Abstract
सुअर में जन्म के पूर्व प्रोग्रामिंग में अनुसंधान दिखाया है कि विकासशील भ्रूण या भ्रूण के लिंग विकासात्मक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, एक भ्रूण के लिंग का निर्धारण करने की क्षमता विशेष रूप से जल्दी विकास के बारे में कई प्रयोगों में आवश्यक है। वर्तमान प्रोटोकॉल पीसीआर के साथ उपयोग के लिए सुअर जीनोमिक डीएनए के एक सस्ता, तेजी से और गैर विषैले तैयारी को दर्शाता है। दिवस 30 भ्रूण नम्रता से दिशा-निर्देशों के वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए संस्थागत पशु नीति और कल्याण समितियों द्वारा स्थापित के अनुसार एकत्र किया जाना चाहिए। इस पीसीआर आधारित sexing तकनीक के लिए पूरे भ्रूण की तैयारी के लिए बस एक ठीक पाउडर के लिए जमे हुए भ्रूण पीस एक पूर्व ठंडा मोर्टार और मूसल का उपयोग शामिल है। पीसीआर गुणवत्ता वाले डीएनए एक क्षारीय सेल अभिकर्मक में एक गर्म ऊष्मायन लगाने से भ्रूण पाउडर की एक छोटी राशि से जारी है। अगले, डीएनए समाधान निराकरण बफर के साथ मिलाया जाता है और पीसीआर के लिए सीधे इस्तेमाल किया जाता है। दो प्राइमर जोड़े detec को उत्पन्न कर रहे हैंटी विशिष्ट सेक्स वाई गुणसूत्र (sry) और उच्च सटीकता और विशिष्टता के साथ एक्स गुणसूत्र के ZFX क्षेत्र के क्षेत्र का निर्धारण। एक ही प्रोटोकॉल अन्य लम्बी भ्रूण (14 दिन के लिए दिन 10) दिवस से पहले करने के लिए लागू किया जा सकता है 30 के अलावा, इस प्रोटोकॉल जब भ्रूण की एक बड़ी संख्या स्क्रीनिंग, यह स्वचालन और उच्च के लिए संभव बनाने 96 में आंसू आ गए प्लेटों के साथ किया जा सकता है throughput सेक्स टाइपिंग।
Introduction
घरेलू सुअर विकास, आनुवंशिकी और दोनों मानव और पशुओं के क्षेत्र में पोषण में एक मौलिक अनुसंधान विषय बन गया है। मानव जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए मॉडल के रूप में सूअरों की क्षमता उनके शारीरिक समानता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। पशुधन में लिंग अनुपात में हेरफेर के चयन और आनुवंशिक सुधार कार्यक्रमों 1 के प्रभाव में वृद्धि कर सकते हैं। व्यक्तिगत भ्रूण sexing सहित, लेकिन जल्दी भ्रूण के विकास के दौरान 2 जीनोटाइप, एपिजेनेटिक्स और यौन द्विरूपता की एक्स निष्क्रियता तक ही सीमित नहीं कई प्रायोगिक जांच में इस्तेमाल एक बुनियादी उपकरण है।
चूहों में अध्ययनों से पता चलता है कि मातृ आहार और अन्य कारकों लिंग असंतुलन 3 में परिणाम हो सकता है। सूअरों में लिंग अनुपात असंतुलन के कारणों पैतृक नस्ल 4, गर्भाशय क्षमता 5, और बोना की चयापचय हालत 6 में शामिल हैं। चूंकि भ्रूण और litters में मनाया मतभेद एसई से प्रभावित किया जा सकता हैxual द्विरूपता, शोधकर्ताओं ने अपने शोध के बारे में निष्कर्ष ड्राइंग से पहले भ्रूण सेक्स और लिंग अनुपात के बारे में पता होना चाहिए। विकास के दिन 30 पर सुअर भ्रूण sexing के लिए कुशल उपकरण और प्रोटोकॉल के विकास यहाँ चर्चा की जाएगी।
