Abstract
Исследование пренатального программирования в свинье показало, что пол развивающегося эмбриона или плода могут влиять на процесс развития. Таким образом, способность определять пол эмбриона является необходимым во многих экспериментах, особенно в отношении раннего развития. Настоящий Протокол демонстрирует недорогой, быстрый и нетоксичный препарат геномной ДНК свиньи для использования с PCR. День 30 эмбрионов должны быть гуманно собраны в соответствии с руководящими принципами, установленными институциональной политики животных и комитетов благосостояния для настоящего протокола. Получение всей эмбриона для этого основанного ПЦР методики Sexing просто включает измельчения замороженного эмбриона до тонкого порошка с использованием предварительно охлажденного ступку и пестик. ПЦР-качество ДНК высвобождается из небольшого количества эмбрионов порошка путем подачи горячей инкубацию в щелочным реагентом для лизиса. Далее, ДНК-раствор смешивают с нейтрализации буфера и использовали непосредственно для ПЦР. Два пары праймеров генерируются в DETECт удельная секс определении области хромосомы Y- (SRY) и ZFX области хромосомы X- с высокой точностью и специфичностью. Же протокол может быть применен к другим удлиненных эмбрионов (день 10 до 14-й день) раньше, чем День 30. Также, этот протокол может быть осуществлена с 96-разгораются пластин при скрининге большого количества зародышей, что делает его возможным для автоматизации и высокой пропускная секс печатать.
Introduction
Домашняя свинья стала фундаментальной предметом исследования в развитии, генетики и питания в обоих человека и животноводческих отраслей. Потенциал свиней в качестве биомедицинских моделей для человеческого исследования можно отнести к их физиологических сходств. В животноводстве, манипулирование соотношение полов может повысить эффективность отбора и генетического улучшения программ 1. Sexing отдельные эмбрионов является фундаментальным инструментом, используемым во многих экспериментальных исследований, включая, но не ограничиваясь генотипа, эпигенетике и X инактивации половой диморфизм во время раннего развития эмбриона 2.
Исследования на мышах показывают, что материнская диета и другие факторы могут привести к половым дисбалансом 3. У свиней, причины соотношение полов дисбаланс включают отцовской породы 4, емкость матки 5, и метаболический состояние свиноматки 6. Поскольку различия, наблюдаемые у эмбрионов и пометов могут влиять SEальными диморфизм, исследователи должны быть осведомлены о эмбриона пола и соотношения полов, прежде чем делать выводы относительно их исследований. Развитие эффективных инструментов и протоколов для определения пола эмбрионов свиньи на 30 день развития будут обсуждаться здесь.
Различные методы полового печатать были разработаны для генетических исследований в модельных организмов и скота. В частности, в скота, выявлении мужского и женского ранних эмбрионов является очень распространенной практикой для повышения генетического отбора для селекционных программах. Ранние эмбрионы кариотипирование в свинью использованием Гимза 7 или интенсивную флуоресценцию 8,9 методы были использованы для секса печатать. Тем не менее, эти методы являются трудоемким и не подходит для скрининга большого числа зародышей быстро и точно.
Наиболее эффективный метод пола набрав амплификации ДНК с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и пары праймеров. определение пола ДНК методом ПЦР является более конкретным, быстрый и чувствительный, оолько требующих незначительное количество клеточных материалов. Первой ПЦР на основе эмбриона определение пола была выполнена на людях 10, а позже у мышей 11, крупного рогатого скота 12, буйволы 13 и овец 14 предимплантационной эмбрионов. В свиньи, самый ранний ДНК секс метод набрав был создан для преимплантационных эмбрионов с помощью одной пары Y-хромосомы праймеров, специфичных ДНК 15. Тем не менее, наиболее распространенные ПЦР-праймеры для определения пола были отобраны из Y-хромосомы у мужчин специфического гена SRY 16 и без секса дискриминационного области гена цинка пальца, расположенного по адресу Х и Y хромосомы 17. Впоследствии эти праймеры были применены к определить пол День 30 эмбрионов в этом исследовании с улучшенной специфичностью праймеров для обнаружения только X- хромосому гена цинк-пальцем.
