Abstract
Onderzoek naar prenatale programmering van het varken blijkt dat het geslacht van de ontwikkelende embryo of de foetus de ontwikkelingsuitkomst kan beïnvloeden. Daarom is de mogelijkheid om het geslacht een embryo te bepalen moet in veel experimenten name wat vroege ontwikkeling. Dit protocol toont een goedkope, snelle en niet-toxische bereiding van varkens genoom DNA voor PCR. Dag 30 embryo's moeten op humane wijze worden verzameld op basis van de door Institutional Animal Welfare Policy en commissies voor het huidige protocol richtlijnen. De bereiding van het gehele embryo van dit PCR-gebaseerde techniek omvat geslachtsbepaling gewoon malen van het bevroren embryo tot een fijn poeder met een vooraf gekoelde mortier en stamper. PCR-kwaliteit DNA wordt vrijgemaakt uit een kleine hoeveelheid embryo poeder door een hete incubatie in een alkalische lysis reagens. Vervolgens wordt de DNA-oplossing gemengd met neutralisatiebuffer en direct gebruikt voor PCR. Twee primerparen worden gegenereerd om DETECt bepaald geslacht bepalend gebied van het Y-chromosoom (SRY) en omgeving ZFX van de X-chromosoom met een hoge nauwkeurigheid en specificiteit. Hetzelfde protocol kan worden toegepast op andere langwerpige embryo (dag 10 tot dag 14) vroegste Dag 30. Ook kan dit protocol worden uitgevoerd met 96-borrelde platen bij het screenen van een groot aantal embryo's, waardoor het mogelijk voor automatisering en high- throughput sex typen.
Introduction
De binnenlandse varken is een fundamenteel onderzoek onderwerp in ontwikkeling, genetica en voeding in zowel menselijke en dierlijke sectoren geworden. Het potentieel van varkens biomedische modellen voor menselijke onderzoek kan worden toegeschreven aan de fysiologische gelijkenissen. In vee, kan de manipulatie van sex-ratio van de effectiviteit van de selectie en genetische verbeterprogramma's 1 te verbeteren. Geslachtsbepaling individuele embryo is een fundamenteel gereedschap in vele experimentele onderzoeken waaronder maar niet beperkt tot genotype, epigenetica en X inactivatie van geslachtsdimorfisme tijdens de vroege embryonale ontwikkeling 2.
Studies in muizen wijzen erop dat de moeder voeding en andere factoren kunnen leiden tot genderongelijkheid 3. Bij varkens oorzaken van sex-ratio onbalans onder vaderlijke ras 4, baarmoeder capaciteit 5, en de zeug metabole voorwaarde 6. Waarbij de verschillen waargenomen in embryo's en nesten kan worden beïnvloed door sexual dimorfisme, moeten onderzoekers zich bewust zijn van embryo sex en sex ratio's alvorens conclusies te trekken ten aanzien van hun onderzoek. De ontwikkeling van efficiënte instrumenten en protocollen voor geslachtsbepaling varken embryo's op dag 30 van de ontwikkeling zal hier worden besproken.
Verscheidene werkwijzen van geslacht typen zijn ontwikkeld voor genetische studies in modelorganismen en vee. Met name in de veehouderij, het identificeren van de mannelijke en vrouwelijke vroege embryo's is een veel voorkomende praktijk genetische selectie te verbeteren voor fokprogramma's. Vroege embryo karyotypering in varkens gebruik Giemsa 7 of intense fluorescentie 8,9 technieken gebruikt voor seks typen. Deze werkwijzen zijn tijdrovend en niet geschikt voor het screenen van grote aantallen embryo's snel en nauwkeurig.
De meest effectieve sex typeringsmethode DNA amplificatie met behulp van een warmtestabiel DNA polymerase en een paar primers. Geslachtsbepaling DNA door PCR methode is specifiek, snelle en gevoelige, olleen die een minieme hoeveelheid van cellulaire materialen. De eerste PCR-gebaseerde embryo geslachtsbepaling werd uitgevoerd op mensen 10, en later in muizen 11, vee 12, buffels 13 en 14 schapen pre-implantatie embryo's. In het varken, werd de eerste DNA geslacht typeringsmethode vastgesteld voor pre-implantatie embryo's via een enkel paar Y-chromosoom specifieke DNA primers 15. Echter, de meest voorkomende PCR primers voor geslachtsbepaling werden geselecteerd uit het Y-chromosoom specifieke mannelijke SRY gen 16 en de niet-sekse discriminerende gebied van een zinkvinger gen aan beide X- en Y-chromosoom 17. Vervolgens werden deze primers toegepast op het geslacht van dag 30 embryo's in deze studie met een verbeterde specificiteit van de primers bepaalt alleen de X- chromosoom van een zinkvinger gen detecteren.
