Abstract
La ricerca sulla programmazione prenatale nel maiale ha dimostrato che il sesso dell'embrione in via di sviluppo o il feto può influenzare il risultato dello sviluppo. Pertanto, la capacità di determinare il sesso di un embrione è necessario in molti esperimenti particolarmente per quanto riguarda lo sviluppo iniziale. La presente protocollo dimostra una preparazione poco costoso, rapido e non tossica di maiale DNA genomico per l'uso con PCR. Giorno 30 embrioni devono essere umanamente raccolti secondo le linee guida stabilite dal Istituzionale politica degli animali e dei Comitati Welfare per il presente protocollo. La preparazione di tutta embrione di questa tecnica sessaggio PCR comporta semplicemente macinazione l'embrione congelato per una polvere fine con una malta pre-raffreddata e pestello. DNA PCR-qualità è rilasciato da una piccola quantità di polvere embrione applicando una incubazione caldo in un reagente di lisi alcalina. Successivamente, la soluzione di DNA viene miscelata con il tampone di neutralizzazione e utilizzato direttamente per PCR. Due coppie di primer sono generati al DATECdeterminato sesso t determinazione regione del cromosoma Y (SRY) e regione ZFX del cromosoma X con elevata precisione e specificità. Lo stesso protocollo può essere applicato ad altri embrioni di forma allungata (10 ° giorno al 14 ° giorno) più di giorno 30. Inoltre, questo protocollo può essere effettuato con piastre a 96 sgorgava quando lo screening di un gran numero di embrioni, rendendo così possibile per l'automazione e di alta tipizzazione del sesso il throughput.
Introduction
Il maiale domestico è diventato un soggetto di ricerca fondamentale nello sviluppo, la genetica e l'alimentazione in entrambi i settori umani e del bestiame. Il potenziale dei suini come modelli biomedici per la ricerca umana può essere attribuito alla loro somiglianze fisiologiche. Nel bestiame, la manipolazione del rapporto tra i sessi può migliorare l'efficacia di selezione e miglioramento genetico programmi 1. Sexing singoli embrioni è uno strumento fondamentale utilizzato in molte indagini sperimentali inclusi ma non limitati al genotipo, epigenetica e X inattivazione di dimorfismo sessuale durante lo sviluppo embrionale precoce 2.
Studi nei topi suggeriscono che la dieta materna e altri fattori possono causare squilibrio di genere 3. Nei suini, cause di rapporto tra i sessi squilibrio includono razza paterna 4, la capacità uterina 5, e la condizione metabolica della scrofa 6. Dal momento che le differenze osservate negli embrioni e cucciolate possono essere influenzati da séxual dimorfismo, i ricercatori devono essere consapevoli del sesso dell'embrione e rapporti sessuali prima di trarre conclusioni per quanto riguarda la loro ricerca. Lo sviluppo di strumenti e protocolli efficienti per sessaggio degli embrioni di maiale al giorno 30 di sviluppo sarà discusso qui.
Vari metodi di tipizzazione del sesso sono stati sviluppati per studi di genetica in organismi modello e bestiame. In particolare nel bestiame, individuando maschili e femminili embrioni precoci è una pratica molto comune per migliorare la selezione genetica per programmi di allevamento. I primi embrioni cariotipo nel maiale con Giemsa 7 o l'intensa fluorescenza 8,9 tecniche sono state utilizzate per la tipizzazione del sesso. Tuttavia, questi metodi sono molto tempo e non è adatto per lo screening gran numero di embrioni modo rapido e preciso.
Il metodo di tipizzazione sesso più efficace è l'amplificazione del DNA mediante una stabile al calore DNA polimerasi e una coppia di primers. sessaggio DNA mediante PCR è più specifico, rapido e sensibile, oolo che richiede una quantità minima di materiali cellulari. Il primo embrione sessaggio PCR-based è stata eseguita su esseri umani 10, e poi in topi 11, bovini, bufali 12 13 e pecore 14 embrioni pre-impianto. Nel maiale, il più antico metodo di tipizzazione del DNA sesso è stato stabilito per gli embrioni pre-impianto attraverso una singola coppia di cromosoma Y primer DNA specifico 15. Tuttavia, i primer PCR più comuni per la determinazione del sesso sono stati selezionati dal cromosoma Y del maschio specifico gene SRY 16 e la regione discriminativa non sesso di un gene zinc-finger posti sui lati X e Y cromosoma 17. Successivamente, questi primer sono stati applicati per determinare il sesso del giorno 30 embrioni in questo studio con una migliore specificità dei primers per rilevare solo il cromosoma X di un gene zinc-finger.
