Abstract
A investigação sobre a programação pré-natal no porco mostrou que o sexo do embrião ou feto em desenvolvimento pode influenciar o resultado do desenvolvimento. Portanto, a capacidade de determinar o sexo de um embrião é necessário em muitas experiências particularmente em relação ao desenvolvimento precoce. O presente protocolo demonstra uma preparação de baixo custo, rápida e não-tóxico de ADN genómico de porco para uso com a PCR. Dia 30 embriões devem ser humanamente recolhido de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Política de animal Institucional e Comissões de bem-estar para o presente protocolo. A preparação de todo o embrião para esta técnica sexagem baseado na PCR envolve simplesmente moer o embrião congelado até um pó fino usando um almofariz pré-arrefecido e um pilão. ADN por PCR qualidade é libertado a partir de uma pequena quantidade de pó de embriões através da aplicação de uma incubação a quente em um reagente de lise alcalina. Em seguida, a solução de ADN é misturado com tampão de neutralização e utilizado directamente para PCR. Dois pares de iniciadores são gerados para detecdeterminado sexo t determinação região do cromossoma Y (SRY) e região ZFX do cromossoma X com alta precisão e especificidade. O mesmo protocolo pode ser aplicado a outros embriões alongados (dia 10 ao dia 14) anteriores ao Dia 30. Além disso, este protocolo pode ser realizada com placas 96-brotaram quando o rastreio de um grande número de embriões, tornando viável para automatização e de alta digitação sexo rendimento.
Introduction
O porco doméstico tornou-se um tema de pesquisa fundamental no desenvolvimento, genética e nutrição em ambos os sectores humanas e animais. O potencial de porcos como modelo para a investigação biomédica humana pode ser atribuído às suas semelhanças fisiológicas. Na pecuária, a manipulação da proporção entre os sexos pode aumentar a eficácia dos programas de selecção e melhoramento genético 1. Sexagem de embriões individuais é uma ferramenta fundamental usada em muitas investigações experimentais, incluindo mas não limitado a genótipo, epigenética e X inactivação de dimorfismo sexual durante o desenvolvimento embrionário precoce 2.
Estudos em camundongos sugerem que a dieta materna e outros fatores podem resultar em desequilíbrio entre os sexos 3. Em suínos, as causas do sexo rácio desequilíbrio incluem raça paterna 4, capacidade uterina 5, e estado metabólico da porca 6. Uma vez que as diferenças observadas em embriões e ninhadas pode ser influenciada por SExual dimorfismo, os pesquisadores devem estar cientes do sexo do embrião e relações sexuais antes de tirar conclusões sobre a sua pesquisa. O desenvolvimento de ferramentas e protocolos eficientes para a sexagem de embriões de suínos no dia 30 do desenvolvimento será discutido aqui.
Vários métodos de tipagem sexo têm sido desenvolvidos para estudos genéticos em organismos modelo e gado. Particularmente na pecuária, a identificação de embriões masculinos e femininos é uma prática muito comum para melhorar a seleção genética para programas de melhoramento. Embriões precoces cariótipo no porco usando Giemsa 7 ou as intensa fluorescência 8,9 técnicas têm sido utilizadas para tipagem sexo. No entanto, estes métodos são demorados e não é adequado para o rastreio de grandes números de embriões com rapidez e precisão.
O método sexo tipagem mais eficaz é a amplificação de DNA usando uma polimerase de ADN estável ao calor e um par de iniciadores. sexagem de DNA pelo método de PCR é mais específico, rápido e sensível, oomente requerendo uma pequena quantidade de materiais celulares. O primeiro sexagem de embriões com base em PCR foi realizado em seres humanos 10, e mais tarde nos ratos 11, 12 bovinos, búfalos, ovelhas 13 14 embriões pré-implantação. No porco, o método de tipagem de ADN mais rapidamente do sexo foi estabelecida para os embriões pré-implantação através de um único par de Y-chromosome iniciadores de ADN específica 15. No entanto, os iniciadores de PCR mais comuns para a determinação do sexo foram selecionados a partir do cromossomo Y do gene SRY específica do sexo masculino 16 e os não-sexo região discriminativo de um gene zinc-finger localizado na X e Y cromossomo 17. Subsequentemente, estes iniciadores foram utilizados para determinar o sexo dos embriões do dia 30 no estudo com uma melhor especificidade dos primers para detectar apenas o cromossoma X de um gene de dedo de zinco.