Genomisch DNA uit varken pre-implantatie embryo kan worden geëxtraheerd door het blootstellen van een intact blastocyst buffer met proteinase K 16 of door middel van een biopsie van een aantal cellen van het individu vroege embryo splitsing 15 en het gebruik voor directe PCR. Echter, introductie van DNA uit varkensbloed, haar, weefsel of een grote conceptus over enkele centimeters groot is niet effectief gedaan met behulp van proteinase K methode. DNA-extractie voor deze materialen werden vastgesteld met behulp van tijdrovende fenol / chloroform protocollen 6 of dure kolom gebaseerde kits 18. Om het gebruik van potentieel toxische stoffen te vermijden, is er een trend om goedkoop, eenvoudig en fenol-vrij DNA extractie te ontwikkelen. Dit type protocol voor de isolatie van PCR-kwaliteit genomisch DNA van de muis 19 en 20 zebravis weefsels werd vastgesteld met behulp van hete natriumhydroxide en Tris (HOTSHOT). Deze studie geeft een protocol om DNA te verkrijgen met gemodificeerde hotshot en vernieuwde duplex primerparen voor de PCR sex direct te typen van cellysaten van de Dag 30 embryo's van varkens methoge nauwkeurigheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In overeenstemming met de Canadian Council on Animal Care richtlijnen en met instemming van de faculteit Animal Welfare Policy en Committee - Vee van de Universiteit van Alberta, werden drachtige zeugen gedood door geschoold personeel op ongeveer dag 30 van de zwangerschap en embryo's werden verzameld. Gebruik onderzoekshandschoenen te allen tijde gedurende de procedures.
1. Sample Collection en Sample Storage
- Euthanaseren zeug met behulp penschiettoestel gevolgd door verbloeding. Draag onderzoekshandschoenen voor de voortplanting traktaten en embryo's te verzamelen van elke geëuthanaseerd zeug.
Opmerking: Rapid verzamelen van monsters en overdracht van embryo's te drogen ijs of vloeibare stikstof zal resulteren in een hogere kwaliteit van de weefsels voor andere moleculaire werken zoals microarray en qPCR. - Ontleden de baarmoeder en voorzichtig scheiden alle embryo's op hun extra-embryonale placentamembranen van de onderliggende baarmoederwand 21. Zorg ervoor dat er geen moederlijk weefsel besmetting.
- Opnieuwlengte koord en het gewicht van alle levensvatbare embryo's voor het invriezen.
- Verzamel elk individu embryo en meteen wikkel het in een aluminium folie voordat snap bevriezen met vloeibare stikstof.
- Breng de ingevroren embryo's uit vloeibare stikstof rechtstreeks naar een -80 ° C vriezer.
2. Malen Embryo's
- Label alle monsterbuizen (15 ml) met het monster ID nodig is voor het aantal monsters dat moet worden geanalyseerd.
- Vul thermische container met droog ijs om half vol en steek de pre-gelabelde monsterbus in het droogijs.
- Draag winter handschoenen met een ander paar onderzoekshandschoenen op de top voor het overbrengen van de pre-gekoelde mortieren en stampers van -80 ° C vriezer om ijs container drogen.
- De bevroren embryo in de mortel op het droogijs.
- Giet voldoende vloeibare stikstof om het embryo te dekken en vermalen met stamper tot een fijn poeder.
- Breng het embryo poeder een gelabelde monsterbuis met een microspatula (figuur 1) en plaats de buis in een -80 ° C vriezer.
- Gebruik een schone pre-gekoelde vijzel voor elk embryo en verander de onderzoekshandschoenen na het slijpen elk embryo om kruisbesmetting tussen de monsters te voorkomen.
3. Genomic DNA Voorbereiding gebruik van gewijzigd natriumhydroxide Method
- Label alle microcentrifugebuizen (1,5 ml) die nodig is voor het aantal monsters dat moet worden geanalyseerd.
- Breng de monsterbuizen met embryo poeder uit de -80 ° C vriezer om een container met droog ijs voor het begin.
- Pipetteer 180 ul van 50 mM NaOH (natriumhydroxide) in elk gelabelde microcentrifugebuis.
