Abstract
Die Erforschung pränatale Programmierung in das Schwein hat gezeigt, dass das Geschlecht des sich entwickelnden Embryo oder Fötus das Entwicklungsergebnis beeinflussen können. Daher ist die Fähigkeit, ein Embryo, das Geschlecht zu bestimmen, ist notwendig, viele Experimente besonders früh Entwicklung. Dieses Protokoll zeigt, eine kostengünstige, schnelle und nicht-toxische Herstellung von Schweine genomische DNA zur Verwendung mit PCR. Tag 30 Embryonen auf humane Weise den Richtlinien festgelegt nach durch Institutional Animal Politik und Wohlfahrtsausschüsse für das vorliegende Protokoll gesammelt werden müssen. Die Herstellung des gesamten Embryos für diese PCR basiert sexing Technik einfach beinhaltet die gefrorenen Embryos zu einem feinen Pulver Mahlen eines vorgekühlten Mörser und Pistill. PCR-Qualität-DNA wird aus einer kleinen Menge von Embryo Pulver freigesetzt durch eine heiße Inkubation in einem alkalischen Lyse-Reagenz aufgebracht wird. Als nächstes wird die DNA-Lösung mit Neutralisationspuffer gemischt und direkt für die PCR verwendet. Zwei Primerpaare erzeugt UVEKt bestimmte Geschlechtsbestimmungsbereich des Y-Chromosoms (SRY) und ZFX Bereich des X- Chromosoms mit hoher Genauigkeit und Spezifität. Das gleiche Protokoll kann auf andere längliche Embryonen (Tag 10 bis Tag 14) früher als Tag angewendet werden 30. Auch kann dieses Protokoll mit 96 quoll Platten durchgeführt werden, wenn eine große Anzahl von Embryos Screening, so dass es möglich für die Automation und Hoch Durchsatz Sex Typisierung.
Introduction
Das Hausschwein hat sowohl eine grundlegende Forschungsgegenstand in der Entwicklung, Genetik und Ernährung in den Bereichen Mensch und Vieh werden. Das Potential von Schweinen als biomedizinische Modelle für die Forschung mit menschlichen können, um ihre physiologischen Ähnlichkeiten zurückgeführt werden. In Nutztiere, kann die Manipulation von Geschlechterverhältnis, die Wirksamkeit der Selektion und Zuchtprogramme 1 erhöhen. Sexing einzelnen Embryonen ist ein grundlegendes Werkzeug in vielen experimentellen Untersuchungen verwendet, einschließlich, jedoch nicht zu Genotyp, Epigenetik und X-Inaktivierung von Geschlechtsunterschied in der frühen Embryonalentwicklung 2 beschränkt.
Studien an Mäusen legen nahe, dass mütterliche Ernährung und andere Faktoren in Geschlechterungleichgewicht 3 führen kann. Bei Schweinen Ursachen des Ungleichgewichts Geschlechterverhältnis sind väterlichen Zucht 4, Gebärmutter-Kapazität 5, und die Stoffwechsellage der Sau 6. Da die beobachteten Unterschiede in Embryonen und Würfe können durch an sich beeinflusst werdenxual Dimorphismus, sollten Forscher bewusst Embryo Sex und Geschlechterverhältnisse, bevor Rückschlüsse auf ihre Forschung zu ziehen. Die Entwicklung von leistungsfähigen Werkzeugen und Protokollen für die Geschlechtsbestimmung Schwein Embryonen an Tag 30 der Entwicklung werden hier diskutiert.
Verschiedene Methoden der Geschlechtstypisierung wurden für genetische Studien in Modellorganismen und Viehzucht entwickelt. Besonders in der Tierhaltung, frühen Embryonen männliche und weibliche Identifizierung ist eine sehr gängige Praxis genetische Selektion für Zuchtprogramme zu verbessern. Am frühen Embryonen in der Schweine Karyotypisierung mit Giemsa 7 oder die intensive Fluoreszenz 8,9 Techniken wurden für Sex Typisierung verwendet. Jedoch sind diese Verfahren zeitaufwendig und eignet sich nicht für das Screening einer großen Anzahl von Embryonen schnell und genau.
