Abstract
Forskning i prænatal programmering i grisen har vist, at køn udviklende embryo eller foster kan påvirke den udviklingsmæssige udfald. Derfor evnen til at bestemme et foster køn er nødvendig i mange eksperimenter især med hensyn tidlige udvikling. Den nuværende protokol viser en billig, hurtig og ikke-giftige forberedelse af svine genomisk DNA til brug med PCR. Dag 30 embryoner skal humant indsamles i henhold til de retningslinjer, som Institutional Animal Policy and Welfare udvalgene for den nuværende protokol. Fremstillingen af hele embryo for denne PCR kønsbestemmelse teknik simpelthen involverer formaling af frosne embryo til et fint pulver under anvendelse af en forkølet morter og pistil. PCR-kvalitet DNA frigøres fra en lille mængde af embryo pulver ved at anvende en varm inkubation i en alkalisk lysis reagens. Dernæst DNA-opløsningen blandet med neutralisering puffer og anvendtes direkte til PCR. To primerpar genereres til DETECt bestemt køn bestemmende region af Y kromosomet (SRY) og ZFX region i X- kromosomet med stor nøjagtighed og specificitet. Den samme protokol kan anvendes på andre aflange embryoner (dag 10 til dag 14) tidligere end dag 30. Desuden kan denne protokol udføres med 96-vældede plader ved screening et stort antal embryoner, hvilket gør det muligt for automatisering og høj- throughput sex skrive.
Introduction
Den indenlandske gris er blevet en grundforskning emne i udvikling, genetik og ernæring i både menneskelige og animalske sektorer. Potentialet af svin som biomedicinske modeller for menneskelig forskning kan tilskrives deres fysiologiske ligheder. I husdyr, kan manipulation af kønsfordelingen øge effektiviteten af udvælgelse og genetisk forbedring programmer 1. Kønsbestemmelse individuelle embryoer er et grundlæggende værktøj, der anvendes i mange eksperimentelle undersøgelser, herunder men ikke begrænset til genotype, epigenetik og X inaktivering af kønsdimorfisme i den tidlige embryo udvikling 2.
Undersøgelser på mus tyder på, at moderens kost og andre faktorer kan resultere i skæve kønsfordeling 3. Hos svin, årsager til sex ratio ubalance omfatter faderlig race 4, uterin kapacitet 5 og soens metaboliske tilstand 6. Da observeret i embryoner og kuld forskelle kan påvirkes af SExual dimorfisme, bør forskerne være opmærksomme på embryo køn og kønsfordeling inden der kan drages konklusioner med hensyn til deres forskning. Udviklingen af effektive værktøjer og protokoller til kønsbestemmelse svin embryoner på dag 30 af udviklingen vil blive diskuteret her.
Forskellige metoder til sex typning er blevet udviklet til genetiske undersøgelser i modelorganismer og husdyr. Især i husdyr, identificere mandlige og kvindelige tidlige embryoner er en meget almindelig praksis at forbedre genetisk udvælgelse for avlsprogrammer. Tidlige embryoner karyotypebestemmelse i svineproduktionen hjælp Giemsa 7 eller de intense fluorescens 8,9 teknikker er blevet anvendt til sex skrive. Disse fremgangsmåder er tidskrævende og ikke egnet til screening af store antal embryoer hurtigt og præcist.
Den mest effektive sex typningsmetode er DNA-amplifikation under anvendelse af en varmestabil DNA-polymerase og et par primere. DNA kønsbestemmelse ved PCR-metoden er mere specifik, hurtig og følsom, only kræver en lille mængde af cellulære materialer. Den første PCR-baseret embryo kønsbestemmelse blev udført på mennesker 10, og senere i mus 11, kvæg 12, bøfler 13 og får 14 præimplantationsembryoner. I grisen, blev den tidligste DNA sex typebestemmelsesmetode fastsat for præimplantationsembryoner via et enkelt par Y-kromosom specifik DNA-primere 15. Imidlertid blev de mest almindelige PCR-primere til kønsbestemmelse valgt fra Y-kromosomet af mandlige specifik SRY gen 16 og den ikke-køn diskriminerende region af et zink-finger-genet placeret i både X- og Y-kromosom 17. Efterfølgende er disse primere er anvendt til at bestemme kønnet på dag 30 embryoer i denne undersøgelse med forbedret specificitet af primerne til påvisning kun X-kromosomet af en zink-finger-genet.