- Schakel een incubator voorverwarmen tot 95 ° C.
- Gebruik een tandenstoker om de juiste hoeveelheid embryo poeder (ongeveer 5-10 mg) (Figuur 2) brengen van de monsterbuis in een vooraf gemerkte microcentrifugebuis met de 50 mM NaOH-oplossing.
- Trek up langzaam dezelfde tandenstoker in het DNA lysaat visualiseren als een kleverige, kleverige, witte transparante stof (figuur 3).
- Breng de microcentrifugebuizen met DNA lysaat aan de voorverwarmde incubator bij 95 ° C gedurende vijf minuten. Onmiddellijk overdracht van de buis naar een piepschuim doos gevuld met ijs.
- Voeg 20 ul van 1 M Tris-HCl direct in de microcentrifugebuis en meng voorzichtig door de buis te tikken. Gebruik een pH papier zorgen dat de pH ongeveer 8,0 (figuur 4) voorafgaand aan centrifugatie.
Opmerking: Bij de behandeling van een groot aantal van het monster voorbereiding, is het aanvaardbaar om willekeurig halen enkele voorbeelden om de pH te controleren. - Centrifugeer de buis met de DNA lysaat bij 2000 xg in een microcentrifuge gedurende twee minuten bij kamertemperatuur opgelost weefselafval te verwijderen.
- Overdracht 150 ul van de bovenste heldere supernatant naar een nieuwe buis of 96 putjes.
Opmerking: De heldere lysaat DNA is klaar voor gebruik als sjabloon op PCR reactie en is stabiel bij 4 ° C gedurende twee weken, of het kan bij -20 ° C gedurende een jaar houdbaar.
4. Ontwerp Geslacht-specifieke PCR primers
- Verkrijgen van de toetreding nummers voor Porcine seks bepalend gebied Y (SRY) (NM_214452.3) en en zinkvingereiwit X-gebonden (ZFX) genen (XM_005673501.1) van NCBI website http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
- Kopieer en deze NCBI toetreding nummers plakken om een online primer design tool.
Opmerking: De beste primers informatie zoals lengte, Tm en GC% en PCR productgrootte (bp) gegenereerd op het scherm (Afbeelding 5). - Valideer de specificiteit van deze primers gebruiken nucleotide Blast programma (BLASTN) tegen de huidige varkens genomische gegevensbank 104 te waarborgen deze sequenties alleen op X- en Y-chromosoom voor SRY en ZFX respectievelijk (figuur 6).
5. Genomic DNA PCR Direct vanuit DNA Lysaten
- Gebruikslechts 1 pl van het lysaat DNA als een matrijs voor een 15 ul PCR reactie.
Opmerking: Een high throughput screening werkwijze voor 96 putjes PCR kan worden uitgevoerd op vergelijkbare wijze met een multichannel pipet. - Gebruik de volgende alleen voor de eerste PCR: bereid een PCR-buis voor de no template negatieve controle en twee extra buizen voor positieve controles door het toevoegen van 1 pl (0,5 ng) van de handel verkregen bekende geslacht varken genoom DNA. Later, onder meer een monster van de laatste succesvolle sexing analyse als een positieve controle en lopen samen met de nieuwe PCR-reactie voor geslachtsbepaling.
- Gebruik een HotStart klaar mix PCR enzym en bereiden een master mix door het toevoegen van primers en nuclease gratis water, afhankelijk van het totale aantal PCR-reacties. Voeg 1 pl van het lysaat DNA in een vooraf bestaande PCR buis met 14 ul van het PCR master mix. primers voegen zodat de uiteindelijke concentratie van de primers van beide geslacht-specifieke genen is 0,3 uM in totaal 15 pi PCR reaction.
- Zet de volgende PCR programma in een PCR-apparaat: 95 ° C gedurende 3 minuten, 35 cycli elk met een 20 sec smeltstap 98 ° C, gevolgd door een 15 seconden annealing stap bij 65 ° C, gevolgd door 15 sec elongatiestap bij 72 ° C. In een laatste stap, incubeer de reacties gedurende 1 min bij 72 ° C en verder geïncubeerd bij 4 ° C totdat verwijdering van de PCR buis gelelektroforese controle om het geslacht te bepalen.
Opmerking: PCR-omstandigheden en optimalisatie zijn volgens de handleiding van de in de tabel genoemde Materials PCR kit. - Voeg de juiste hoeveelheid niet-toxische groen- fluorescent SYBR DNA gel vlek bij de voorbereiding van een 2% TBE agarosegel.