Die effektivste Methode ist, sex Typisierung DNA-Amplifikation eine hitzestabile DNA-Polymerase und zwei Primern. DNA-Geschlechtsbestimmung durch PCR-Methode ist präziser, schneller und empfindlicher, our erfordert eine winzige Menge von Schaumstoffen. Die erste PCR-basierte Embryo Geschlechtsbestimmung wurde am 10. Menschen durchgeführt und später in Mäusen 11, Rinder 12, Büffel, Schafe 13 14 pre-Implantation-Embryonen. Beim Schwein wurde der früheste DNA Sex Typisierungsmethode für Präimplantationsembryonen etabliert über ein einziges Paar von Y-Chromosom-spezifischen DNA-Primer 15. Jedoch waren die häufigsten PCR-Primer für die Geschlechtsbestimmung von dem Y-Chromosom der männlichen spezifischen Gens SRY 16 ausgewählt, und der nicht-geschlechtsspezifischen diskriminierende Bereich einer Zinkfinger-Gen an beiden X und Y-Chromosom 17 befindet. Anschließend wurden diese Primer wurden in dieser Studie mit verbesserter Spezifität der Primer zu erfassen nur die X- Chromosom eines Zinkfinger-Gen, das Geschlecht Tag 30-Embryonen zu bestimmen aufgetragen.
Genomische DNA aus Schweine Präimplantationsembryonen kann durch Belichten eines intakten Blastozyste mit proteinas zum Puffern extrahiert werdene K 16 oder durch eine Biopsie von wenigen Zellen aus den einzelnen frühen Spaltung unter Embryonen 15 und für direkte PCR. Jedoch Freisetzung von DNA aus Schweineblut, Haare, Gewebe oder einem großen conceptus über einige Zentimeter groß ist nicht effektiv getan, um die Proteinase K-Methode. DNA-Extraktionsverfahren für diese Materialien wurden 18 entweder zeitaufwendig Phenol / Chloroform-Protokolle 6 oder teuer Spalte basiert Kits hergestellt. Um die Verwendung von potentiell toxischen Chemikalien zu vermeiden, gibt es einen Trend kostengünstig, einfach und phenolfrei DNA Extraktionsverfahren zu entwickeln. Diese Art von Protokoll für die Isolierung von PCR-Qualität genomische DNA von der Maus 19 und Zebrafisch 20 Geweben wurde unter Verwendung von heißem Natriumhydroxid und Tris (HOTSHOT) etabliert. Diese Studie liefert ein Protokoll DNA mit modifizierten Hotshot und neu gestaltet Duplex Primerpaare für die PCR-Sex Eingabe direkt aus Zelllysaten von Tag 30 Schweineembryonen zu erhalten mithohe Genauigkeit.
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Protocol
In Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care-Richtlinien und mit Zustimmung der Fakultät Tierpolitik und Wohlfahrtsausschuss - Viehzucht von der University of Alberta, wurden trächtige Sauen durch geschultes Personal bei ungefähr Tag eingeschläfert 30 der Schwangerschaft und Embryonen wurden gesammelt. Verwenden Untersuchungshandschuhen jederzeit im Verlauf der Verfahren.
1. Probenentnahme und Probenlagerung
- Euthanize Sau mit durch Ausbluten gefolgt Bolzen. Tragen Untersuchungshandschuhe, die Fortpflanzungsorgane und Embryonen aus jeder eingeschläfert Sau zu sammeln.
Hinweis: Schnelle Entnahme von Proben und Transfer-Embryonen Eis oder flüssiger Stickstoff zum Trocknen in höherer Qualität Gewebe für andere molekulare Arbeiten wie Microarray und qPCR führen. - Präparieren Sie die Gebärmutter und sanft trennen alle Embryonen in ihren extraPlazentaMembranen von der darunter liegenden Gebärmutterwand 21. Achten Sie darauf, keine mütterliche Gewebe Kontamination ist.
- ReKabellänge und Gewicht aller lebensfähigen Embryonen vor dem Einfrieren.
- Sammeln Sie jeden einzelnen Embryo und sofort einpacken in einer Aluminiumfolie vor Schnapp mit flüssigem Stickstoff einfrieren.
- Übertragen Sie die eingefrorenen Embryonen aus flüssigem Stickstoff direkt zu einem -80 ° C Gefrierschrank.
2. Schleif Embryonen
- Beschriftet alle Probenröhrchen (15 ml) mit dem ID Probe für die Anzahl der erforderlichen Proben werden analysiert.
- Füllen Thermobehälter mit Trockeneis zu halb voll und legen Sie die Pre-markierten Probenröhrchen in dem Trockeneis.
- Wear Winterhandschuh mit einem anderen Paar von Untersuchungshandschuhe an der Spitze für die Übertragung der vorgekühlten Mörser und Stößel von -80 ° C Gefrierschrank Eisbehälter zu trocknen.