सेक्स टाइपिंग के विभिन्न तरीकों मॉडल जीवों और पशुओं में आनुवंशिक अध्ययन के लिए विकसित किया गया है। विशेष रूप से पशुओं में, पुरुष और महिला जल्दी भ्रूण की पहचान करने के लिए एक बहुत ही आम बात प्रजनन कार्यक्रम के लिए आनुवंशिक चयन बढ़ाने की है। प्रारंभिक Giemsa 7 या तीव्र प्रतिदीप्ति 8,9 तकनीक का उपयोग कर सुअर में karyotyping भ्रूण सेक्स टाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन तरीकों समय लगता है और जल्दी और सही भ्रूण की बड़ी संख्या को स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
सबसे प्रभावी सेक्स टाइपिंग विधि डीएनए एक गर्मी स्थिर डीएनए पोलीमरेज़ और प्राइमरों की एक जोड़ी का उपयोग प्रवर्धन है। पीसीआर विधि द्वारा डीएनए sexing, और अधिक विशिष्ट तेजी से और संवेदनशील है ओnly सेलुलर सामग्री की एक मिनट की राशि की आवश्यकता होती है। पहले पीसीआर आधारित भ्रूण sexing बाद में चूहों 11, 12 मवेशी, भैंस और भेड़ 13 14 पूर्व आरोपण भ्रूण में मनुष्यों 10 पर प्रदर्शन किया गया था, और। सुअर में, जल्द से जल्द डीएनए सेक्स टाइपिंग विधि वाई गुणसूत्र डीएनए विशिष्ट प्राइमरों 15 की एक जोड़ी के माध्यम से पूर्व आरोपण भ्रूण के लिए स्थापित किया गया था। हालांकि, लिंग निर्धारण के लिए सबसे आम पीसीआर प्राइमरों पुरुष विशिष्ट जीन sry 16 और एक जस्ता उंगली दोनों एक्स और वाई क्रोमोसोम 17 पर स्थित जीन की गैर सेक्स विशेषक क्षेत्र के वाई गुणसूत्र से चयन किया गया था। बाद में, इन प्राइमरों प्राइमरों के बेहतर विशिष्टता के साथ इस अध्ययन में यह दिवस 30 भ्रूण के लिंग का निर्धारण करने के लिए एक जस्ता उंगली जीन की केवल एक्स गुणसूत्र का पता लगाने के लिए लागू किया गया है।
सुअर का पूर्व आरोपण भ्रूण से जीनोमिक डीएनए proteinas साथ बफर करने के लिए एक अक्षुण्ण ब्लास्टोसिस्ट उजागर करके निकाला जा सकता हैई-कश्मीर 16 या व्यक्ति जल्दी दरार से कुछ कोशिकाओं के एक बायोप्सी लेने के द्वारा भ्रूण 15 और उन्हें प्रत्यक्ष पीसीआर के लिए इस्तेमाल करते हैं। हालांकि, सुअर का खून, बाल, ऊतकों या आकार में कुछ सेंटीमीटर पर एक बड़े conceptus से डीएनए की रिहाई के लिए प्रभावी ढंग से proteinase कश्मीर विधि का उपयोग नहीं किया जाता है। इन सामग्रियों के लिए डीएनए निष्कर्षण तरीकों या तो समय लेने वाली फिनोल / क्लोरोफॉर्म प्रोटोकॉल 6 या महंगा स्तंभ आधारित किट 18 का उपयोग कर स्थापित किया गया है। आदेश में संभावित विषाक्त रसायनों के उपयोग से बचने के लिए, वहाँ सस्ता, आसान और फिनोल मुक्त डीएनए निष्कर्षण तरीकों को विकसित करने के लिए एक प्रवृत्ति है। माउस 19 और zebrafish 20 ऊतकों से पीसीआर गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल के इस प्रकार हॉट सोडियम हाइड्रोक्साइड और Tris (हॉटशॉट) का उपयोग कर स्थापित किया गया है। इस अध्ययन पीसीआर सेक्स के लिए संशोधित हॉटशॉट और बदल दिया द्वैध प्राइमर जोड़े सीधे 30 सुअर का भ्रूण दिन भर की सेल lysates से टाइपिंग के साथ डीएनए प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता हैउच्च सटिकता।
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Protocol