O ADN genómico a partir de embriões pré-implantação de suíno pode ser extraído por exposição de um blastocisto intacto para tamponar com proteinase K 16 ou por tomar uma biópsia de algumas células da clivagem antecipada individual embriões 15 e usá-los para PCR direta. No entanto, a libertação de ADN a partir de sangue de porcino, cabelo, tecidos ou um grande conceptus ao longo de alguns centímetros de tamanho não é efectivamente feito usando o método de proteinase K. Métodos de extração de DNA para estes materiais foram estabelecidas usando ou demoradas protocolos de fenol / clorofórmio 6 ou kits baseados coluna caro 18. A fim de evitar o uso de produtos químicos potencialmente tóxicos, há uma tendência para o desenvolvimento de métodos de extracção de ADN de baixo custo, simples e livre de fenol. Este tipo de protocolo para o isolamento de ADN genómico por PCR qualidade do rato 19 e 20 de peixe-zebra tecidos foi estabelecida usando hidróxido de sódio quente e tris (HOTSHOT). Este estudo fornece um protocolo para obter DNA com pares de primers duplex modificados Hotshot e redesenhado para o sexo PCR digitando diretamente a partir de lisados celulares de dia 30 embriões de suínos comalta precisão.
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Protocol
De acordo com a Canadian Council on Animal Care orientações e com a aprovação da Política animal Faculdade e Conselho de Acção Social - Pecuária da Universidade de Alberta, porcas prenhes foram sacrificados por funcionários treinados aproximadamente no dia 30 de gestação e os embriões foram coletados. Use luvas de exame em todos os momentos durante os procedimentos.
1. Colheita e armazenamento Amostra
- Eutanásia porca usando dardo cativo seguido de sangria. Usar luvas de exame para recolher os aparelhos reprodutivos e embriões de cada porca sacrificados.
Nota: cobrança rápida de amostras e embriões de transferência para secar gelo ou azoto líquido resultará em tecidos de maior qualidade para outras obras molecular, tais como microarray e qPCR. - Dissecar o útero e delicadamente separar todos os embriões dentro de suas membranas da placenta extraembryonic da parede uterina subjacente 21. Certifique-se de que não há contaminação dos tecidos maternal.
- Récomprimento do cabo e o peso de todos os embriões viáveis antes da congelação.
- Recolha cada um dos embriões e imediatamente envolvê-lo em uma folha de alumínio antes pressão congelamento com nitrogênio líquido.
- Transferir os embriões congelados de nitrogênio líquido diretamente para a -80 ° C congelador.
2. Os embriões Moagem
- Rotular todos os tubos de amostra (15 ml), com a identificação da amostra necessária para o número de amostras a serem analisadas.
- Encha o recipiente térmico com gelo seco para metade e inserir o tubo de amostra pré-rotulado no gelo seco.
- Usar luvas de inverno com um outro par de luvas de exame em cima para transferir os almofarizes e pilões pré-refrigerados de -80 ° C freezer para secar recipiente de gelo.
- Coloque o embrião congelado dentro da argamassa sobre o gelo seco.
- Pour azoto líquido adequado para cobrir o embrião e moê-lo com o pilão em um pó fino.
- Transferir o pó embrião para um tubo de amostra pré-marcado com um microspatula (Figura 1) e colocar o tubo num congelador de -80 ° C.
- Use uma argamassa pré-refrigerado limpa e pilão para cada embrião e alterar as luvas de exame após a moagem cada embrião para evitar a contaminação cruzada entre as amostras.
3. ADN genómico de preparação utilizando modificação de sódio Hidróxido Método
- Etiqueta de todos os tubos de microcentrifugação (1,5 ml) necessárias para o número de amostras a serem analisadas.
- Transferir os tubos de amostra contendo embrião em pó a partir do congelador -80 ° C para um recipiente com gelo seco antes de se iniciar.
- Pipetar 180 l de NaOH 50 mM (hidróxido de sódio) para cada tubo de microcentrífuga pré-rotulados.
- Ligar uma incubadora e de pré-aquecimento a 95 ° C.
- Usar um palito para transferir a quantidade correcta de pó de embrião (cerca de 5-10 mg) (Figura 2) a partir do tubo de amostra para um tubo de microcentrífuga de pré-marcado contendo a solução de NaOH 50 mM.
- puxe up o mesmo palito lentamente para visualizar o lisado de ADN como um pegajoso, pegajosos, substância transparente semelhante branco (Figura 3).