- Das tiefgefrorene Embryos innerhalb der Mörtel auf dem Trockeneis.
- Gießen Sie ausreichend flüssigem Stickstoff, den Embryo zu decken und schleifen sie mit dem Stößel zu einem feinen Pulver.
- Übertragen des Embryos Pulver zu einer vorher markierten Probenröhrchen mit einem MICRospatula (Abbildung 1) und legen Sie den Schlauch in einem -80 ° C Gefrierschrank.
- Verwenden Sie ein sauberes vorgekühlten Mörser und Stößel für jeden Embryo und ändern Sie die Untersuchungshandschuhe nach jeder Embryo Schleifkreuzkontamination zwischen den Proben zu vermeiden.
3. Die genomische DNA-Präparation mit modifizierten Natriumhydroxid Methode
- Label alle Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml), die für die Anzahl von zu analysierenden Proben.
- Übertragen Sie die Probenröhrchen enthält Embryo-Pulver aus dem -80 ° C Gefrierschrank in einen Behälter mit Trockeneis vor dem Start.
- Pipettieren 180 ul 50 mM NaOH (Natriumhydroxid) in jedes pre-markierten Reaktionsgefäß.
- Aktivieren eines Inkubators und Vorheizen auf 95 ° C.
- Verwenden einen Zahnstocher die richtige Menge an Pulver Embryo zu übertragen (etwa 5-10 mg) (Abbildung 2) aus dem Probenröhrchen in eine vorge markierten Mikrozentrifugenröhrchen, die 50 mM NaOH-Lösung enthält.
- ziehen up die gleiche Zahnstocher langsam die DNA Lysat als klebrig, klebrig, weiß transparent artige Substanz (Abbildung 3) zu visualisieren.
- Übertragen die Mikrozentrifugenröhrchen mit DNA Lysat vorgeheizten Brutschrank bei 95 ° C für fünf Minuten. Sofortüberweisung um die Röhre zu einer Styroporbox mit Eis gefüllt.
- In 20 ul 1 M Tris-HCl direkt in das Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie es, indem Sie vorsichtig den Schlauch tippen. Verwenden, um eine pH-Papier, um sicherzustellen, der pH-Wert beträgt etwa 8,0 (4) vor der Zentrifugation.
Hinweis: Wenn Sie mit einer großen Anzahl von Probenvorbereitungen zu tun, es akzeptabel ist, nach dem Zufallsprinzip einige Proben nehmen Sie den pH-Wert zu überprüfen. - Zentrifugieren des Röhrchens mit der DNA Lysat bei 2000 xg in einer Mikrozentrifuge für zwei Minuten bei Raumtemperatur ungelöst Gewebetrümmer zu entfernen.
- Transfer 150 ul der oben klare Überstand in ein neues Röhrchen oder Platten mit 96 Vertiefungen.
Hinweis: Die klare DNA Lysat bereit ist, als Vorlage im PC nutzenR Reaktion und es ist stabil bei 4 ° C für zwei Wochen oder er kann für ein Jahr bei -20 ° C aufbewahrt werden.
4. Design Sex-spezifische PCR-Primer
- Erhalten Zugangsnummern für Schweine Geschlecht bestimmende Region Y (SRY) (NM_214452.3) und und Zinkfinger-Protein X-chromosomal (ZFX) Gene (XM_005673501.1) von NCBI Webseite http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
- Kopieren Sie diese NCBI-Zugangsnummern zu einer Online-Primer-Design-Tool.
Hinweis: Die beste Primer Informationen einschließlich der Länge, Tm und GC% sowie PCR-Produkt Größe (bp) wird auf dem Bildschirm erzeugt werden (Abbildung 5). - Überprüfen der Spezifität dieser Primer Nukleotid BLAST-Programm (Blastn) gegen den Strom porcine genomischen Datenbank 104 diese Sequenzen, um sicherzustellen, werden nur sich auf X und Y-Chromosom für SRY und ZFX jeweils (Abbildung 6).
5. genomischer DNA PCR direkt aus DNA Lysate
- Benutzennur 1 ul der DNA-Lysat als Vorlage für eine Reaktion 15 ul PCR.
