30日猪胚胎的准确和无酚DNA性别鉴定的PCR

Abstract

研究中的猪产前编程已经表明，发育中的胚胎或胎儿的性别可以影响发育结果。因此，确定胚胎的性别的能力是必要的，许多实验特别是关于早期发展。本协议表明猪基因组DNA用PCR使用一种廉价的，快速的和无毒​​的制剂。第30天的胚胎必须按照机构动物政策及福利委员会在本协议确定的方针得到人道收集。整个胚胎此基于PCR性别鉴定技术制备简单地涉及使用预冷研钵和杵研磨冷冻的胚胎成细粉。 PCR的质量DNA从胚胎粉末少量通过在碱性裂解试剂施加热孵育释放。接着，将DNA溶液与中和缓冲液混合，并直接用于PCR。两个引物对产生的DETEC吨特定性别确定Y-染色体（SRY）和在X染色体以高精度和特异性的ZFX区域的区域。相同的协议可以被应用到其它细长胚胎（第10天至14天）比日早30.此外，此协议可与96涌出板筛选大量的胚胎时，使之成为自动化和高可行进行吞吐量性别特征。

Introduction

国内生猪已成为发展，遗传学与营养在人类和畜牧部门的基本研究课题。猪作为生物体模型为人类研究的潜在可以归因于他们的生理相似之处。在家畜，性别比例操纵，提高选择和遗传改良计划¹的有效性。性别鉴定单个胚胎是许多实验研究，包括但早期胚胎发育过程中²不限于基因，表观遗传学和性别二态性的X染色体失活使用的基本工具。

在小鼠的研究表明，产妇的饮食和其他因素可能导致男女比例失调^3。在猪，性别比例失衡的原因包括父系品种^4，子宫容量^5，母猪的代谢状况^6。因为在胚胎和窝中观察到的差异可以通过本身的影响xual异形，研究人员应借鉴有关他们的研究结论之前，了解胎儿的性别和性别比率。高效的工具和协议，在发展30日性别鉴定胚胎养猪的发展，将在这里讨论。

性分型的各种方法已经被开发用于在模式生物和家畜遗传研究。特别是在家畜，识别雌雄早期胚胎是一个非常普遍的做法，以提高遗传选择用于育种计划。早期胚胎用姬姆萨^7或强烈的荧光^8,9技术猪核型已被用于性别特征。然而，这些方法是耗时，不适合快速，准确地筛选大量的胚胎。

最有效的性别分型方法是使用热稳定DNA聚合酶和一对引物DNA扩增。通过PCR方法DNA性别鉴定是比较具体的，快速，灵敏，邻NLY需要接入蜂窝材料的微量。是对人类进行的¹⁰首基于PCR的胚胎性别鉴定，后来在小鼠^11，12牛，水牛^{13和 14}只羊植入前胚胎。在猪，通过单一对Y染色体特异性DNA引物^15，建立了植入前胚胎早期的DNA性别分型方法。然而，从雄性特异性SRY基因^16和位于X和Y染色体^17上的锌指基因的非性判别区域的Y染色体选择用于性别确定的最常见的PCR引物。随后，这些引物已经被应用，以确定在这项研究中具有改进的引物特异性日30的胚胎的性别来检测仅一个锌指基因的X染色体。

从猪植入前胚胎基因组DNA可以通过将一个完整的胚泡与proteinas缓冲提取^Ëķ16或通过采取一些细胞活检从个体早期卵裂胚胎¹⁵并将它们用于直接PCR。然而，从猪血液，毛发，组织或大小超过几厘米大孕的DNA释放不能有效地使用蛋白酶K法进行。使用任一耗时苯酚/氯仿协议^6或昂贵基于列的试剂盒¹⁸已经建立了这些材料的DNA提取方法。为了避免使用可能有毒的化学品，有开发价格低廉，容易和自由酚DNA提取方法的趋势。这对PCR的质量的基因组DNA，从^鼠标 19和斑马鱼²⁰组织中的隔离型协议的已使用热氢氧化钠和三（能手）成立。这项研究提供了一个协议来获取DNA与PCR性爱能手修改和重新设计的复式引物对直接从日细胞裂解液30猪胚胎打字精度高。