Genomisk DNA fra porcine præimplantationsembryoner kan ekstraheres ved at udsætte en intakt blastocyst til buffer med proteinase K 16 eller ved at tage en biopsi af nogle få celler fra individet tidlig spaltning embryoer 15 og bruger dem til direkte PCR. Imidlertid frigivelse af DNA fra svineblod, hår, væv eller en stor conceptus over et par centimeter i størrelse er ikke effektivt gøres ved hjælp af proteinase K-metoden. DNA ekstraktionsmetoder for disse materialer er blevet etableret under anvendelse af enten tidskrævende phenol / chloroform protokoller 6 eller dyre kolonne baserede kits 18. For at undgå brugen af potentielt giftige kemikalier, er der en tendens til at udvikle billigt, let og phenol-frit DNA ekstraktionsmetoder. Denne type af protokol til isolering af PCR-kvalitet genomisk DNA fra mus 19 og zebrafisk 20 væv er blevet etableret under anvendelse af varmt natriumhydroxid og Tris (hotshot). Denne undersøgelse giver en protokol for at opnå DNA med modificerede Hotshot og redesignet duplex primerpar til PCR sex skrive direkte fra cellelysater af Day 30 soembryoner medhøj nøjagtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I overensstemmelse med den canadiske Rådet om Animal Care retningslinjer og med godkendelse af fakultetet Animal Politik og Trivsel - Livestock fra University of Alberta, blev drægtige søer aflivet af uddannede stabe på ca. dag 30 af graviditeten og embryoner blev indsamlet. Brug undersøgelse handsker på alle tidspunkter under procedurerne.
1. Prøvetagning og Sample opbevaring
- Afliv so hjælp boltpistol efterfulgt af afblødning. Bær undersøgelse handsker til at indsamle de reproduktive skrifter og embryoner fra hver aflivet so.
Bemærk: Hurtig indsamling af prøver og overføre embryoner til tøris eller flydende nitrogen vil resultere i højere kvalitet væv til andre molekylære værker som microarray og qPCR. - Dissekere livmoderen og forsigtigt adskille alle embryoner inden for deres extraembryonic placentale membraner fra den underliggende livmodervæggen 21. Sørg for at der ikke er nogen forurening maternal væv.
- Reledning længde og vægt af samtlige levedygtige fostre før frysning.
- Saml enkelte foster og straks pak det op i en aluminiumsfolie før snap frysning med flydende kvælstof.
- Overfør de frosne embryoner fra flydende nitrogen direkte til en -80 ° C fryser.
2. Grinding Embryoner
- Label alle prøverør (15 ml) med prøve-ID nødvendig for antallet af prøver, der skal analyseres.
- Fyld termisk beholder med tøris til halvt fyldt og sæt den præ-mærkede prøveglas i tørisen.
- Bær vinter handsker med et andet par af undersøgelse handsker på toppen til overførsel fra før kølede morterer og pestles fra -80 ° C fryser til tøris container.
- Placer frosne embryo inde i mørtel på tøris.
- Hæld tilstrækkelig flydende nitrogen til at dække foster og male det med støder til et fint pulver.
- Overfør embryo pulver til en forud mærket prøveglas med en MICRospatula (figur 1) og placer røret i en -80 ° C fryser.
- Brug en ren pre-afkølet morter og støder for hver embryo og ændre undersøgelse handsker efter slibning hver foster for at undgå krydskontaminering mellem prøver.
3. Genomisk DNA-forberedelse hjælp Modified Natriumhydroxid Method
- Label alle mikrocentrifugerør (1,5 ml), der er nødvendige for det antal prøver, der skal analyseres.
- Overfør prøverørene indeholdende embryo pulver fra -80 ° C fryser til en beholder med tøris før start.
- Pipette 180 pi 50 mM NaOH (natriumhydroxid) i hver præ-mærkede mikrocentrifugerør.
- Tænd en inkubator og præ-opvarmes til 95 ° C.