पशु की देखभाल के दिशा-निर्देशों पर कनाडा परिषद के साथ और संकाय पशु नीति और कल्याण समिति के अनुमोदन के अनुसार - अलबर्टा विश्वविद्यालय के पशुधन, गर्भवती बोता लगभग डे गर्भावस्था और भ्रूण के 30 एकत्र किए गए थे पर प्रशिक्षित कर्मचारी द्वारा euthanized थे। प्रक्रिया के दौरान सभी समय पर परीक्षा दस्ताने का प्रयोग करें।
1. नमूना संग्रह और नमूना संग्रहण
- बंदी बोल्ट exsanguination द्वारा बाद का उपयोग बोना euthanize। परीक्षा दस्ताने पहनें प्रत्येक euthanized बोना से प्रजनन इलाकों और भ्रूण इकट्ठा करने के लिए।
नोट: नमूने और हस्तांतरण भ्रूण की रैपिड संग्रह करने के लिए सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन ऐसे माइक्रोएरे और qPCR के रूप में अन्य कार्यों के लिए आणविक उच्च गुणवत्ता के ऊतकों में परिणाम होगा। - गर्भाशय काटना और धीरे अंतर्निहित गर्भाशय की दीवार 21 से उनकी extraembryonic अपरा झिल्ली के भीतर सभी भ्रूण अलग। सुनिश्चित करें कि कोई मातृ ऊतक संदूषण है बनाओ।
- फिर सेहड्डी की लंबाई और ठंड करने से पहले सभी व्यवहार्य भ्रूण का वजन।
- प्रत्येक व्यक्ति भ्रूण लीजिए और तुरंत तस्वीर तरल नाइट्रोजन के साथ ठंड से पहले एक एल्यूमीनियम पन्नी में लपेट।
- सीधे एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए तरल नाइट्रोजन से जमे हुए भ्रूण स्थानांतरण।
2. पीस भ्रूण
- नमूनों की संख्या के लिए आवश्यक नमूना आईडी के साथ सभी नमूना ट्यूब (15 मिलीलीटर) लेबल विश्लेषण किया जा सके।
- आधा भरा करने के लिए सूखी बर्फ के साथ थर्मल कंटेनर भरें और सूखी बर्फ में पूर्व लेबल नमूना ट्यूब डालें।
- -80 से पूर्व ठंडा मोर्टार और मूसल स्थानांतरित सेल्सियस फ्रीजर बर्फ कंटेनर सुखाने के लिए के लिए शीर्ष पर परीक्षा दस्ताने की एक और जोड़ी के साथ सर्दियों के दस्ताने पहनें।
- जमे हुए भ्रूण सूखी बर्फ पर मोर्टार के अंदर रखें।
- भ्रूण को कवर किया और एक ठीक पाउडर में मूसल के साथ इसे पीसने के लिए पर्याप्त मात्रा में तरल नाइट्रोजन डालो।
- एक माइकर के साथ एक पूर्व लेबल नमूना ट्यूब भ्रूण पाउडर स्थानांतरणospatula (चित्रा 1) और एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ट्यूब जगह।
- प्रत्येक भ्रूण के लिए एक साफ पूर्व ठंडा मोर्टार और मूसल का प्रयोग करें और प्रत्येक भ्रूण पीस नमूनों के बीच पार संक्रमण से बचने के लिए के बाद परीक्षा दस्ताने बदल जाते हैं।
3. जीनोमिक डीएनए तैयारी संशोधित का उपयोग सोडियम हीड्राकसीड विधि
- लेबल सभी microcentrifuge ट्यूब (1.5 एमएल) के नमूनों की संख्या के लिए आवश्यक विश्लेषण किया जा सके।
- भ्रूण पाउडर युक्त नमूना ट्यूब से शुरू करने से पहले सूखी बर्फ के साथ एक कंटेनर पर स्थानांतरण -80 सेल्सियस फ्रीजर।
- प्रत्येक पूर्व लेबल microcentrifuge ट्यूब में 50 मिमी NaOH (सोडियम हाइड्रॉक्साइड) के 180 μl पिपेट।
- एक मशीन और 95 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्मी चालू करें।
- एक पूर्व लेबल microcentrifuge 50 मिमी NaOH समाधान युक्त ट्यूब में नमूना ट्यूब से भ्रूण पाउडर की सही मात्रा (5-10 मिलीग्राम के बारे में) (चित्रा 2) के हस्तांतरण के लिए एक दंर्तखोदनी का प्रयोग करें।