Hinweis: Ein Hochdurchsatz-Screeningverfahren für 96-Well-Platten PCR kann in ähnlicher Weise durchgeführt werden, um eine Mehrkanalpipette. - Sie haben folgende Möglichkeiten nur für die erste PCR: Vorbereitung einer PCR-Röhrchen für die keine Vorlage Negativkontrolle und zwei zusätzliche Rohre für positive Kontrollen durch Zugabe von 1 & mgr; l (0,5 ng) im Handel erhältlich bekannt Sex Schweine genomischer DNA. Später gehören eine Probe aus dem letzten erfolgreichen Geschlechtsbestimmung Analyse als eine positive Kontrolle und gemeinsam für die Geschlechtsbestimmung mit dem neuen PCR-Reaktion führen.
- Verwenden Sie eine beliebige HotStart Fertigmischung PCR Enzym und bereiten durch Zugabe von Primern einen Master-Mix und Nuclease Reaktionen freies Wasser in Abhängigkeit von der Gesamtzahl der PCR. 1 ul der DNA-Lysat in einem bereits vorhandenen PCR-Röhrchen mit 14 ul des PCR-Mastermix. Hinzufügen Primer, so dass die Endkonzentration der Primer aus zwei geschlechtsspezifische Gene 0,3 uM in insgesamt 15 ul PCR reaction.
- Legen Sie die folgende PCR-Programm in einem Thermocycler up: 95 ° C für 3 min, 35 Zyklen mit jeweils 20 sec Schmelzschritt 98 ° C, gefolgt von einem 15 Sek Temperschritt bei 65 ° C, gefolgt von einem 15 Sek Elongationsschritt bei 72 ° C. In einem letzten Schritt, Inkubieren der Reaktionen für 1 min bei 72 ° C und weiter bei 4 ° C bis zur Entfernung der PCR-Röhrchen für die Gelelektrophorese Überprüfung zu inkubieren, das Geschlecht zu bestimmen.
Hinweis: Die PCR-Bedingungen und Optimierung werden entsprechend der Bedienungsanleitung des PCR-Kits in der Werkstoff-Tabelle erwähnt. - In der entsprechenden Menge an nicht-toxischen grün- fluoreszierenden SYBR DNA Gel Fleck, wenn eine 2% TBE Agarose-Gel vor.
Hinweis: Ethidiumbromid kann für Grün- Fluoreszenzfarbstoff ersetzt werden, wenn es nicht verfügbar ist. - In 1,5 ul der Ladepuffer (10x) in die PCR-Röhrchen und mischen Sie gut durch die Reaktion Puffer PCR Pipettieren up-and-down.
- Last 10 ul der Probe in die Vertiefung und run das Agarosegel mit entsprechenden Spannungseinstellungen (small Gel-Apparatur bei 100 V, 96-Well-Gel-Apparatur bei 150 V, bis der Farbstoff Band läuft auf halbem Weg durch das Gel).
- Bitte beachten und die Bänder Intensitäten unter dem Fluoreszenzlicht Einstellung anpassen, um eine Laser-Scanner und ein Bild des Gels erfassen. Hinweis: Gemeinsame Gel-Imager für den Ethidiumbromidgel ersetzt werden.
- Bestimmen Sie das Geschlecht der Schweineembryonen von Embryonen mit einer Band als eine weibliche und zwei Bänder als männlich (Abbildung 7) zu identifizieren.
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Representative Results
Ein repräsentatives Ergebnis der Geschlechtsbestimmung von 345 DNA Lysaten Screening mittels PCR ist in Abbildung 7 und zusammengefasst in Tabelle 1 dargestellt.
Wie bei 65 ° C in Figur 7 ist der Primer Glühtemperatur sehen ist, ist die optimale Bedingung in diesem PCR-Protokoll ähnliche Intensität und prädizierten Amplikongrößen erzeugen (Figur 5) zwischen den verschiedenen Proben.
Zwei verstärkt Produkte von SRY (400 bp) und ZFX (506 bp) werden in dem Gel Bild (Abbildung 7) gezeigt. Männliche Embryos zeigte zwei DNA-Fragmente mit der richtigen Größe des oberen (400 bp) und untere (506 bp) Bands. Die Intensität der beiden Banden wurde gleich in den meisten männlichen Individuen erwiesen. Alle weiblichen Embryonen zeigte nur ein einziges DNA-Fragment, entsprechend dem ZFX-Gen in der LageX-Chromosom.
DNA Lysaten aus dem modifizierten 50 mM NaOH erhalten wurde, kann mit einer hohen Erfolgsquote und Genauigkeit direkt für die PCR verwendet werden. DNA Lysaten zeigten keine PCR-Reaktion Hemmung nach 345 Embryonen Screening. Nur drei Personen waren nicht sexed und der Anteil der weiblichen Embryonen war etwas höher als bei Männern (Tabelle 1).