- Brug en tandstik til at overføre den korrekte mængde embryo pulver (ca. 5-10 mg) (figur 2) fra prøverøret ind i en præ-mærket mikrocentrifugeglas indeholdende 50 mM NaOH-opløsning.
- Træk up samme tandstikker langsomt at visualisere DNA-lysat som et klæbrigt, klæbrig, hvid transparent stof (figur 3).
- Overfør mikrocentrifugerør med DNA lysat til den forvarmede inkubator ved 95 ° C i fem minutter. Umiddelbart overføre røret til en styrofoam kasse fyldt med is.
- Tilsæt 20 pi 1 M Tris-HCI direkte i mikrocentrifugerør og bland det ved forsigtigt at banke på glasset. Brug en pH-papir for at sikre at pH er ca. 8,0 (figur 4) før centrifugering.
Bemærk: Når der beskæftiger sig med en lang række eksempler på præparater, er det acceptabelt at tilfældigt vælge nogle prøver for at kontrollere pH. - Centrifugeres røret med DNA-lysat ved 2000 xg i en mikrocentrifuge i to minutter ved stuetemperatur for at fjerne uopløst vævsrester.
- Transfer 150 ul af den øverste klare supernatant til et nyt rør eller plader med 96 brønde.
Bemærk: Det klare DNA lysat er klar til brug som en skabelon i PCR reaktionen, og det er stabilt ved 4 ° C i to uger, eller det kan opbevares ved -20 ° C i et år.
4. Design Sex-specifikke PCR-primere
- Anskaf deponeringsnumre for porcin sex region Y (SRY) (NM_214452.3) og og zink finger protein X-linked (ZFX) gener (XM_005673501.1) fra NCBI website http://www.ncbi.nim.nih.gov /.
- Kopier og indsæt disse NCBI deponeringsnumre til en online primer design værktøj.
Bemærk: Den bedste primere oplysninger, herunder længde, Tm og GC% samt PCR-produkt størrelse (bp) vil blive genereret på computerskærmen (figur 5). - Godkend specificiteten af disse primere under anvendelse af nukleotid Blast program (Blastn) mod strømmen porcin genomisk database 104 for at sikre disse sekvenser kun placeret på X- og Y-kromosom for SRY og ZFX henholdsvis (figur 6).
5. Genomisk DNA PCR Direkte fra DNA Lysater
- Brugkun 1 pi DNA-lysat som skabelon for en 15 pi PCR-reaktion.
Bemærk: High throughput screening fremgangsmåde til plader med 96 brønde PCR kan udføres på lignende måde under anvendelse af en multikanalpipette. - Gør følgende blot for den første PCR: forberede en PCR-rør for ingen skabelon negative kontrol og to ekstra rør til positive kontroller ved at tilføje en pi (0,5 ng) af kommercielt opnået kendt sex porcint genomisk DNA. Senere, omfatter en prøve fra den sidste succesfulde kønsbestemmelse analyse som en positiv kontrol og køre sammen med den nye PCR-reaktion for kønsbestemmelse.
- Brug en HotStart klar mix PCR enzym og forberede en master mix ved at tilføje primere og nuklease frit vand afhængig af det samlede antal PCR reaktioner. Tilsæt 1 pi DNA lysat i en allerede eksisterende PCR-rør med 14 pi af PCR Master mix. Tilføj primere således at den endelige koncentration af primere fra to kønsrelaterede gener er 0,3 um i alt 15 pi PCR reaction.
- Definere følgende PCR program i en thermal cycler: 95 ° C i 3 minutter, 35 cykler hver med en 20 sek smeltetrin 98 ° C, efterfulgt af en 15 sek annealingstrin ved 65 ° C, efterfulgt af en 15 sek forlængelsestrin ved 72 ° C. I et sidste trin, inkuberes reaktionerne i 1 min ved 72 ° C og fortsat at inkubere ved 4 ° C indtil fjernelse af PCR-rør for gelelektroforese verifikation at bestemme køn.
Bemærk: PCR-forhold og optimering er i henhold til manualen for PCR kit nævnt i Materials tabel. - Tilsæt passende mængde af ikke-giftige grøn- fluorescerende SYBR DNA gel pletten ved udarbejdelsen af en 2% TBE agarosegel.