- यू खींचोपी ही दंर्तखोदनी धीरे धीरे एक चिपचिपा, भावुक, सफेद पारदर्शी पदार्थ की तरह (चित्रा 3) के रूप में डीएनए lysate कल्पना करने के लिए।
- microcentrifuge ट्यूबों पांच मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म इनक्यूबेटर करने के लिए डीएनए lysate साथ स्थानांतरण। इसके तत्काल बाद बर्फ से भरा एक स्टायरोफोम बॉक्स करने के लिए ट्यूब हस्तांतरण।
- सीधे microcentrifuge ट्यूब में 1 एम Tris एचसीएल के 20 μl जोड़ें और धीरे ट्यूब दोहन से यह मिश्रण। यह सुनिश्चित करने के लिए पीएच लगभग 8.0 (चित्रा 4) centrifugation करने से पहले एक पीएच पेपर का प्रयोग करें।
नोट: जब नमूना तैयारियों की एक बड़ी संख्या के साथ व्यवहार, यह स्वीकार्य है बेतरतीब ढंग से पीएच जांच करने के लिए कुछ नमूने लेने के लिए। - डीएनए lysate के साथ ट्यूब कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए एक microcentrifuge में 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र undissolved ऊतक मलबे को हटाने के लिए।
- स्थानांतरण एक नया ट्यूब में शीर्ष स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला के 150 μl या 96 अच्छी तरह प्लेटें।
नोट: स्पष्ट डीएनए lysate पीसी में एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने के लिए तैयार हैआर प्रतिक्रिया और यह दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है, या यह एक साल के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
4. डिजाइन सेक्स विशेष पीसीआर प्राइमर
- एन सी बी आई वेबसाइट http://www.ncbi.nlm.nih.gov से सुअर लिंग का पता लगाने क्षेत्र वाई (sry) के लिए परिग्रहण संख्या (NM_214452.3) और और जस्ता उंगली प्रोटीन एक्स-लिंक्ड (ZFX) जीन (XM_005673501.1) प्राप्त /।
- कॉपी और एक ऑनलाइन प्राइमर डिजाइन उपकरण के लिए इन एन सी बी आई परिग्रहण संख्या पेस्ट करें।
नोट: लंबाई, टीएम और जीसी% के रूप में अच्छी तरह से पीसीआर उत्पाद का आकार (बीपी) कंप्यूटर स्क्रीन पर उत्पन्न हो जाएगा (चित्रा 5) सहित सबसे अच्छा प्राइमरों जानकारी। - इन न्यूक्लियोटाइड ब्लास्ट कार्यक्रम (Blastn) का उपयोग वर्तमान सुअर का जीनोमिक डेटाबेस 104 के खिलाफ सुनिश्चित करने के लिए इन दृश्यों केवल एक्स और sry और ZFX क्रमशः (चित्रा 6) के लिए वाई गुणसूत्र पर स्थित हैं प्राइमरों की विशिष्टता मान्य।
5. जीनोमिक डीएनए सीधे डीएनए lysates से पीसीआर
- उपयोगएक 15 μl पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए एक टेम्पलेट के रूप में डीएनए lysate का केवल 1 μl।
नोट: के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें पीसीआर एक उच्च throughput स्क्रीनिंग विधि समान तरीके से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने में किया जा सकता है। - क्या सिर्फ पहले पीसीआर के लिए निम्नलिखित: एक पीसीआर ट्यूब कोई टेम्पलेट नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के लिए दो अतिरिक्त ट्यूबों के लिए व्यावसायिक रूप से प्राप्त जाना जाता सेक्स सुअर का जीनोमिक डीएनए के 1 μl (0.5 एनजी) को जोड़कर तैयार करते हैं। बाद में, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में पिछले सफल sexing विश्लेषण से एक नमूना शामिल हैं और लिंग निर्धारण के लिए नई पीसीआर प्रतिक्रिया के साथ मिलकर चलाते हैं।