Abb. 1: Embryo Powder Transfer Übertragen von Embryo-Pulver in ein 15-ml-Tube.
Abbildung 2: Sammeln und Übertragen von Embryo-Pulver mit einem Zahnstocher (A) Eine zu große Menge von Embryo-Pulver haftend auf die Zahnstocher.. (B) Die richtige Menge anEmbryo Pulver dem Zahnstocher Einhaltung der alkalischen Lyse Reagenzlösung übertragen werden. (C) Eine unzureichende Menge an embryo Pulver dem Zahnstocher haften.
Abb. 3: DNA-Visualisierungstechnik Ziehen Sie langsam den Zahnstocher auf, nach dem Hinzufügen des Embryo-Pulver, um festzustellen, ob der Embryo-DNA als klebrig klebrig weiß transparent artige Substanz aufgelöst hat.
Abb. 4: pH Bestätigung (A) pH-Wert der Natronlauge (alkalische Lyse-Reagenz) Lösung ist 12,0. (B) Nach Zugabe Neutralisationspuffer zu dem Lysepuffer, farbige Anzeige von pH-Papier ist grün und der pH-Wert sollte etwa 8,0 betragen.
Abb. 5:. Geschlechtsspezifische Primer-Informations-Sequenz-Name, die Folgen und die Länge Fragment aus der Primer-Design-Tool erhalten Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Abbildung von Porcine Sex-spezifische Primer auf Chromosom X und Y (A) Lage der nach vorne und umgekehrt Primer auf der ZFX Gen angegeben. (B) Lage des vorderen und umgekehrt Primer auf der SRY-Gen festgelegt. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 7: PCR-Amplifikation von Porcine Geschlechtsspezifische Gene von Tag 30 Embryonen 2% TBE Agarose-Gel mit SYBR DNA Gel Fleck mit den bekannten positiven Kontrollen gefärbt sind mit männlichen und weiblichen Symbolen angezeigt. Zwei Banden angegeben als Männer und eine einzelne Bande als Frauen. Roter Stern angegeben, die mögliche Kontamination der Probe in der Vertiefung mit dem Auftreten eines sehr schwache untere Bande (400 bp) im Vergleich zum oberen Band (506 bp) PCR-Produkt durch SRY Y-spezifischen Primern. Rote Pfeil zeigt die kein Template PCR Negativkontrolle. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Sexing PCR | Embryo Graf | |
| ♀ | 185 | 53.60% |
| ♂ | 157 | 45.50% |
| Unbekannt | 3 | 0,90% |
| Gesamt | 345 | 100% |
Tabelle 1: Anteil der weiblichen, männlichen und Unbekannte nach der PCR-Geschlechtsbestimmung bei 345 Tag 30 Embryonen.
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Discussion
Die meisten der bestehenden Protokolle im Zusammenhang mit Schweineembryonen DNA Sex Typisierung sind nur für den frühen Stadium vor der Implantation Stufe 15,16. Wir haben erfolgreich ein Protokoll für Schweineembryos Screening während der späten Schwangerschaft entwickelt. Basierend auf Studien mit ähnlichen Entwicklungsstadien von Embryonen aus früheren Studien 6,18 ist die vorliegende Protokoll als sicherer und kostengünstig zu sein.
Dieses Protokoll ist für eine große Anzahl von Proben für sex Typisierung geeignet PCR unter Verwendung von in eine 96-Well-Platte der DNA Lysaten übertragen. Die Plattenformat ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von der Transfer 1 ul DNA Lysat für die PCR-Reaktion ermöglicht eine Mehrkanalpipette.
Doch in das Verfahren einbezogen mehrere Schritte sollten sorgfältig durchgeführt werden. Um die modifizierte 50 mM NaOH Lyse-Verfahren effizienter hat die einzeln gefroren Embryos durchzuführen, geerdet zu feinem Pulver zu werdenmit einem vorgekühlten (-80 ° C) Mörser und Stößel. Vermeiden Verschütten Embryo Pulver auf der Trockeneis durch vorsichtig und langsam das Pulver in die 15-ml-Röhrchen Schaben, wie in Abbildung 1 gezeigt. Ändern Untersuchungshandschuhe, nachdem jede Probe hoch Pulver auf den Handschuh zu vermeiden, wird empfohlen, auf einen anderen Embryo Probe übertragen.