- Transferir os tubos de microcentrífuga com lisado de ADN para a incubadora pré-aquecido a 95 ° C durante cinco minutos. Transferir imediatamente o tubo a uma caixa de isopor cheia de gelo.
- Adicionar 20 ul de Tris-HCl 1 directamente para dentro do tubo de microcentrífuga e misturá-lo batendo suavemente no tubo. Usar um papel de pH para assegurar que o pH é cerca de 8,0 (Figura 4) antes da centrifugação.
Nota: Ao lidar com um grande número de preparações de amostra, é aceitável para escolher aleatoriamente algumas amostras para verificar o pH. - Centrifuga-se o tubo com o lisado de ADN a 2.000 xg numa microcentrífuga durante dois minutos à temperatura ambiente para remover os restos de tecido não dissolvido.
- Transferir 150 ul do sobrenadante claro topo para um novo tubo ou placas de 96 poços.
Nota: O lisado de ADN claro está pronto a ser usado como um modelo em computadorR reacção e é estável a 4 ° C durante duas semanas, ou pode ser mantida a -20 ° C durante um ano.
Iniciadores de PCR específicos de sexo 4. Projeto
- Obter números de acesso para o sexo Porcina região determinante Y (SRY) (NM_214452.3) e e genes ligados ao X proteína dedo de zinco (ZFX) (XM_005673501.1) a partir do site NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
- Copiar e colar esses números de acesso NCBI para uma ferramenta de desenho de primers online.
Nota: A melhor informação iniciadores incluindo o comprimento, Tm e% de GC, bem como o tamanho do produto de PCR (pb) será gerado no ecrã do computador (Figura 5). - Validar a especificidade destes iniciadores, utilizando o programa de nucleótidos BLAST (Blastn) contra a base de dados genómico porcino corrente 104 para garantir que estas sequências são apenas localizado no cromossoma X e Y para SRY e ZFX respectivamente (Figura 6).
5. Genomic DNA PCR Diretamente de DNA Lysates
- Usoapenas 1 ul de lisado de ADN como um molde para uma reacção de PCR de 15 uL.
Nota: Um método de rastreio de alto rendimento para placas de 96 poços de PCR pode ser realizada de maneira semelhante, utilizando uma pipeta de canais múltiplos. - Faça o seguinte apenas para a primeira PCR: preparar um tubo de PCR para o controlo negativo sem modelo e dois tubos adicionais para os controlos positivos pela adição de 1 ul (0,5 ng) de ADN genómico porcino conhecida sexo obtidos comercialmente. Mais tarde, incluem uma amostra a partir da última análise sexagem sucesso como um controlo positivo e executado em conjunto com a nova reacção de PCR para a determinação do sexo.
- Usar qualquer mistura pronta enzima PCR HotStart e preparar uma mistura principal por primers adição e nucleases água livre, dependendo do número total de reações de PCR. Adicionar 1 ml de lisado de ADN para um tubo de PCR pré-existente com 14 ul da mistura principal de PCR. Adicionar iniciadores de tal modo que a concentração final dos iniciadores de dois genes específicas do sexo é de 0,3 uM no total de 15 ul de PCR reaction.
- Defina-se o seguinte programa de PCR num termociclador: 95 ° C durante 3 min, 35 ciclos cada uma com um passo de 20 seg de fusão 98 ° C, seguido por um passo de emparelhamento de 15 segundos a 65 ° C, seguido por um passo de alongamento de 15 seg a 72 ° C. Num passo final, incubar as reacções durante 1 min a 72 ° C e continuar a incubar a 4 ° C até à retirada do tubo de PCR por electroforese em gel de verificação para determinar o sexo.
Nota: As condições de PCR e de optimização são de acordo com o manual do kit de PCR mencionado na Tabela Materiais. - Adicionar a quantidade adequada de mancha de gel de DNA não-tóxico verde- SYBR fluorescente quando se prepara um 2% gel de agarose TBE.
Nota: O brometo de etídio pode ser substituído por mancha fluorescente estufa, se ele não está disponível. - Adicionar 1,5 uL de corante de carga (10x) para o tubo de PCR e misturar bem por pipetagem do tampão de reacção de PCR para cima e para baixo.
- Carga de 10 ul de amostra para o poço e run gel de agarose com ajustes de tensão adequadas (aparelho de gel pequena a 100 V, aparelho de gel de 96 poços a 150 V até que a banda de corante é executado a meio caminho através do gel).
- Observar e ajustar as intensidades de bandas sob a configuração de luz fluorescente usando um scanner a laser e capturar uma imagem do gel. Nota: Imager gel comum pode ser substituído para o gel com brometo de etídio.