- किसी भी HotStart तैयार मिश्रण पीसीआर एंजाइम का प्रयोग करें और उनका कहना है प्राइमरों द्वारा एक मास्टर मिश्रण तैयार करने और पीसीआर प्रतिक्रियाओं की कुल संख्या के आधार पर मुफ्त पानी nuclease। पीसीआर मास्टर मिश्रण के 14 μl के साथ एक पूर्व मौजूदा पीसीआर ट्यूब में डीएनए lysate के 1 μl जोड़ें। प्राइमरों जोड़े ऐसी है कि दो सेक्स-विशिष्ट जीन से प्राइमरों के अंतिम एकाग्रता के 15 μl पीसीआर आर कुल में 0.3 माइक्रोन हैeaction।
- एक थर्मल cycler में निम्नलिखित पीसीआर कार्यक्रम निर्धारित करें: 3 मिनट, 20 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस 35 चक्रों एक पिघलने कदम 98 डिग्री सेल्सियस, 65 डिग्री सेल्सियस पर एक 15 सेकंड annealing कदम से पीछा किया, एक 15 सेकंड बढ़ाव कदम के द्वारा पीछा के साथ प्रत्येक 72 डिग्री सेल्सियस पर। एक अंतिम चरण में, 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए प्रतिक्रियाओं सेते हैं और जेल वैद्युतकणसंचलन सत्यापन के लिए पीसीआर ट्यूब को हटाने के लिए जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते लिंग का निर्धारण करने के लिए जारी है।
नोट: पीसीआर की स्थिति और अनुकूलन पीसीआर किट सामग्री तालिका में उल्लेख के मैनुअल के अनुसार कर रहे हैं। - गैर विषैले ग्रीन फ्लोरोसेंट SYBR डीएनए जेल दाग की उचित मात्रा में जब एक 2% TBE agarose जेल तैयारी जोड़ें।
नोट: ethidium ब्रोमाइड ग्रीन फ्लोरोसेंट दाग के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है अगर यह उपलब्ध नहीं है। - लोड हो रहा है डाई (10x) पीसीआर ट्यूब में 1.5 μl जोड़ें और पीसीआर प्रतिक्रिया बफर ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
- लोड 10 अच्छी तरह से और अनुसंधान में नमूना की μlसंयुक्त राष्ट्र उचित वोल्टेज सेटिंग्स के साथ agarose जेल (100 वी पर छोटे जेल तंत्र, 150 वी पर 96 अच्छी तरह से जेल तंत्र डाई बैंड जब तक जेल के माध्यम से आधे रास्ते रन)।
- ध्यान से देखें और एक लेजर स्कैनर का उपयोग कर फ्लोरोसेंट रोशनी सेटिंग के तहत बैंड तीव्रता को समायोजित करने और जेल की एक छवि पर कब्जा। नोट: आम जेल इमेजर ethidium ब्रोमाइड जेल के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
- एक महिला के रूप में एक बैंड और एक पुरुष के रूप में दो बैंड (चित्रा 7) के साथ भ्रूण की पहचान के द्वारा सुअर का भ्रूण के लिंग का निर्धारण।
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Representative Results
पीसीआर द्वारा 345 डीएनए lysates स्क्रीनिंग से लिंग निर्धारण का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 7 में दिखाया गया है और तालिका 1 में संक्षेप।