Геномную ДНК из свиных эмбрионов предимплантационной могут быть извлечены путем воздействия интактной бластоцисты в буфер с proteinas^ К 16 либо путем биопсии нескольких клеток от индивидуального начале расщепления эмбрионов 15 и использовать их для прямого ПЦР. Тем не менее, выпуск ДНК из свиной крови, волос, тканей или большой зародыш в течение нескольких сантиметров в размере не эффективно осуществляется с помощью протеиназы метод K. Методы экстракции ДНК для этих материалов были созданы с использованием либо трудоемких фенол / хлороформ протоколы 6 или основанные дорого колонка комплекты 18. Во избежание использования потенциально токсичных химических веществ, наблюдается тенденция развивать недорогой, простой и фенолов в методы выделения ДНК. Этот тип протокола для выделения ПЦР-качества геномной ДНК из мышей 19 и данио 20 тканей была создана с использованием горячего гидроксида натрия и трис (HotShot). Это исследование обеспечивает протокол для получения ДНК с модифицированными HotShot и переработан пары праймеров дуплекс для ПЦР пола набрав непосредственно из клеточных лизатов Дня 30 свиных эмбрионов свысокая точность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В соответствии с Канадским советом по принципов ухода за животными и с одобрения политики факультета животноводства и Комитета благосостояния - поголовье Университета Альберты, беременных свиноматок были умерщвлены по подготовленных штабами приблизительно 30 день беременности и эмбрионов были собраны. Используйте чистые перчатки во все времена во время процедур.
1. Отбор проб и образцов для хранения
- Эвтаназии свиноматку с использованием плен болт с последующим кровопусканием. Носите чистые перчатки, чтобы собрать половых путей и эмбрионов от каждого эвтаназии свиноматки.
Примечание: быстрый сбор образцов и эмбрионов трансфертных сухой лед или жидкий азот приведет к увеличению тканей качества для других молекулярных работ, таких как микрочипов и КПЦР. - Рассеките матку и осторожно отделить все эмбрионы в своих внеэмбриональные плацентарных мембран от основной стенки матки 21. Убедитесь, что нет является загрязнение материнской ткани нет.
- редлина шнура и вес всех жизнеспособных эмбрионов перед замораживанием.
- Собрать каждую отдельную эмбрион и сразу завернуть в алюминиевую фольгу, прежде чем оснастки замораживание жидким азотом.
- Передача замороженных эмбрионов из жидкого азота непосредственно к -80 ° C морозильнике.
2. Шлифовальные Эмбрионы
- Этикетка все пробирки с образцами (15 мл) с образцом ID необходимой для числа анализируемых образцов.
- Заполните тепловой контейнер с сухим льдом, чтобы наполовину и вставьте предварительно помечены пробирку в сухом льду.
- Носите зимние перчатки с другой парой смотровых перчаток на вершине для передачи предварительно охлажденные растворы и пестики от -80 ° C морозильник, чтобы сухой лед контейнер.
- Поместите замороженные эмбрионы внутри раствора на сухом льду.
- Налейте достаточное жидкий азот, чтобы покрыть эмбрион и растереть его с пестиком в тонкий порошок.
- Перенести порошок эмбриона на заранее помечены пробирку с MICRospatula (Рисунок 1) и поместите пробирку в C морозильнике -80 °.
- Используйте чистую предварительно охлажденной ступку и пестик для каждого эмбриона и изменить смотровые перчатки после измельчения каждого эмбриона, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами.
3. геномную ДНК Получение использованием модифицированного гидроксида натрия Метод
- Этикетка все микроцентрифужных трубки (1,5 мл), необходимые для числа анализируемых образцов.
- Передача пробирок для проб эмбриона порошок от -80 ° C морозильнике в контейнер с сухим льдом до начала.
- Пипетировать 180 мкл 50 мМ NaOH (гидроксид натрия) в каждую предварительно меченных микроцентрифужных трубки.
- Включите инкубатор и предварительный нагрев до 95 ° C.
- Используйте зубочистку, чтобы передать необходимое количество эмбрионов порошка (около 5-10 мг) (рисунок 2) из пробирки в предварительно помечены микроцентрифужных пробирку, содержащую раствор 50 мМ NaOH.
- Потяните Uр то же зубочисткой медленно визуализировать лизат ДНК в виде плотной клейкой, белый прозрачный подобные вещества (рисунок 3).
- Перенесите микроцентрифужных пробирок с лизата ДНК в предварительно нагретой инкубаторе при 95 ° С в течение пяти минут. Сразу передачи трубки для пенополистирола ящик, наполненный льдом.
- Добавить 20 мкл 1 М Трис-HCl непосредственно в пробирку микроцентрифужных и смешать его аккуратным постукиванием трубки. Используйте индикаторную бумагу, чтобы обеспечить рН приблизительно 8,0 (фиг.4) перед центрифугированием.