Protocol

按照加拿大议会关于动物饲养的指导方针，并与学院动物政策及福利委员会批准 - 阿尔伯塔大学的畜牧，妊娠母猪由经过培训的人员大约一天收集妊娠和胚胎30安乐死。在过程中使用检查手套在所有时间。

1.样品采集和样品储存

1. 使用紧固螺栓接着放血安乐死母猪。戴上手套检查从每个安乐死收集母猪生殖道和胚胎。
   注：样品和移植胚胎的快速收集到干冰或液氮，将导致更高质量的组织中其他分子的作品，如芯片和qPCR。
2. 解剖子宫，轻轻的胚胎盘胎膜内所有的胚胎从底层的子宫壁分离^21。确保没有母体组织的污染。
3. 回覆冷冻前所有可行的胚胎线的长度和重量。
4. 收集每个人的胚胎，并立即与捕捉液氮冷冻前的铝箔包起来。
5. 转自液氮冷冻胚胎直接到-80℃的冰箱中。

2.磨胚胎

1. 标记所有样品管（15ml）中与所需的样本数的样本ID加以分析。
2. 填充干冰热容器半满，并在干冰插入预标记的样品管中。
3. 戴上手套，冬天在上面另一对检查手套从-80转移预冷迫击炮和杵℃冰箱干冰的容器。
4. 放置在冷冻胚胎的干冰砂浆内。
5. 倾足够液氮覆盖胚胎和用杵成细粉研磨它。
6. 胚胎粉末转移到预标记的样品管与MICRospatula（图1），并放置在管中-80℃冷冻机中。
7. 使用干净预冷研钵每个胚胎和研磨每个胚胎，以避免样品间的交叉污染后改变考试手套。

采用改良氢氧化钠方法3基因组DNA制备方法

1. 标签所需的所有的样本数的离心管（1.5毫升），以进行分析。
2. 从之前的传递包含胚粉样品管-80℃冷冻到容器用干冰首发。
3. 吸管180微升的50mM的NaOH（氢氧化钠）到每个预标记的微量离心管中。
4. 打开培养箱和预热至95℃。
5. 用牙签胚胎粉末的正确量（约5-10毫克）（图2）从样品管转移到含有50mM的NaOH溶液的预标记的微量离心管中。
6. 拉üP上的同一牙签慢慢可视化所述DNA裂解物作为粘糊糊，白色透明状物质（图3）。
7. 用DNA裂解物转移离心管到预加热的培养箱中于95℃五分钟。紧随管转移到装满冰保丽龙箱。
8. 加入20μl的1M Tris-HCl中直接进入的离心管，并轻轻拍打该管混合。使用pH试纸，以确保pH在大约8.0（图4）之前，离心。
   注意：当有大量样品制备的处理，是可以接受的随机挑选几样检查pH值。
9. 离心与DNA裂解液的管中，在2000 xg离心在微量两分钟，在室温下以除去未溶解的组织碎片。
10. 转移150微升顶部澄清上清液的进新管或96孔板中。
    注：明确DNA裂解液准备在PC模板使用ř反应，这是在4℃下稳定两周，或者也可以保持在-20℃下一年。

4.设计性别特异性PCR引物

1. 获得NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov猪的性别决定区Y（SRY）登录号（NM_214452.3）和锌指蛋白X连锁（ZFX）基因（XM_005673501.1） /。
2. 复制这些NCBI登录号粘贴到一个在线的引物设计工具。
   注意：最好的引物信息，包括长度，Tm和GC％以及PCR产物大小（bp）的将在计算机屏幕上产生的（图5）。
3. 验证的使用核苷酸BLAST程序（BLASTN）逆水猪基因组数据库104，以确保这些序列仅位于X和Y染色体为SRY和ZFX分别（图6）这些引物的特异性。