Opmerking: Ethidiumbromide vervangen groen- fluorescerend vlek kan als het niet beschikbaar is. - Voeg 1,5 gl van de ladingskleurstof (10x) in de PCR-buis en meng door pipetteren de PCR reactiebuffer up-and-down.
- Load 10 ul van het monster in de put en run de agarose gel met de juiste spanning instellingen (kleine gel apparaat bij 100 V, 96 putjes gel apparaat bij 150 V totdat de kleurstof band loopt halverwege de gel).
- Observeren en pas de bands intensiteiten onder de tl-licht instelling met een laserscanner en vastleggen van een beeld van de gel. Opmerking: Common gel imager kan worden vervangen door de ethidiumbromide gel.
- Bepaal het geslacht van de embryo's van varkens door identificatie embryo met één band als een vrouwelijke en twee banden als mannelijke (figuur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een representatief resultaat van geslachtsbepaling van 345 DNA lysaten screening door PCR wordt getoond in Figuur 7 en samengevat in tabel 1.
Zoals te zien in figuur 7, de primers annealing temperatuur 65 ° C is de optimale conditie in het PCR-protocol genereren gelijke intensiteit en voorspelde amplicon groottes (figuur 5) tussen verschillende monsters.
Twee geamplificeerde producten van SRY (400 bp) en ZFX (506 bp) worden getoond in de gel foto (figuur 7). Mannelijke embryo toonde twee DNA-fragmenten met de juiste grootte van de bovenste (400 bp) en onderste (506 bp) bands. De intensiteit van deze twee banden bleek gelijk meeste mannelijke individuen zijn. Alle vrouwelijke embryo toonde slechts één DNA-fragment dat overeenkomt met de ZFX gen in hetX-chromosoom.
DNA lysaten verkregen van de gemodificeerde 50 mM NaOH kan direct gebruikt voor PCR met een hoog rendement en nauwkeurigheid. DNA lysaten geen enkele PCR reactie remming na het screenen van 345 embryo's te laten zien. Slechts drie personen waren niet gesekst en het percentage vrouwelijke embryo's was iets hoger dan bij mannen (tabel 1).
Figuur 1:. Embryo Poeder transferring embryo poeder om een 15 ml buis.
Figuur 2: Het verzamelen en overdragen Embryo poeder met een tandenstoker (A) Een overmatige hoeveelheid embryo poeder vast te houden aan de tandenstoker.. (B) juiste hoeveelheidembryo poeder vast te houden aan de tandenstoker te worden overgedragen aan de alkalische lysis reagens oplossing. (C) Een onvoldoende hoeveelheid embryo poeder vast te houden aan de tandenstoker.
Figuur 3:. DNA visualisatietechniek langzaam trek de tandenstoker, na toevoeging van het embryo poeder, om te bepalen of het embryo DNA opgelost als een kleverige witte transparante kleverige substantie.
Figuur 4:. PH bevestiging (A) pH van de oplossing natriumhydroxide (alkaline lysis reagens) is 12,0. (B) Na toevoeging neutralisatie buffer om de lysisbuffer, kleurindicatie pH papier groen en de pH moet rond 8,0.
Figuur 5:.. Sex-specifieke Primer Information Sequence namen, Sequences en de amplicon lengte verkregen uit de primer design tool Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: in kaart brengen van Varkens Sex-specifieke primers op chromosoom X en Y. (A) Locatie van de voorwaartse en omgekeerde primers die op de ZFX-gen. (B) Locatie van de voorwaartse en omgekeerde primers die op het SRY-gen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7:. PCR Amplificatie van Porcine Sex-specifieke genen van dag 30 embryo 2% TBE agarosegel gekleurd met SYBR DNA gel vlek met de bekende positieve controles worden aangeduid met mannelijke en vrouwelijke symbolen. Twee bands aangeduid als mannen en een enkele band als vrouwtjes. Rode ster aangegeven mogelijke contaminatie monster in de put met de verschijning van een zeer zwakke onderband (400 bp) in vergelijking met de bovenste band (506 bp) PCR product door SRY Y-specifieke primers. Rode pijl geeft het geen template PCR negatieve controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| geslachtsbepaling PCR | embryo Count | |
| ♀ | 185 | 53,60% |
| ♂ | 157 | 45.50% |
| Onbekend | 3 | 0,90% |
| Totaal | 345 | 100% |
Tabel 1: Percentage van de Vrouw, man en Unknown na PCR Sexing onder 345 Dag 30 embryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meeste bestaande protocols gerelateerd aan varkensembryo's sex DNA typering zijn alleen geschikt voor beginnende pre-implantatie fase 15,16. We hebben met succes een protocol geschikt is voor varkens embryo screening ontwikkeld tijdens de late zwangerschap. Gebaseerd op studies met gelijke ontwikkelingsstadia van embryo's uit eerdere studies 6,18, is de onderhavige protocol als veiliger en lage kosten.