- Determinar o sexo dos embriões de suíno através da identificação de embriões com uma banda como uma fêmea e duas bandas como um macho (Figura 7).
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Representative Results
Um resultado representativo de determinação do sexo de 345 lisados de ADN de rastreio por PCR é mostrado na Figura 7 e sumariados na Tabela 1.
Como pode ser visto na Figura 7, a temperatura de iniciadores de recozimento a 65 ° C representa a condição óptima neste protocolo de PCR gerando intensidade semelhante e tamanhos amplicon predicado (Figura 5) entre as amostras diferentes.
Dois produtos amplificados de SRY (400 pb) e ZFX (506 pb) são mostrados na imagem em gel (Figura 7). embriões do sexo masculino apresentaram dois fragmentos de ADN com o tamanho correcto da parte superior (400 pb) e (506 pb) bandas mais baixas. A intensidade destas duas bandas foi mostrada para ser igual na maioria dos indivíduos do sexo masculino. Todos os embriões fêmea mostrou apenas um único fragmento de ADN correspondente ao gene localizado no ZFXX-cromossoma.
Os lisados de ADN obtidas a partir da NaOH a 50 mM modificado pode ser utilizado directamente para PCR com uma elevada taxa de sucesso e precisão. lisados de ADN não mostrou qualquer inibição reação de PCR após o rastreio 345 embriões. Apenas três indivíduos não foram sexados e a percentagem de embriões do sexo feminino foi ligeiramente maior do que os homens (Tabela 1).
Figura 1:. Transferência de Embriões Pó transferência de embriões em pó para um tubo de 15 ml.
Figura 2: Coleta e Transferência de Embriões em pó com um palito (A) Uma quantidade excessiva de aderência de pó embrião para o palito.. (B) quantidade correta deembrião pó aderindo ao palito para ser transferido para a solução de reagente de lise alcalina. (C) Uma quantidade insuficiente de pó embrião aderindo ao palito.
Figura 3:. Técnica ADN visualização Lentamente puxar para cima o palito, depois de adicionar o pó de embriões, para determinar se o DNA foi dissolvido embrião como uma substância branca pegajosa pegajosa transparente semelhante.
Figura 4:. Confirmação de pH (A) pH da solução de hidróxido de sódio (reagente de lise alcalina) é 12,0. (B) Depois de adição de tampão de neutralização para o tampão de lise, indicação de cor de papel de pH é verde e o pH deve ser de cerca de 8,0.
Figura 5:.. Nomes específicos de Sex Informação Primer sequências, as sequências e o comprimento amplicon obtidos a partir da ferramenta de desenho de primers Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Mapeamento de Suínos primers específicos de sexo no cromossomo X e Y. (A) Localização da frente e invertidos primers específicos no gene ZFX. (B) Localização da frente e invertidos primers específicos sobre o gene SRY. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7:. Amplificação por PCR de Suínos Genes sexo-específicos a partir do dia 30 embriões 2% gel TBE agarose corado com corante gel DNA SYBR com os controlos positivos conhecidos são indicados com símbolos masculinos e femininos. Duas bandas indicadas como machos e uma única banda como fêmeas. estrela vermelho indicou a possível contaminação da amostra no poço com o aparecimento de uma banda muito ténue menor (400 pb) em comparação com banda superior (506 pb) do produto de PCR causada por iniciadores específicos SRY-Y. Seta vermelha indica a nenhum modelo de controle PCR negativo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| sexagem PCR | Contagem de embrião | |
| ♀ | 185 | 53,60% |
| ♂ | 157 | 45.50% |
| Desconhecido | 3 | 0,90% |
| Total | 345 | 100% |
Tabela 1: Percentagem de Mulher, Homem e Desconhecido após PCR Sexagem entre 345 Dia 30 embriões.
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Discussion
A maioria dos protocolos existentes relacionadas com DNA embriões digitação sexo suína só são adequados para fase inicial estágio de pré-implantação 15,16. Nós temos desenvolvido com sucesso um protocolo adequado para triagem de embriões suínos durante o final de gestação. Baseado em estudos com estágios de desenvolvimento semelhantes de embriões provenientes de estudos anteriores 6,18, o presente protocolo é considerado mais seguro e de baixo custo.