5.基因组DNA PCR直接从DNA裂解液

1. 使用仅1微升的DNA裂解物作为15微升的PCR反应的模板的。
   注意：可以在用多道移液器类似的方式来执行对96孔板的PCR的高通量筛选方法。
2. 请执行以下操作只是第一次PCR：通过添加购得已知性别的猪的基因组DNA 1微升（0.5纳克）准备一个PCR管无模板阴性对照和阳性对照两个附加管。以后，包括来自上一次成功的性别鉴定分析作为阳性对照的样品，并与用于性别确定的新PCR反应一起运行。
3. 使用任何热启动预拌的PCR酶，并通过添加引物制备主混合物并根据PCR反应的总数无核酸酶的水。加入1微升的DNA裂解成现有预PCR管与PCR主混合物的14微升。添加的引物，使得由两个性别特异性基因的引物的终浓度是在共有15微升的PCR为r的0.3微米反应的影响。
4. 设置以下PCR程序在热循环仪：95℃，3分钟，35个循环，每个为20秒熔化步骤98℃，接着在65℃15秒的退火步骤，接着是15秒延伸步骤在72℃。在最后的步骤，孵育1分钟的反应在72℃下，继续在4℃下孵育直至除去PCR管的用于凝胶电泳验证，以确定的性别。
   注意：PCR条件和优化，根据在材料表中提到的PCR试 ​​剂盒的说明书。
5. 制备2％TBE琼脂糖凝胶时添加无毒绿光荧光SYBR DNA凝胶染色的适当的量。
   注意：溴化乙锭可以代替绿光荧光染色，如果它是不可用的。
6. 添加1.5微升样染料（10倍）到PCR管中，并通过移液在PCR反应缓冲液向上和向下拌匀。
7. 负载10微升样品放入井并且r联合国琼脂糖凝胶具有适当的电压设置（在100伏的小胶设备，在150V 96孔凝胶装置上，直到染料带贯穿凝胶一半）。
8. 观察和利用激光扫描仪下的荧光设置调整频带的强度，并捕获凝胶的图像。注意：普通的凝胶成像仪可以取代的溴化乙锭的凝胶。
9. 通过识别与一个频带作为女性和两个频带作为男性（图7）的胚胎确定猪胚胎的性别。

Representative Results

从345的DNA裂解物通过PCR筛选性别决定的代表性结果示于图7和表 1中总结。

如在图7中可以看出 ，引物退火温度在65℃是在不同样品之间的这种PCR方案产生类似的强度和谓词的扩增子的大小（图5）的最佳条件。

SRY（400碱基对）和ZFX（506碱基对）的两个扩增产物示于凝胶图像（图7）。男性胚胎表明两个DNA片段与上部（400碱基对）的正确大小和下（506 bp）的条带。这两个条带的强度被证明是在大多数男性个体相等。所有的女性胚胎只显示对应于位于所述ZFX基因的单个DNA片段X染色体。

从修改的50mM的NaOH所得DNA裂解物可以以高成功率和准确度被直接用于PCR。 DNA的裂解物并没有表现出筛选345胚之后的任何PCR反应的抑制作用。只有三个人没有绝育手术和女性胚胎的百分比高于男性（表1）略高。

图 1： 胚胎粉调胚粉传送到15毫升管。

图2：收集并用牙签转移胚胎粉（A）的胚胎附着粉的过量的牙签。 （B）的正确用量胚胎粉末附着在牙签被转移到碱裂解试剂溶液。 （C）的胚胎粉末附着在牙签的量不足。

图3：DNA可视化技术慢慢拉起牙签，增加胚胎粉后，以确定胚胎的DNA溶解为黏黏糊糊白色透明状物质。

图4：pH值确认（A） 中的氢氧化钠（碱裂解试剂）溶液的pH为12.0。 （B）之后加入中和缓冲液，以裂解缓冲液，pH试纸的颜色指示是绿色，pH值应为8.0左右。