चित्रा 7 में देखा जा सकता है, 65 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमरों annealing तापमान इस पीसीआर प्रोटोकॉल समान तीव्रता और predicated amplicon आकार सृजन (चित्रा 5) विभिन्न नमूनों के बीच में इष्टतम स्थिति है।
Sry (400 बीपी) और ZFX (506 बीपी) के दो उत्पादों प्रवर्धित जेल के चित्र (चित्रा 7) में दिखाया जाता है। नर भ्रूण कम (506 बीपी) बैंड के ऊपरी (400 बीपी) की सही आकार और के साथ दो डीएनए टुकड़े दिखाया। इन दो बैंड की तीव्रता सबसे पुरुष व्यक्तियों में बराबर होना दिखाया गया था। सभी महिला भ्रूण में ही स्थित ZFX जीन को इसी एक भी डीएनए टुकड़ा दिखायाएक्स गुणसूत्र।
संशोधित 50 मिमी NaOH से प्राप्त डीएनए lysates एक उच्च सफलता दर और सटीकता के साथ पीसीआर के लिए सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है। डीएनए lysates 345 भ्रूण स्क्रीनिंग के बाद किसी भी पीसीआर प्रतिक्रिया निषेध नहीं दिखा था। केवल तीन व्यक्तियों sexed नहीं थे और महिला भ्रूण का प्रतिशत पुरुषों (1 टेबल) की तुलना में थोड़ा अधिक था।
चित्रा 1:। भ्रूण पाउडर हस्तांतरण एक 15 मिलीलीटर ट्यूब भ्रूण पाउडर स्थानांतरण।
चित्रा 2: संग्रह और एक दंर्तखोदनी के साथ भ्रूण पाउडर स्थानांतरण (ए) दंर्तखोदनी के लिए भ्रूण पाउडर पालन करने के लिए एक अत्यधिक राशि।। (बी) की सही राशिभ्रूण पाउडर दन्तखुदनी का पालन करने क्षारीय सेल अभिकर्मक समाधान करने के लिए स्थानांतरित किया जाना है। (सी) भ्रूण पाउडर की अपर्याप्त संख्या दन्तखुदनी का पालन कर।
चित्रा 3:। डीएनए दृश्य तकनीक धीरे-धीरे दंर्तखोदनी तक खींच, भ्रूण पाउडर जोड़ने के बाद, तो यह निर्धारित करने भ्रूण डीएनए एक चिपचिपा चिपचिपा सफेद पारदर्शी पदार्थ की तरह के रूप में भंग कर दिया है।
चित्रा 4:। पीएच पुष्टि (ए) सोडियम हाइड्रोक्साइड (क्षारीय सेल अभिकर्मक) समाधान के पीएच 12.0 है। (बी) lysis बफर के अलावा निराकरण बफर के बाद, पीएच पेपर का रंग संकेत हरे रंग की है और पीएच 8.0 के आसपास होना चाहिए।
चित्रा 5:।। लिंग विशिष्ट प्राइमर सूचना अनुक्रम नाम, दृश्यों और amplicon लंबाई प्राइमर डिजाइन उपकरण से प्राप्त यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: क्रोमोजोम एक्स और आगे की वाई (ए) के स्थान पर सुअर सेक्स विशिष्ट प्राइमरों की मैपिंग और उलट प्राइमरों ZFX जीन पर निर्दिष्ट। (बी) के आगे के स्थान और sry जीन पर निर्दिष्ट प्राइमरों उलट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7:। दिवस 30 भ्रूण से सुअर सेक्स-विशिष्ट जीन की पीसीआर प्रवर्धन 2% TBE agarose जाना जाता सकारात्मक नियंत्रण के साथ SYBR डीएनए जेल दाग के साथ दाग जेल पुरुष और महिला प्रतीकों के साथ संकेत कर रहे हैं। दो बैंड पुरुषों और महिलाओं के रूप में एक बैंड के रूप में संकेत दिया। लाल सितारा एक बहुत ही बेहोश कम बैंड (400 बीपी) ऊपरी बैंड (506 बीपी) पीसीआर उत्पाद sry Y विशिष्ट प्राइमरों की वजह से की तुलना की उपस्थिति के साथ अच्छी तरह से संभव नमूना संदूषण का संकेत दिया। लाल तीर कोई टेम्पलेट पीसीआर नकारात्मक नियंत्रण इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| पीसीआर sexing | भ्रूण गणना | |