Примечание: При работе с большим количеством опытных препаратов, это приемлемо для случайным образом выбирать несколько образцов для проверки рН. - Центрифуга трубки с лизата ДНК при 2,000 мкг в микроцентрифуге в течение двух минут при комнатной температуре, чтобы удалить мусор нерастворенного тканей.
- Передача 150 мкл верхнего прозрачного супернатанта в новую пробирку или 96-луночные планшеты.
Примечание: Прозрачный лизат ДНК готова к использованию в качестве матрицы в ПКРеакцию R и она стабильна при температуре 4 ° С в течение двух недель, или оно может храниться при температуре -20 ° С в течение года.
4. Конструкция Пол-специфической ПЦР праймеры
- Получить инвентарными номерами для свиней секс определения область Y (SRY) (NM_214452.3) и и белковые цинковый палец с Х-хромосомой (ZFX) гены (XM_005673501.1) с сайта NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
- Скопируйте и вставьте эти цифры вступлении NCBI к онлайн инструмент проектирования грунтовка.
Примечание: Лучший праймеры информация, включая длину, Tm и GC%, а также размер продукта ПЦР (ВР) будет генерироваться на экране компьютера (рис 5). - Подтвердить специфику этих праймеров с использованием программы нуклеотид Blast (BLASTN) против нынешнего свиного геномной базе 104, чтобы обеспечить эти последовательности находятся только на X и Y хромосомы для SRY и ZFX соответственно (рисунок 6).
5. геномную ДНК ПЦР Непосредственно из ДНК лизатов
- использованиетолько 1 мкл лизата ДНК в качестве матрицы для 15 мкл ПЦР-реакции.
Примечание: высокая пропускная способ скрининга на 96-луночных планшетах ПЦР может быть выполнена аналогичным образом с использованием многоканальной пипетки. - Выполните следующие действия только для первой ПЦР: подготовить один ПЦР трубки для не шаблона отрицательного контроля и две дополнительные трубы для положительного контроля путем добавления 1 мкл (0,5 нг) коммерчески полученного известно секс свиного геномной ДНК. Позже, включают пробу из последнего успешного анализа Sexing в качестве положительного контроля и запустить вместе с новым ПЦР для определения пола.
- Использование любого HotStart готовой смеси ПЦР фермент и подготовить мастер смеси путем добавления праймеров и нуклеазному свободную воду в зависимости от общего количества реакций ПЦР. Добавить 1 мкл лизата ДНК в предварительно существующего ПЦР-пробирку с 14 мкл мастер смеси ПЦР. Добавить праймеров таким образом, что конечная концентрация праймеров из двух генов половых конкретных составляет 0,3 мкм общей сложности 15 мкл ПЦР гeaction.
- Настройка следующую программу ПЦР в амплификатор: 95 ° С в течение 3 мин, 35 циклов друг с шагом 20 сек плавления 98 ° C, с последующей стадией отжига 15 сек при 65 ° С, с последующей стадией элонгации 15 сек при 72 ° С. На заключительном этапе, инкубировать реакции в течение 1 мин при 72 ° С и продолжают инкубировать при температуре 4 ° С до удаления трубки ПЦР для верификации гель-электрофореза для определения пола.
Примечание: условия и оптимизация ПЦР соответствии с инструкцией к набору ПЦР упомянутого в таблице материалов. - Добавить соответствующее количество нетоксичного зелено-флуоресцентной SYBR гель ДНК пятна при подготовке 2% TBE агарозном геле.
Примечание: бромистый этидий может быть заменен на зеленый-флуоресцентным красителем, если он не доступен. - Добавить 1,5 мкл загрузочного красителя (10x) в ПЦР-пробирку и хорошо перемешать с помощью пипетки реакционного буфера ПЦР вверх-вниз.
- Нагрузка 10 мкл образца в лунку и тип агарозный гель с соответствующими настройками напряжения (малый гель Устройство при 100 V, 96-а аппарат гель при 150 V до полосы красителя работает на полпути через гель).
- Наблюдайте и регулировать интенсивность групп не под обстановке флуоресцентного света с помощью лазерного сканера и захватить изображение геля. Примечание: Общие тепловизора гель может быть заменен на геле бромистым этидием.
- Определить пол свиных эмбрионов путем выявления эмбрионов с одной полосы, как самки и двух групп, как мужчины (рис 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель результат определения пола из 345 ДНК скрининга лизатов ПЦР показано на рисунке 7 и в таблице 1.
Как можно видеть на фигуре 7, температура отжига праймеров при 65 ° С является оптимальной условием в данном протоколе ПЦР генерирующего одинаковой интенсивности и определяющуюся размеры ампликона (рис.5) среди различных образцов.