Dit protocol is geschikt voor een groot aantal monsters voor sexuele typing using PCR door het overbrengen van de DNA lysaten in een 96-wells plaat. De plaat-formaat maakt het mogelijk high-throughput screening door de overdracht 1 ul van DNA-lysaat voor de PCR-reactie met behulp van een multichannel pipet.
Toch moet een aantal stappen betrokken bij de procedure zorgvuldig gebeuren. Om het gemodificeerde 50 mM NaOH lysiswerkwijze efficiënter uitvoeren, is het individueel ingevroren embryo geaard tot fijn poedergebruik van een vooraf gekoelde (-80 ° C) mortier en stamper. Voorkom dat embryo poeder op het droogijs, door langzaam en voorzichtig schrapen het poeder in de 15 ml buis, zie figuur 1. Veranderen onderzoekshandschoenen na elk monster aanbeveling hierbij poeder voorkomen op de handschoen overdraagt aan embryo monster.
De geschikte hoeveelheid embryo poeder worden toegevoegd aan het gemodificeerde 50 mM NaOH lysisoplossing is getoond in figuur 2B. Te veel embryo poeder wordt getoond in Figuur 2A en moet worden vermeden. Ook in figuur 2C, de hoeveelheid embryo poeder kan onvoldoende zijn voor stroomafwaartse procedures. Hoewel het wegen van de embryo poeder voor elk monster mogelijk is, is het niet praktisch bij het screenen van embryo seks in een grootschalig onderzoek bij meer dan honderd embryo's.
De hoeveelheid DNA kan zichtbaar worden geverifieerd met een tandenstoker om te controleren op de kleverige gooey substantie zoals getoond in figuur 3, als het twijfelachtig of de juiste hoeveelheid poeder in de vorige stap werd toegevoegd.
Toevoegen van de juiste hoeveelheid neutralisatieoplossing belangrijk na lyseren van de embryo poeder. Figuur 4 toont de pH-verandering na en voor het toevoegen neutralisatieoplossing. Deze stap is belangrijk ervoor te zorgen dat de pH licht alkalisch (ongeveer 8,0) en derhalve vergelijkbaar met de meeste PCR reactie buffers.
Specificiteit van de primers oligo is de belangrijkste factor voor de nauwkeurigheid van DNA geslachtsbepaling gedurende PCR. De specificiteit van de oligo-primers kunnen worden bevestigd door het NCBI BLASTN programma. Eén locatie wordt gedetecteerd op het X chromosoom in het 3 'niet-coderende gebied van het gen voor ZFX elke primer sequentie (Figuur 6A) voor vrouwen. Een vergelijkbare situatie wordt alleen gedetecteerd in de Y-chromosoom in de coderende regio SRY gen (Figuur 6B
Foutenpercentage vanwege geen determinatie kan zeer laag (<1%) zoals getoond in tabel 1, wanneer alle stappen zorgvuldig en correct verlopen. In zeldzame gevallen kruisbesmetting tussen DNA lysaten van twee verschillende monsters mogelijk en kunnen worden gedetecteerd door PCR zoals aangegeven met een rode ster in de gel (figuur 7). Dit type bandpatroon bij vrouwelijke kan worden geïnterpreteerd als kruisbesmetting met een mannelijke monster.
Het is onwaarschijnlijk dat de verschijning van een zeer zwakke onderband komt door de concurrentie primer voor PCR reagentia. In dit geval zal de kleinste amplicon (400 bp) met betrekking tot de SRY gen meer PCR product sneller dan de hogere band die overeenkomt met de ZFX gen te genereren. In dit protocol, een nadeel is de bepaling van kruisbesmetting van een mannelijke monster met een vrouwelijke. Omdat ons belangrijkste doel is niet kwantificeren van de kopie nummer voor elke target-gen, een kleinhoeveelheid poeder van de vrouwelijke steekproef moeilijk te visualiseren op de gel.