Bemærk: Ethidiumbromid kan anvendes i stedet for driv- fluorescerende plet, hvis den ikke er tilgængelig. - Tilføj 1,5 pi af påføringsfarvestof (10x) i PCR-rør og bland godt ved pipettering PCR reaktionspuffer up-and-down.
- Load 10 pi af prøven i brønden og run agarosegelen med passende spændingsindstillinger (lille gel-apparat ved 100 V, 96-brønd gel-apparat ved 150 V, indtil farvestoffet band løber halvvejs gennem gelen).
- Observer og justere bands intensiteter under fluorescerende lys indstillingen ved hjælp af en laser-scanner og tage et billede af gelen. Bemærk: Fælles gel imager kan anvendes i stedet for ethidiumbromid gel.
- Bestem køn soembryoner ved at identificere embryoner med et band som en kvindelig og to bands som en mandlig (figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et repræsentativt resultat af kønsbestemmelse fra 345 DNA lysater screening ved PCR er vist i figur 7 og opsummeret i tabel 1.
Som det kan ses i figur 7, primerne annealingstemperatur ved 65 ° C er den optimale tilstand i denne PCR-protokol generere lignende intensitet og bygger amplicon størrelser (figur 5) blandt forskellige prøver.
To forstærkede produkter af SRY (400 bp) og ZFX (506 bp) er vist i gelen billede (figur 7). Mandlige embryoner viste to DNA-fragmenter med den korrekte størrelse af den øvre (400 bp) og nedre (506 bp) bånd. Intensiteten af disse to bånd blev vist at være ens i de fleste mandlige individer. Alle de kvindelige fostre viste kun et enkelt DNA-fragmentet svarende til ZFX gen lokaliseret iX-kromosom.
DNA lysater opnået fra den modificerede 50 mM NaOH kan anvendes direkte til PCR med en høj succesrate og nøjagtighed. DNA lysater viste ingen PCR-reaktion inhibering efter screening 345 embryoner. Kun tre personer var ikke kønsbestemt og procentdelen af kvindelige fostre var lidt højere end mænd (tabel 1).
Figur 1:. Embryo Pulver Transfer Overførsel embryo pulver til et 15 ml rør.
Figur 2: Indsamling og Overførsel Embryo Pulver med en tandstikker (A) En stor mængde af embryo pulver klæber til tandstikker.. (B) korrekt mængdeembryo pulver klæber til tandstikker, der skal overføres til alkalisk lyse reagensopløsning. (C) En utilstrækkelig mængde af embryo pulver klæber til tandstikker.
Figur 3:. DNA Visualisering Technique Træk langsomt op tandstikker, efter tilsætning embryonet pulver, for at bestemme om embryonet DNA'et er opløst som et klæbrigt klæbrig hvid transparent-lignende stof.
Figur 4:. PH Bekræftelse (A) pH af natriumhydroxid (alkalisk lysis reagens) opløsning er 12,0. (B) Efter tilsætning neutralisering puffer til lysis buffer, farve indikation af pH-papir er grøn, og pH bør være omkring 8,0.
Figur 5:.. Sex-specifikke Primer Information Sequence navne, Sekvenser og amplikon længde fås fra primer design værktøj Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kortlægning af porcint Sex-specifikke primere på kromosom X og Y. (A) Placering af den forreste og vendes primere angivet på ZFX genet. (B) Placering af den forreste og vendes primere angivet på SRY genet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7:. PCR-amplifikation af porcint Sex-specifikke gener fra dag 30 Embryoner 2% TBE agarosegel farvet med SYBR DNA gel pletten med de kendte positive kontroller er angivet med mandlige og kvindelige symboler. To bands angivet som hanner og en enkelt bånd som kvinder. Rød stjerne indikerede mulig forurening prøven i brønden med fremkomsten af en meget svag nedre bånd (400 bp) i forhold til øvre bånd (506 bp) PCR-produkt forårsaget af SRY Y-specifikke primere. Rød pil viser den ingen skabelon PCR negativ kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
| kønsbestemmelse PCR | Embryo Count | |
| ♀ | 185 | 53,60% |
| ♂ | 157 | 45.50% |
| Ukendt | 3 | 0,90% |
| Total | 345 | 100% |
Tabel 1: Andel af kvinde, mand og Ukendt efter PCR Kønsselektion blandt 345 Dag 30 embryoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fleste af de eksisterende protokoller relateret til soembryoner DNA sex typning kun egnet til tidligt præ-implantation fase 15,16. Vi har med succes udviklet en protokol egnet til svin embryo screening i slutningen drægtighed. Baseret på undersøgelser med lignende udviklingsstadier af embryoner fra tidligere undersøgelser 6,18 er den foreliggende protokol for at være sikrere og lave omkostninger.