DNA genomico da suini embrioni pre-impianto può essere estratto esponendo una blastocisti intatto di tamponare con proteinase K 16 o prendendo una biopsia di alcune cellule dal singolo scissione precoce embrioni 15 e li utilizzano per la PCR diretta. Tuttavia, rilascio di DNA da sangue suino, capelli, tessuti o un grande conceptus sopra alcuni centimetri di dimensione non è effettivamente fatto usando il metodo di proteinasi K. Metodi di estrazione del DNA per questi materiali sono stati stabiliti utilizzando sia in termini di tempo protocolli di fenolo / cloroformio 6 o kit basati costoso colonna 18. Per evitare l'uso di sostanze chimiche potenzialmente tossiche, vi è una tendenza a sviluppare economici, metodi di estrazione del DNA facile e senza fenolo. Questo tipo di protocollo per l'isolamento di DNA genomico PCR qualità di topo 19 e 20 zebrafish tessuti è stata stabilita utilizzando idrossido di sodio calda e Tris (Hotshot). Questo studio fornisce un protocollo per ottenere DNA con modificati Hotshot e ridisegnato coppie di primer per PCR duplex sesso digitando direttamente dai lisati cellulari di Giorno 30 embrioni di suini conalta precisione.
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Protocol
In accordo con il Consiglio canadese sugli orientamenti cura degli animali e con l'approvazione della Politica degli animali Facoltà e del Comitato Welfare - Bestiame della University of Alberta, scrofe gravide sono stati sacrificati da personale addestrato a circa Giorno 30 di gravidanza e gli embrioni sono stati raccolti. Utilizzare guanti da esplorazione in qualsiasi momento durante le procedure.
1. Raccolta e conservazione del campione del campione
- Euthanize scrofa con proiettile captivo seguito da dissanguamento. Indossare guanti da esplorazione per raccogliere i tratti riproduttivi e embrioni da ogni scrofa eutanasia.
Nota: raccolta rapida dei campioni e degli embrioni di trasferimento di ghiaccio secco o azoto liquido si tradurrà in tessuti di qualità più elevati per altre opere molecolari come microarray e qPCR. - Sezionare l'utero e separare delicatamente tutti gli embrioni all'interno delle loro membrane placentari extraembrionali dalla sottostante parete uterina 21. Assicurarsi che non vi è alcuna contaminazione dei tessuti materni.
- Rilunghezza del cavo e peso di tutti gli embrioni vitali prima del congelamento.
- Raccogliere ogni singolo embrione e immediatamente avvolgerlo in un foglio di alluminio prima di scatto congelamento con azoto liquido.
- Trasferire gli embrioni congelati da azoto liquido direttamente a un -80 ° C freezer.
2. Gli embrioni Grinding
- Etichettare tutte le provette dei campioni (15 ml) con l'ID campione necessaria per il numero di campioni da analizzare.
- Riempire contenitore termico con ghiaccio secco per mezzo pieno e inserire il tubo pre-etichettato campione nel ghiaccio secco.
- Indossare guanti invernali con un altro paio di guanti da esplorazione sulla parte superiore per il trasferimento dei mortai e pestelli pre-refrigerati da -80 ° C freezer per asciugare contenitore del ghiaccio.
- Posizionare l'embrione congelato all'interno del mortaio sul ghiaccio secco.
- Versare azoto liquido sufficiente a coprire l'embrione e macinare con il pestello in una polvere finissima.
- Trasferire la polvere embrione di una provetta di pre-marcato con un MICRospatula (Figura 1) e posizionare il tubo in un congelatore C -80 °.
- Utilizzare un mortaio e pestello pulito pre-raffreddata per ogni embrione e cambiare i guanti da esplorazione dopo la rettifica ogni embrione per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni.
3. Il DNA genomico Preparazione Utilizzo Modificato idrossido di sodio Metodo
- Label tutte le provette da microcentrifuga (1,5 ml) necessari per il numero di campioni da analizzare.
- Trasferire le provette per campioni contenenti polvere embrione dal -80 ° C freezer a un contenitore con ghiaccio secco prima di iniziare.
- Pipetta 180 ml di 50 mM NaOH (idrossido di sodio) in ogni provetta pre-etichettati microcentrifuga.
- Attivazione di un incubatore e pre-riscaldamento a 95 ° C.
- Usare uno stuzzicadenti per trasferire la giusta quantità di polvere dell'embrione (5-10 mg) (Figura 2) dal tubo campione in una provetta pre-etichettato contenente la soluzione 50 mM NaOH.