De DNA sexen protocol hier gepresenteerde is de meest kosten effectieve methode om embryo geslacht identificeren later tijdens de zwangerschap en kunnen worden toegepast op andere grote dieren zoals runderen, schapen en geiten. Ook is vergelijkbaar DNA geslachtsbepaling methode is toegepast bij varkens die verband houden met zeugen metabolische aandoening 18. Ander onderzoek onderzoek middels DNA sexen kan worden toegepast op de genomische imprinting mechanisme te bestuderen tijdens de prenatale programmering van postnatale ontwikkeling bij het varken 22. Een breed scala van toepassingen in de veehouderij met behulp van DNA PCR geslachtsbepaling is mogelijk, zoals pre-sex selectie fokprogramma's, en epigenetische effecten van voeding en infectieziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de samenwerking en de financiële bijdragen van de volgende onderzoeksfinanciering agentschap erkennen: Alberta Vee en Vlees Agency Ltd, varkensvlees CRC, Alberta varkensvlees, Hypor A Hendrix Genetics Company en NSERC CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
References
- Seidel, G. E. Economics of selecting for sex: the most important genetic trait. Theriogenology. 59, 585-598 (2003).
- Gutiérrez-Adán, A., et al. Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development. Reprod. Domest. Anim. 41, Suppl 2. 54-62 (2006).
- Rosenfeld, C. S., Roberts, R. M. Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review. Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).
- Gorecki, M. T. Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758). Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).
- Chen, Z. Y., Dziuk, P. J. Influence of initial length of uterus per embryo and gestation stage on prenatal survival, development, and sex ratio in the pig. J. Anim. Sci. 71, 1895-1901 (1993).
- Vinsky, M. D., Novak, S., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Foxcroft, G. R. Nutritional restriction in lactating primiparous sows selectively affects female embryo survival and overall litter. Reprod. Fertil. Dev. 18, 347-355 (2006).
- Cassar, G., King, W. A., King, G. J. Influence of sex on early growth of pig conceptuses. J. Reprod. Fertil. 101, 317-320 (1994).
- Zudova, D., Rezacova, O., Kubickova, S., Rubes, J. Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 102, 179-183 (2003).
- Hornak, M., Oracova, E., Hulinska, P., Urbankova, L., Rubes, J. Aneuploidy detection in pigs using comparative genomic hybridization: from the oocytes to blastocysts. PLoS One. 7, (2012).
- Handyside, A. H., Pattinson, J. K., Penketh, R. J., Delhanty, J. D., Winston, R. M., Tuddenham, E. G. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet. 1, 347-349 (1989).
- Wilton, L. J., Shaw, J. M., Trounson, A. O. Successful single-cell biopsy and cryopreservation of preimplantation mouse embryos. Feri. Steril. 51, 513-517 (1989).
- Peura, J. M., Turunen, M., Janne, J. A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction. Theriogenology. 35, 547-555 (1991).
- Rao, K. B., Pawshe, C. H., Totey, S. M. Sex determination of in vitro developed buffalo (Buhalus buhalis.) embryos by DNA amplification. Mol. Reprod. Dev. 36, 291-296 (1993).
- Herr, C. M., Matthaei, K. I., Petrzak, U., Reed, K. C. A rapid Y-chromosome-detecting ovine embryo sexing assay. Theriogenology. 33, 245 (1990).
- Fajfar-Whetstone, C. J., LaneRayburn, A., Schook, L. B., Wheeler, M. B. Sex determination of porcine during preimplantation embryos via y-chromosome specific DNA sequences. Animal Biotechnology. 4, 183-193 (1993).
- Pomp, D., Good, B. A., Geisert, R. D., Corbin, C. J., Conley, A. J. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim. Sci. 73, 1408-1415 (1995).
- Aasen, E., Medrano, J. F. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Biotechnology (N Y). 8, 1279-1281 (1990).
- Oliver, G., et al. Restricted feed intake in lactating primiparous sows. II. Effects on subsequent litter sex ratio and embryonic gene expression. Reprod Fertil. Dev. 23, 899-911 (2011).
- Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R. L., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29, 52-54 (2000).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos. Biotechniques. 43, 610-614 (2007).
- Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts. Animal. 8, 293-299 (2014).
- Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L. Prenatal programming of postnatal development in the pig. Control of Pig Reproduction VIII. Rodriguez-Martinez, , Nottingham University Press. 212-213 (2009).