Este protocolo é também adequado para um grande número de amostras para tipagem sexo utilizando PCR, transferindo os lisados de ADN em uma placa de 96 poços. O formato de placa permite rastreio de alto rendimento, permitindo que a transferência de 1 pi de lisado de ADN para a reacção de PCR, utilizando uma pipeta de canais múltiplos.
No entanto, várias etapas envolvidas no procedimento deve ser feito com cuidado. A fim de realizar o método de lise de NaOH a 50 mM modificado de forma mais eficiente, o embrião individualmente congelado tem que ser aterrada em pó finousando um (-80 ° C) almofariz pré-arrefecido e um pilão. Evitar o derramamento de embrião em pó sobre o gelo seco, por raspagem suave e lentamente o pó para dentro do tubo de 15 ml, como mostrado na Figura 1. Alterando as luvas de exame depois de cada amostra é altamente recomendável para evitar pó sobre a luva de transferência para uma outra amostra do embrião.
A quantidade adequada de pó do embrião a ser adicionado à solução de lise de NaOH a 50 mM modificado é mostrado na Figura 2B. Uma quantidade excessiva de pó embrião está apresentada na Figura 2A e deve ser evitado. Do mesmo modo, na Figura 2C, a quantidade de pó de embrião pode ser insuficiente para procedimentos jusante. Embora a pesagem do pó embrião para cada amostra é possível, não é prático quando a seleção do sexo do embrião em um estudo de larga escala envolvendo mais de cem embriões.
A quantidade de DNA podem ser visivelmente verificada usando um palito para verificar o g pegajosaooey substância semelhante, como mostrado na Figura 3, se é duvidoso que a quantidade adequada de pó foi adicionado no passo anterior.
Adicionando a quantidade certa de solução de neutralização é importante depois de lisar o pó embrião. A Figura 4 mostra a mudança de pH antes e após a adição de solução de neutralização. Esta etapa é importante ter a certeza de que o pH é ligeiramente alcalino (cerca de 8,0) e, por conseguinte, semelhante à maioria dos amortecedores de reacção de PCR.
A especificidade dos iniciadores oligo é o elemento mais importante para a exactidão de sexagem do ADN durante a PCR. A especificidade dos iniciadores oligo pode ser confirmada através do programa Blastn do NCBI. Um único local irá ser detectado no cromossoma X, na região não codificante a 3 'do gene ZFX para cada sequência iniciadora (Figura 6A) para o sexo feminino. Uma situação semelhante é detectado apenas no cromossoma Y na região de codificação do gene SRY (Figura 6B
Taxa de erro, devido à não identificação do sexo poderia ser muito baixa (<1%), como mostrado na Tabela 1, quando todos os passos proceder com cuidado e correctamente. No entanto, em alguns casos raros, a contaminação cruzada entre os lisados de ADN de duas amostras diferentes é possível e pode ser detectada por PCR, conforme indicado com uma estrela vermelha no gel (Figura 7). Este tipo de padrão de bandas na fêmea pode ser interpretado como a contaminação cruzada com uma amostra do sexo masculino.
É improvável que o aparecimento de uma banda mais baixa é muito fraco devido a competição do iniciador para reagentes de PCR. Neste caso, o fragmento amplificado menor (400 pb) em relação ao gene SRY irá gerar mais produto de PCR mais rápido do que a banda mais alta correspondente ao gene ZFX. Neste protocolo, uma desvantagem é a determinação de contaminação cruzada de uma amostra com um macho fêmea. Pois nosso objetivo principal não é a quantificação do número de cópias de cada gene alvo, uma pequenaquantidade de pó a partir da amostra fêmea não seria fácil de visualizar no gel.
O protocolo DNA sexagem apresentado aqui é o método mais rentável para identificar o sexo do embrião durante a gestação tardia e pode ser aplicada a outros grandes animais de pecuária como bovinos, caprinos e ovinos. Além disso, o método de sexagem de ADN semelhante foi aplicada em suínos relacionadas com a condição metabólica porcas 18. Outra investigação de pesquisa usando a sexagem de DNA poderia ser aplicado para estudar o mecanismo de imprinting genômico durante a programação pré-natal de desenvolvimento pós-natal no porco 22. Uma ampla gama de aplicações na pecuária usando sexagem de DNA PCR é possível, como programas de seleção de reprodução pré-sexo, e efeitos epigenéticos de nutrição e doenças infecciosas.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a colaboração e as contribuições financeiras da seguinte agência de financiamento da investigação: Alberta gado e de carne Agency Ltd., CRC carne de porco, carne de porco Alberta, Hypor A Hendrix Genetics Companhia e NSERC CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
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