- Pull up stesso stecchino lentamente per visualizzare il lisato DNA come un appiccicoso, appiccicoso, sostanza bianca trasparente simile (figura 3).
- Trasferire le provette da microcentrifuga con lisato DNA per l'incubatore pre-riscaldato a 95 ° C per cinque minuti. Trasferire immediatamente il tubo di una scatola di polistirolo pieno di ghiaccio.
- Aggiungere 20 ml di 1 M Tris-HCl direttamente nella provetta e mescolare picchiettando delicatamente il tubo. Utilizzare carta pH per assicurare il pH è di circa 8,0 (Figura 4) prima della centrifugazione.
Nota: Quando si tratta di un gran numero di preparazioni del campione, è accettabile per raccogliere in modo casuale alcuni campioni per verificare il pH. - Centrifugare la provetta con il lisato DNA a 2.000 xg in una microcentrifuga per due minuti a temperatura ambiente per rimuovere i residui di tessuto non disciolto.
- Trasferimento 150 ml di surnatante superiore chiaro in un nuovo tubo o 96 pozzetti.
Nota: Il lisato DNA chiaro è pronto per l'uso come un modello in PCreazione R ed è stabile a 4 ° C per due settimane, oppure può essere conservato a -20 ° C per un anno.
4. Progettare sesso-specifici primer PCR
- Ottenere i numeri di adesione per regione determinare il sesso dei suini Y (SRY) (NM_214452.3) e e geni delle proteine zinc finger X-linked (ZFX) (XM_005673501.1) dal sito NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
- Copia e incolla questi numeri di adesione NCBI ad uno strumento di progettazione Primer on-line.
Nota: Le migliori informazioni primer tra cui lunghezza, Tm e GC% e dimensioni del prodotto di PCR (bp) verrà generato sullo schermo del computer (Figura 5). - Convalida la specificità di questi primer utilizzando il programma nucleotide Blast (Blastn) contro la corrente suina banca dati genomica 104 per garantire queste sequenze si trovano solo su X e cromosoma Y rispettivamente SRY e ZFX (Figura 6).
5. Il DNA genomico PCR Direttamente dal DNA lisati
- Usosolo 1 ml di lisato DNA come modello per un 15 microlitri reazione PCR.
Nota: Un metodo di screening ad alto rendimento per piastre a 96 pozzetti PCR può essere eseguita in modo simile usando una pipetta multicanale. - Effettuare le seguenti operazioni solo per la prima PCR: preparare un tubo di PCR per il modello senza controllo negativo e due tubi aggiuntivi per controlli positivi con l'aggiunta di 1 ml (0,5 ng) di commercialmente ottenuto sesso noto DNA genomico suina. In seguito, su un campione dalla ultima analisi sessaggio successo come controllo positivo e girare con la nuova reazione PCR per la determinazione del sesso.
- Utilizzare qualsiasi HotStart Ready Mix PCR enzima e preparare una master mix con primer aggiungendo e nucleasi acqua libera a seconda del numero totale di reazioni PCR. Aggiungere 1 ml di lisato DNA in un tubo di PCR preesistente con 14 microlitri della master mix PCR. Aggiungere primer tale che la concentrazione finale dei primer da due geni specifici per il sesso è di 0,3 micron di totale di 15 microlitri PCR reaction.
- Impostare il seguente programma PCR in un termociclatore: 95 ° C per 3 min, 35 cicli ciascuno con una fusione passo 20 sec a 98 ° C, seguita da una fase di ricottura 15 sec a 65 ° C, seguita da una fase di allungamento 15 sec a 72 ° C. Nella fase finale, incubare le reazioni per 1 min a 72 ° C e continuare ad incubare a 4 ° C fino alla rimozione del tubo PCR per la verifica elettroforesi su gel per determinare il sesso.
Nota: condizioni di PCR e l'ottimizzazione sono secondo il manuale del kit PCR indicato nella tabella materiali. - Aggiungere la quantità appropriata di serra SYBR fluorescente gel DNA macchia non tossici durante la preparazione di un gel di agarosio al 2% TBE.
Nota: il bromuro di etidio può essere sostituito per macchia fluorescente serra se non è disponibile. - Aggiungere 1,5 ml di tintura di carico (10x) nel tubo PCR e mescolare bene pipettando il tampone di reazione PCR su e giù.
- Caricare 10 ml di campione nel pozzetto e run gel di agarosio con impostazioni di tensione appropriate (apparato gel piccola a 100 V, apparecchi gel 96 pozzetti a 150 V fino banda colorante corre metà del gel).