| ♀ | 185 | 53.60% |
| ♂ | 157 | 45.50% |
| अनजान | 3 | 0.90% |
| कुल | 345 | 100% |
तालिका 1: 345 दिवस 30 भ्रूण के बीच महिला, पीसीआर sexing के बाद पुरुष और अज्ञात का प्रतिशत।
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Discussion
सुअर का भ्रूण डीएनए सेक्स टाइपिंग से संबंधित मौजूदा प्रोटोकॉल के अधिकांश प्रारंभिक चरण पूर्व आरोपण चरण 15,16 के लिए ही उपयुक्त हैं। हम सफलतापूर्वक देर से गर्भ के दौरान सुअर का भ्रूण स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। पिछले अध्ययनों 6,18 से भ्रूण के समान विकास के चरणों के साथ अध्ययन के आधार पर, वर्तमान प्रोटोकॉल सुरक्षित और कम लागत माना जाता है।
इस प्रोटोकॉल भी एक 96 अच्छी तरह से थाली में डीएनए lysates के हस्तांतरण से पीसीआर का उपयोग सेक्स टाइपिंग के लिए नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए उपयुक्त है। थाली प्रारूप पीसीआर प्रतिक्रिया एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए हस्तांतरण डीएनए lysate के 1 μl की अनुमति देकर उच्च throughput प्रदर्शन की अनुमति देता है।
हालांकि, कई प्रक्रिया में शामिल कदम सावधानी से किया जाना चाहिए। आदेश में और अधिक कुशलता से संशोधित 50 मिमी NaOH सेल विधि प्रदर्शन करने के लिए व्यक्तिगत रूप से जमे हुए भ्रूण ठीक पाउडर में आधारित होना करने के लिए किया गया हैएक पूर्व ठंडा (-80 डिग्री सेल्सियस) मोर्टार और मूसल का उपयोग कर। सूखी बर्फ पर भ्रूण पाउडर spilling, और धीरे धीरे, 15 मिलीलीटर ट्यूब में पाउडर स्क्रैप के रूप में चित्र 1 में दिखाया द्वारा बचें। परीक्षा दस्ताने बदलने के बाद प्रत्येक नमूना अत्यधिक दस्ताना एक और नमूना भ्रूण को स्थानांतरित करने पर पाउडर से बचने के लिए सिफारिश की है।
भ्रूण पाउडर की उचित मात्रा में संशोधित 50 मिमी NaOH सेल समाधान के लिए जोड़ा जा करने के लिए चित्रा 2B में दिखाया गया है। भ्रूण पाउडर का एक अत्यधिक राशि चित्रा 2A में प्रस्तुत किया है और बचा जाना चाहिए। इसी तरह, चित्रा -2 में, भ्रूण पाउडर की मात्रा को नीचे की ओर प्रक्रियाओं के लिए अपर्याप्त हो सकता है। हालांकि प्रत्येक नमूने के लिए भ्रूण पाउडर वजन संभव है, जब एक बड़े पैमाने पर एक सौ से अधिक भ्रूण को शामिल अध्ययन में भ्रूण सेक्स स्क्रीनिंग व्यावहारिक नहीं है।
डीएनए की मात्रा दिख चिपचिपा जी के लिए जाँच करने के लिए एक दन्तखुदनी का उपयोग कर सत्यापित किया जा सकता हैooey की तरह पदार्थ के रूप में, 3 चित्र में दिखाया है, तो यह संदेहास्पद है कि पाउडर की उचित मात्रा में पिछले चरण में जोड़ा गया है।
निराकरण समाधान की सही मात्रा में जोड़ने से भ्रूण पाउडर lysing के बाद महत्वपूर्ण है। चित्रा 4 के बाद और निराकरण समाधान जोड़ने से पहले पीएच परिवर्तन को दर्शाता है। यह कदम सुनिश्चित करें कि पीएच थोड़ा क्षारीय है (8.0 के आसपास) और इसलिए सबसे पीसीआर प्रतिक्रिया buffers के समान बनाने के लिए महत्वपूर्ण है।