Die geeignete Menge an embryo Pulver zu dem modifizierten 50 mM NaOH Lyse-Lösung wird in 2B. Eine zu große Menge von Embryo-Pulver ist in 2A dargestellt gezeigt hinzugefügt werden und sollte vermieden werden. Ebenso in 2C, kann die Menge an Pulver Embryo für Downstream Verfahren unzureichend sein. Obwohl für jede Probe den Embryo-Pulver mit einem Gewicht möglich ist, ist es nicht praktisch, wenn hundert Embryonen über Embryo Sex in großem Maßstab Studie Screening.
Die Menge an DNA kann sichtbar werden verifiziert einem Zahnstocher für die klebrige g zu überprüfenooey artigen Substanz wie in 3 gezeigt, wenn sie, ob die entsprechende Menge an Pulver zweifelhaft ist, wurde in dem vorhergehenden Schritt zugegeben.
Hinzufügen der richtigen Menge an Neutralisationslösung ist wichtig, nach den Embryo Pulver Lyse. Abbildung 4 zeigt die pH-Änderung vor und nach der Neutralisation Lösung gegeben. Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass der pH-Wert leicht alkalisch ist (etwa 8,0) und damit ähnlich wie die meisten PCR-Reaktion Puffer.
Spezifität der Primer Oligo ist das wichtigste Element für die Richtigkeit der DNA-Geschlechtsbestimmung bei der PCR. Die Spezifität der Oligo-Primer können durch die NCBI BLASTN-Programm bestätigt werden. Eine einzelne Lage wird am 3'-nicht-kodierenden Region des Gens ZFX für jede Primersequenz (6A) für Frauen auf dem X-Chromosom detektiert werden. Eine ähnliche Situation wird nur an Y-Chromosom in der kodierenden Region von Gen SRY (6B detektiert
Fehlerrate, da keine Geschlechtsbestimmung könnte sehr niedrig (<1%), wie in Tabelle 1 gezeigt, wenn alle Schritte sorgfältig und korrekt ablaufen. Doch in einigen seltenen Fällen, eine Kreuzkontamination zwischen DNA Lysaten von zwei verschiedenen Proben ist möglich und kann durch PCR nachgewiesen werden, wie mit einem roten Stern im Gel (Abbildung 7) angegeben. Diese Art der Bandenmuster bei weiblichen als Kreuzkontamination mit einem männlichen Probe interpretiert werden.
Es ist unwahrscheinlich, dass das Auftreten einer sehr schwache untere Bande für PCR-Reagenzien zu dem Primer Wettbewerb zurückzuführen ist. In diesem Fall wird die kleinere Amplicon (400 bp) mit dem Gen wird SRY Zusammenhang mehr PCR-Produkt schneller als das höhere Band erzeugen, das dem ZFX Gen entspricht. In diesem Protokoll ist ein Nachteil die Bestimmung einer Kreuzkontamination von einem männlichen Probe mit einem weiblich. Da unser Hauptziel ist es nicht Quantifizierung der Kopienzahl für jede Zielgens, ein winzigesPulvermenge aus der weiblichen Probe wäre nicht einfach auf dem Gel sichtbar zu machen.
Die DNA-Geschlechtsbestimmung Protokoll präsentiert hier ist die kostengünstigste Methode Embryo Sex während der späten Schwangerschaft zu identifizieren und kann auf andere große Nutztiere wie Rinder, Schafe und Ziegen angewandt werden. Auch ähnliche DNA-Geschlechtsbestimmung Methode wurde bei Schweinen im Zusammenhang mit Sauen Stoffwechsellage 18 aufgebracht. Ein weiteres Forschungs Untersuchung DNA-Geschlechtsbestimmung mit Hilfe könnte die genomische Prägung Mechanismus während der pränatalen Programmierung der postnatalen Entwicklung in der Schweine 22 zu studieren angewendet werden. Eine breite Palette von Anwendungen in der Tierhaltung unter Verwendung von DNA-PCR-Geschlechtsbestimmung ist möglich, wie Pre-Geschlechtsselektion Zuchtprogramme und epigenetischen Auswirkungen von Ernährung und Infektionskrankheiten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Zusammenarbeit und die finanziellen Beiträge der folgenden Forschungsförderorganisation zu bestätigen: Alberta Vieh und Fleisch-Agentur GmbH, Schweinefleisch CRC, Alberta Pork, Hypor A Hendrix Genetics Company und NSERC CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
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