- Osservare e regolare le bande intensità sotto la luce fluorescente impostazione utilizzando uno scanner laser e catturare un'immagine del gel. Nota: imager gel comune può essere sostituito per il gel di bromuro di etidio.
- Determinare il sesso degli embrioni di suini, identificando gli embrioni con una banda come una femmina e due bande come un maschio (Figura 7).
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Representative Results
Un risultato rappresentativo della determinazione sesso da 345 DNA lisati di screening mediante PCR è mostrata in Figura 7 e riassunti nella Tabella 1.
Come si vede in figura 7, la temperatura primer ricottura a 65 ° C è la condizione ottimale in questo protocollo PCR generare intensità simile e dimensioni ampliconi basa (Figura 5) tra campioni differenti.
Due prodotti amplificati di SRY (400 bp) e ZFX (506 bp) sono mostrati in figura gel (Figura 7). embrioni di sesso maschile hanno mostrato due frammenti di DNA con la dimensione corretta della parte superiore (400 bp) e (506 bp) fasce più basse. L'intensità di questi due bande ha dimostrato di essere uguali in individui più maschi. Tutti gli embrioni femminili mostrato solo un singolo frammento di DNA corrispondente al gene ZFX situato nelCromosoma X.
lisati DNA ottenuti dal modificato 50 mM NaOH possono essere usate direttamente per PCR con un alto tasso di successo e precisione. lisati DNA non hanno mostrato alcuna inibizione reazione PCR dopo lo screening 345 embrioni. Solo tre individui non erano sessuata e la percentuale di embrioni di sesso femminile era leggermente superiore rispetto ai maschi (Tabella 1).
Figura 1:. Embryo Transfer polvere Trasferimento in polvere embrione in una provetta da 15 ml.
Figura 2: Raccolta e trasferimento di embrioni in polvere con uno stuzzicadenti (A) Una quantità eccessiva di embrione in polvere aderente alla stuzzicadenti.. (B) quantità corretta diPolvere embrione aderendo alla stecchino da trasferire alla soluzione di lisi reagente alcalino. (C) Una insufficiente quantità di polvere embrione aderente al stuzzicadenti.
Figura 3:. Tecnica di visualizzazione del DNA lentamente tirare su stuzzicadenti, dopo aver aggiunto la polvere embrione, per determinare se il DNA dell'embrione si è sciolta come un appiccicoso bianco sostanza trasparente simile appiccicoso.
Figura 4:. PH conferma (A) pH della soluzione di idrossido di sodio (alcalino reagente di lisi) è 12.0. (B) Dopo tampone aggiunta di neutralizzazione al tampone di lisi, indicazione di colore di carta pH è verde e il pH dovrebbe essere di circa 8,0.
Figura 5:.. I nomi specifica sequenza-Sex Informazioni Primer, sequenze e la lunghezza amplicon ottenuto dal strumento di progettazione fondo Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Mappatura dei Suini primer specifici sesso sul cromosoma X e Y. (A) Posizione del avanti e invertiti primer specifici sul gene ZFX. (B) Posizione del avanti e invertita primer specifici sul gene SRY. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7:. PCR amplificazione di Suini geni specifici sesso sin dal primo giorno 30 embrioni 2% gel TBE agarosio colorato con SYBR DNA gel macchia con i noti controlli positivi sono indicati con i simboli maschili e femminili. Due bande indicati come i maschi e una singola banda come femmine. Red star indicata la possibile contaminazione del campione nel pozzetto con la comparsa di una debole banda inferiore (400 bp) rispetto alla banda superiore (506 bp) prodotto di PCR causata da SRY primer Y-specifici. Freccia rossa indica il modello senza PCR controllo negativo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| sexing PCR | Conte embrione | |
| ♀ | 185 | 53.60% |
| ♂ | 157 | 45.50% |
| Sconosciuto | 3 | 0,90% |
| Totale | 345 | 100% |
Tabella 1: Percentuale di Donna, Uomo e sconosciuta dopo PCR Sexing tra 345 Giorno 30 embrioni.
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Discussion
La maggior parte dei protocolli esistenti relativi alla suina embrioni DNA tipizzazione sesso sono adatti solo per la fase precoce fase di pre-impianto 15,16. Abbiamo sviluppato con successo un protocollo adatto per lo screening degli embrioni suini durante la tarda gestazione. Sulla base di studi con simili fasi di sviluppo di embrioni da studi precedenti 6,18, il presente protocollo è considerato più sicuro ea basso costo.