oligo प्राइमरों की विशिष्टता पीसीआर के दौरान डीएनए sexing की सटीकता के लिए सबसे महत्वपूर्ण तत्व है। oligo प्राइमरों की विशिष्टता एन सी बी आई Blastn कार्यक्रम के माध्यम से इस बात की पुष्टि की जा सकती है। एक ही स्थान महिलाओं के लिए प्रत्येक प्राइमर अनुक्रम (चित्रा 6A) के लिए ZFX जीन के 3 'गैर-कोडिंग क्षेत्र में एक्स गुणसूत्र पर पता लगाया जाएगा। इसी तरह की स्थिति (केवल sry जीन की कोडिंग क्षेत्र में वाई गुणसूत्र पर पता चला है चित्रा 6B
कोई सेक्स पहचान करने के लिए त्रुटि दर की वजह से बहुत कम (<1%) के रूप में हो सकता है, 1 टेबल में दिखाया गया है जब सभी कदम सावधानी से और सही ढंग से आगे बढ़ना। हालांकि, कुछ दुर्लभ मामले में दो अलग-अलग नमूनों की डीएनए lysates के बीच पार संक्रमण संभव है और जेल के रूप में एक लाल सितारा (चित्रा 7) के साथ संकेत दिया पीसीआर से पता लगाया जा सकता है। महिला में बैंडिंग पैटर्न के इस प्रकार के एक पुरुष नमूने के साथ पार संक्रमण के रूप में व्याख्या की जा सकती है।
यह संभावना नहीं है कि एक बहुत ही बेहोश कम बैंड की उपस्थिति पीसीआर अभिकर्मकों के लिए प्राइमर प्रतिस्पर्धा की वजह से है। इस मामले में छोटे amplicon (400 बीपी) sry जीन से संबंधित अधिक पीसीआर उत्पाद उच्च बैंड ZFX जीन को इसी से अधिक तेजी से उत्पन्न होगा। इस प्रोटोकॉल में, एक नुकसान यह एक महिला के साथ एक पुरुष नमूना के पार संक्रमण का दृढ़ संकल्प है। क्योंकि हमारा मुख्य लक्ष्य है, एक छोटे से प्रत्येक लक्ष्य के लिए जीन प्रतिलिपि संख्या की मात्रा का ठहराव नहीं हैमहिला नमूना से पाउडर की मात्रा को जेल पर कल्पना करने के लिए आसान नहीं होगा।
डीएनए sexing यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सबसे अधिक लागत प्रभावी देर से गर्भ के दौरान भ्रूण सेक्स की पहचान करने की विधि है और ऐसे मवेशी, बकरी और भेड़ के रूप में दूसरों बड़े पशुओं जानवरों के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, इसी तरह के डीएनए sexing विधि बोता चयापचय हालत से संबंधित 18 सूअरों में लागू किया गया है। डीएनए sexing का उपयोग करते हुए एक अन्य शोध जांच सुअर 22 में प्रसव के बाद विकास के जन्म के पूर्व प्रोग्रामिंग के दौरान जीनोमिक चिन्ह तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। डीएनए पीसीआर sexing का उपयोग कर पशुधन में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के ऐसे पूर्व लिंग चयन प्रजनन कार्यक्रम, और पोषण और संक्रामक रोगों के प्रभाव के रूप में epigenetic संभव है।
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Disclosures
लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।
Acknowledgments
लेखकों सहयोग और निम्नलिखित अनुसंधान अनुदान एजेंसी की वित्तीय योगदान को स्वीकार करना होगा: अलबर्टा पशुधन और मांस एजेंसी लिमिटेड, पोर्क सीआरसी, अलबर्टा पोर्क, Hypor एक हेंड्रिक्स जेनेटिक्स कंपनी और NSERC CRSNG।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
References
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