Denne protokol er også velegnet til et stort antal prøver for sex typebestemmelse ved anvendelse af PCR ved at overføre af DNA lysater i en 96-brønds plade. Pladen format giver high-throughput screening ved at tillade overførsel 1 pi DNA lysat for PCR-reaktionen under anvendelse af en multikanalpipette.
Dog bør flere trin involveret i proceduren gøres omhyggeligt. For at udføre den modificerede 50 mM NaOH lysismetode mere effektivt, har individuelt frosne embryo at være jordet i fint pulverved anvendelse af en præ-afkølet (-80 ° C) morter og støder. Undgå at spilde embryo pulver på tøris, ved forsigtigt og langsomt skrabe pulveret i 15 ml rør, som vist i figur 1. Ændring undersøgelse handsker efter hver prøve er anbefalet at undgå pulver på handsken overdragelse til en anden embryo prøve.
Den passende mængde af embryo pulver, hvormed den modificerede 50 mM NaOH lyseopløsning er vist i figur 2B. En stor mængde af embryo pulver er vist i figur 2A og bør undgås. Ligeledes i figur 2C, kan mængden af embryo pulver være utilstrækkelig for downstream procedurer. Selv vejer embryonet pulver til hver prøve er muligt, er det ikke praktisk, når screening embryo sex i stor skala studie med over hundrede embryoner.
Mængden af DNA kan synligt kontrolleres ved hjælp af en tandstik til at kontrollere for den klæbrige gooey-lignende stof, som vist i figur 3, hvis det er tvivlsomt, om passende mængde pulver blev tilsat i det foregående trin.
Tilsætning af den rigtige mængde af neutralisering løsning er vigtigt efter lysering embryo pulver. Figur 4 viser pH-ændring efter og før tilsætning neutralisering opløsning. Dette trin er vigtigt at sikre, at pH er svagt basisk (ca. 8,0), og derfor ligner de fleste PCR-reaktionsbetingelser buffere.
Specificitet af oligo primere er det vigtigste element for rigtigheden af DNA kønsbestemmelse under PCR. Specificiteten af oligo primere kan bekræftes via NCBI Blastn programmet. En enkelt placering vil blive detekteret på X-kromosomet ved den 3 'ikke-kodende region af ZFX genet for hver primer sekvens (figur 6A) for kvinder. En lignende situation detekteres kun på Y-kromosom på den kodende region af SRY-genet (figur 6B
Fejlprocent grundet ingen identifikation sex kunne være meget lav (<1%) som vist i tabel 1, når alle trin gå forsigtigt og korrekt. Men i nogle sjældne tilfælde, krydskontaminering mellem DNA lysater af to forskellige prøver er mulig og kan påvises ved PCR som angivet med en rød stjerne i gelen (figur 7). Denne type båndmønster i kvindelige kan tolkes som krydskontaminering med en mandlig prøve.
Det er usandsynligt, at forekomsten af en meget svag nedre bånd skyldes primeren konkurrence for PCR-reagenser. I dette tilfælde den mindre amplikon (400 bp) relateret til SRY gen vil generere mere PCR produkt hurtigere end det højere bånd svarende til ZFX genet. I denne protokol, en ulempe er bestemmelsen af krydskontaminering af en mandlig prøve med en kvinde. Fordi vores vigtigste mål er ikke kvantificering af antal kopier for hvert mål gen, en lillemængde pulver fra den kvindelige prøve ville ikke være let at visualisere på gelen.