Questo protocollo è adatto anche per un gran numero di campioni per la tipizzazione sesso usando PCR trasferendo dei lisati DNA in una piastra a 96 pozzetti. Il formato piatto consente high-throughput screening, consentendo il trasferimento 1 ml di lisato DNA per la reazione di PCR utilizzando una pipetta multicanale.
Tuttavia, diversi passaggi coinvolti nella procedura dovrebbe essere fatto con attenzione. Per eseguire il metodo di lisi 50 mM NaOH modificata in modo più efficiente, l'embrione congelato individualmente deve essere fondata in polvere fineutilizzando un pre-raffreddata (-80 ° C) mortaio e pestello. Evitare di versare la polvere embrione sul ghiaccio secco, raschiando delicatamente e lentamente la polvere nel tubo 15 ml, come mostrato in Figura 1. Cambiare esame guanti dopo ogni campione è consigliabile per evitare di polvere sul guanto trasferimento ad un altro campione embrione.
La quantità appropriata di polvere embrione da aggiungere alla soluzione di lisi 50 mM NaOH modificato è illustrato nella figura 2B. Una quantità eccessiva di polvere embrione viene presentato in Figura 2A e dovrebbe essere evitata. Analogamente, nella figura 2C, la quantità di polvere embrione potrebbe essere insufficiente per procedure valle. Sebbene la polvere pesata embrione per ogni campione è possibile, non è pratico quando lo screening sesso embrione in uno studio su larga scala che coinvolge oltre cento embrioni.
La quantità di DNA può essere visibilmente verificata utilizzando uno stuzzicadenti per verificare la g appiccicososostanza ooey simile come mostrato in Figura 3, se è dubbio che la giusta quantità di polvere è stato aggiunto nel passaggio precedente.
Aggiungendo la giusta quantità di soluzione di neutralizzazione è importante dopo lisi polvere embrione. La Figura 4 mostra la variazione del pH dopo e prima di aggiungere la soluzione di neutralizzazione. Questo passo è importante assicurarsi che il pH è leggermente alcalino (circa 8,0) e quindi simile alla maggior buffer di reazione PCR.
Specificità dei primer oligo è l'elemento più importante per l'accuratezza di sessaggio DNA durante la PCR. La specificità dei primer oligo può essere confermata attraverso il programma NCBI Blastn. Una posizione singola sarà rilevato sul cromosoma X alla regione non codificante 3 'del gene ZFX per ogni sequenza di primer (Figura 6A) per le femmine. Una situazione analoga viene rilevata solo con cromosoma Y nella regione codificante del gene SRY (Figura 6B
Tasso di errore a causa di nessuna identificazione sesso potrebbe essere molto bassa (<1%) come illustrato nella Tabella 1, quando tutti i passi procedono attentamente e correttamente. Tuttavia, in qualche raro caso, la contaminazione incrociata tra lisati DNA di due diversi campioni è possibile e può essere rilevato mediante PCR come indicato con una stella rossa nel gel (Figura 7). Questo tipo di pattern di bande in femminile può essere interpretata come la contaminazione incrociata con un campione maschile.
È improbabile che la comparsa di una banda inferiore molto debole è dovuto alla competizione primer per reagenti PCR. In questo caso l'amplicon più piccolo (400 bp) correlata al gene SRY genererà più prodotto di PCR più veloce della banda superiore corrispondente al gene ZFX. In questo protocollo, uno svantaggio è la determinazione di contaminazione trasversale di un campione maschio con una femmina. Perché il nostro obiettivo principale non è la quantificazione del numero di copie per ogni gene bersaglio, un minuscoloquantità di polvere dal campione femminile non sarebbe facile da visualizzare sul gel.
Il protocollo di sessaggio del DNA qui presentata è il metodo più efficace per identificare il sesso dell'embrione durante la tarda gestazione e può essere applicato ad altri grandi animali da reddito come bovini, capra e pecora. Inoltre, simile metodo di sessaggio del DNA è stato applicato nei suini legate alla condizione di scrofe metabolica 18. Un'altra indagine di ricerca utilizzando sessaggio del DNA potrebbe essere applicato per studiare il meccanismo di imprinting genomico durante la programmazione prenatale di sviluppo post-natale nel maiale 22. Una vasta gamma di applicazioni nel bestiame utilizzando DNA PCR sessaggio è possibile ad esempio programmi di selezione di allevamento pre-sesso, e gli effetti epigenetici di nutrizione e le malattie infettive.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere la cooperazione e contributi finanziari della seguente agenzia di finanziamento della ricerca: Alberta bestiame e della carne Agenzia Ltd, CRC carne di maiale, carne di maiale Alberta, Hypor A Hendrix Genetics Società e NSERC CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
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