction VIII. Rodriguez-Martinez, , Nottingham University Press. 212-213 (2009).