DNA kønsbestemmelse protokol præsenteres her er den mest omkostningseffektive metode til at identificere embryo sex under sen drægtighed og kan anvendes på andre store husdyr som kvæg, geder og får. Desuden har tilsvarende DNA kønsbestemmelse metode været anvendt hos svin relateret til søer metabolisk tilstand 18. Anden forskning undersøgelse under anvendelse af DNA kønsbestemmelse kunne anvendes til at undersøge genomisk prægning mekanisme under den prænatale programmering af postnatal udvikling hos grisen 22. En bred vifte af applikationer i husdyr ved hjælp DNA PCR kønsbestemmelse er mulig, såsom pre-sex udvælgelse avlsprogrammer og epigenetiske effekter af ernæring og infektionssygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende samarbejde og finansielle bidrag fra følgende forskningsmidler agentur: Alberta kvæg og kød Agency Ltd, Pork CRC, Alberta Svinekød, Hypor A Hendrix Genetics Company og NSERC CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
References
- Seidel, G. E. Economics of selecting for sex: the most important genetic trait. Theriogenology. 59, 585-598 (2003).
- Gutiérrez-Adán, A., et al. Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development. Reprod. Domest. Anim. 41, Suppl 2. 54-62 (2006).
- Rosenfeld, C. S., Roberts, R. M. Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review. Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).
- Gorecki, M. T. Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758). Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).
- Chen, Z. Y., Dziuk, P. J. Influence of initial length of uterus per embryo and gestation stage on prenatal survival, development, and sex ratio in the pig. J. Anim. Sci. 71, 1895-1901 (1993).
- Vinsky, M. D., Novak, S., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Foxcroft, G. R. Nutritional restriction in lactating primiparous sows selectively affects female embryo survival and overall litter. Reprod. Fertil. Dev. 18, 347-355 (2006).
- Cassar, G., King, W. A., King, G. J. Influence of sex on early growth of pig conceptuses. J. Reprod. Fertil. 101, 317-320 (1994).
- Zudova, D., Rezacova, O., Kubickova, S., Rubes, J. Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 102, 179-183 (2003).
- Hornak, M., Oracova, E., Hulinska, P., Urbankova, L., Rubes, J. Aneuploidy detection in pigs using comparative genomic hybridization: from the oocytes to blastocysts. PLoS One. 7, (2012).
- Handyside, A. H., Pattinson, J. K., Penketh, R. J., Delhanty, J. D., Winston, R. M., Tuddenham, E. G. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet. 1, 347-349 (1989).
- Wilton, L. J., Shaw, J. M., Trounson, A. O. Successful single-cell biopsy and cryopreservation of preimplantation mouse embryos. Feri. Steril. 51, 513-517 (1989).
- Peura, J. M., Turunen, M., Janne, J. A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction. Theriogenology. 35, 547-555 (1991).
- Rao, K. B., Pawshe, C. H., Totey, S. M. Sex determination of in vitro developed buffalo (Buhalus buhalis.) embryos by DNA amplification. Mol. Reprod. Dev. 36, 291-296 (1993).
- Herr, C. M., Matthaei, K. I., Petrzak, U., Reed, K. C. A rapid Y-chromosome-detecting ovine embryo sexing assay. Theriogenology. 33, 245 (1990).
- Fajfar-Whetstone, C. J., LaneRayburn, A., Schook, L. B., Wheeler, M. B. Sex determination of porcine during preimplantation embryos via y-chromosome specific DNA sequences. Animal Biotechnology. 4, 183-193 (1993).
- Pomp, D., Good, B. A., Geisert, R. D., Corbin, C. J., Conley, A. J. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim. Sci. 73, 1408-1415 (1995).
- Aasen, E., Medrano, J. F. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Biotechnology (N Y). 8, 1279-1281 (1990).
- Oliver, G., et al. Restricted feed intake in lactating primiparous sows. II. Effects on subsequent litter sex ratio and embryonic gene expression. Reprod Fertil. Dev. 23, 899-911 (2011).
- Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R. L., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29, 52-54 (2000).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos. Biotechniques. 43, 610-614 (2007).
- Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts. Animal. 8, 293-299 (2014).
- Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L. Prenatal programming of postnatal development in the pig. Control of Pig Reproduction VIII. Rodriguez-Martinez, , Nottingham University Press. 212-213 (2009).