图5：。 性别特异性引物信息序列名称，序列及引物设计工具所获得的扩增子长度请点击此处查看该图的放大版本。

图6：在ZFX基因上指定的正向染色体X和Y（A）位置猪的性别特异性引物的映射和反向引物。正向的（B）的位置和扭转的SRY基因引物的规定。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 7： 从第30天胚胎猪特定性别基因PCR扩增与已知的阳性对照SYBR DNA凝胶染料染色的2％TBE琼脂糖凝胶上以表示男性和女性的符号。两个带指示为男性和一个单一的频带作为女性。红色星号表示在井中可能样品污染相比于上频​​带（506碱基对）引起SRY特异性Y型引物的PCR产物十分微弱低频（400碱基对）的外观。红色箭头表示无模板PCR阴性对照。 请点击此处查看该图的放大版本。

PCR性别鉴定	胚胎数
♀	185	53.60％
♂	157	45.50％
未知	3	0.90％
总	345	100％

表1：345 之间的30天的胚胎女性，男性和未知PCR性别鉴定后的百分比。

Discussion

最相关的猪胚胎的DNA性别打字现有协议的仅适合于早期预注入阶段^15,16。我们已经成功开发出在妊娠后期适用于猪胚胎筛选的协议。基于与从先前的研究^6,18胚胎相似发育阶段的研究中，本协议被认为是安全的，成本低。

该协议也适于用于使用PCR通过DNA裂解物转移入96孔板性打字大量样品。板格式允许高通量筛选通过允许转印1μl的DNA的裂解物用于使用多道移液器PCR反应。

然而，参与该过程的几个步骤应谨慎。为了更有效地进行改性的50mM的NaOH裂解的方法，所述单独冷冻胚胎已被磨成细粉用预先冷却的（-80℃）研钵和杵。避免在干冰溢出胚胎粉末，由粉末轻缓地刮入15毫升管， 如图1。改变检查手套后，强烈建议每个样品，以避免在手套转移到另一个胚胎样品粉末。

胚胎粉末的适当添加量的改性的50mM的NaOH裂解溶液在图2B中示出。胚胎粉末的量过多示于图2A，应当避免。同样地，在图2C中，胚胎粉末的量可能不足以用于下游过程。虽然重达胚胎粉每个样品是可能的，它涉及百余胚胎大规模研究筛选胚胎的性别时，是不实际的。

的DNA的量可以用牙签来检查粘G是明显验证如图3所示，如果这是令人怀疑是否在先前步骤中加入粉末的适量ooey状物质。

加入中和溶液中的合适的量为裂解胚胎粉末后重要的。 图4示出后，加入中和溶液之前的pH变化。这个步骤是重要的，以确保pH为弱碱性（约8.0），因此，类似于大多数PCR反应缓冲液。

的寡引物的特异性是DNA性别鉴定的PCR过程的准确度的最重要的元素。的寡引物的特异性可以通过NCBI BLASTN程序进行确认。单个位置将在3'非编码ZFX基因为每个引物序列（图6A）的区域为女性在X染色体上被检测到。类似的情况是仅检测上SRY基因的编码区Y染色体（图6B

由于误差率没有性别鉴定可能是非常低的（<1％），为表 1中所示，当所有的步骤小心和正确地进行。然而，在一些罕见的情况下，两种不同样品的DNA裂解物之间的交叉污染是可能的，并且作为与红星在凝胶（图7）表明可以通过PCR进行检测。这种类型的阴带型的可以被解释为交叉污染与男性样本。

这是不可能的非常微弱的较低频带的出现是由于对PCR试剂的引物的竞争。在这种情况下，相关的SRY基因的小的扩增子（400bp）的会产生更多的PCR产物比对应于ZFX基因的高频段更快。在这个协议中，一个缺点是与女性男性样本的交叉污染的测定。因为我们的主要目标不是拷贝数量化为每个目标基因，一个微小的从阴样品粉末的量将不容易想象在凝胶上。

这里介绍的DNA性别鉴定协议是在妊娠后期，以确定胎儿性别最具成本效益的方法，并可以应用到其他大家畜如牛，山羊和绵羊。此外，类似的DNA性别鉴定方法已在与母猪的代谢状态¹⁸猪施加。使用DNA性别鉴定的另一个研究调查可以应用在猪²²出生后发育的产前编程期间以研究基因组印记机构。广泛的使用DNA PCR性别鉴定牲畜的应用可能，例如性别预选育种计划，营养和传染病的后生效应。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used - quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.