Два усиленных продукты SRY (400 б.п.) и ZFX (506 п.н.) показаны на рисунке гель (рисунок 7). Мужской эмбриона показывают два фрагмента ДНК с правильной величины верхнего (400 п.о.) и нижних (506 п.н.) полос. Интенсивность этих двух полос было показано, что равные по наиболее мужских особей. Все женские эмбрионы только показал единственный фрагмент ДНК, соответствующий гену ZFX, расположенного вX-хромосома.
ДНК лизаты, полученные из модифицированного 50 мМ NaOH может быть использован непосредственно для ПЦР с высокой вероятностью успеха и точности. лизаты ДНК не показал никакой реакции ингибирования ПЦР после скрининга 345 эмбрионов. Только три лица не были сексуально и процент эмбрионов женского пола была немного выше, чем у мужчин (таблица 1).
Рисунок 1:. Эмбрион Порошок Передача Передача эмбриона порошок с 15 мл пробирку.
Рисунок 2: Сбор и передача эмбрионов порошок с зубочисткой (А) Чрезмерное количество эмбрионов порошка, прилипшего к зубочисткой.. (Б) правильное количествоЭмбрион Порошок придерживаясь зубочистки должны быть переданы к раствору щелочного лизиса реагента. (C) Недостаточное количество эмбрионов порошка придерживаясь зубочистки.
Рисунок 3:. ДНК Визуализация Техника Медленно поднимите зубочистку, после добавления порошка эмбрионов, чтобы определить, является ли ДНК эмбриона растворится в виде плотной клейкой белой прозрачной массы.
Рисунок 4:. РН подтверждения (А) рН раствора гидроксида натрия (щелочной реагент для лизиса) 12,0. (B) После добавления нейтрализации буфера в буфер для лизиса, индикация цвет индикаторной бумаги зеленого цвета и рН должен быть около 8,0.
Рисунок 5:.. Пол-специфического праймера Информация имена последовательности Последовательности и длина ампликона получены из инструмента проектирования праймер Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 6: Сопоставление свиного секс-специфические праймеры на хромосоме X и Y. (A) Местонахождение вперед и обратные праймеры, указанные на гене ZFX. (B) Местонахождение вперед и вспять праймеров, указанные на гене SRY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 7:. ПЦР-амплификации свиные секс-специфических генов из 30-й день эмбрионов 2% гель агарозы КЭ окрашивали SYBR ДНК гель пятно с известными положительных контролей указаны с мужскими и женскими символами. Две полосы обозначены как мужчин, так и одной полосы, как у женщин. Красная звезда указывает на возможное заражение образца в лунке с появлением очень слабым нижней полосы (400 п.н.) по сравнению с верхней полосы (506 пар оснований) продукта ПЦР, вызванного SRY Y-специфических праймеров. Красная стрелка указывает на нет шаблона ПЦР отрицательный контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
| Sexing ПЦР | Эмбрион Граф | |
| ♀ | 185 | 53.60% |
| ♂ | 157 | 45.50% |
| неизвестный | 3 | 0,90% |
| Всего | 345 | 100% |
Таблица 1: Процент самка, самец и Неизвестного после ПЦР Sexing среди 345 день 30 эмбрионов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Большинство существующих протоколов, связанных с свиного эмбрионы ДНК секс набрав пригодны только для ранней стадии предимплантационной стадии 15,16. Мы успешно разработали протокол, подходящий для свиней скрининга эмбрионов в конце беременности. Основываясь на исследованиях с аналогичными стадиями развития эмбриона из предыдущих исследований 6,18, настоящий акт считается безопаснее и низкая стоимость.
Этот протокол также подходит для большого количества образцов для пола печатать с помощью ПЦР путем передачи из лизатов ДНК в 96-луночный планшет. Формат пластина позволяет высокопроизводительного скрининга, путем передачи 1 мкл лизата ДНК для ПЦР с использованием многоканальной пипетки.
Тем не менее, несколько этапов в процедуре должно быть сделано аккуратно. Для того, чтобы более эффективно выполнять модифицированного метода лизиса 50 мМ NaOH, индивидуально замороженный эмбрион должен быть заземлен в мелкий порошокс использованием предварительно охлажденного (-80 ° C) ступку и пестик. Избегайте попадания эмбриона порошок на сухом льду, осторожно и медленно очищая порошок в 15 мл трубки, как показано на рисунке 1. Изменение смотровые перчатки после каждого образца настоятельно рекомендуется, чтобы избежать порошок на перчатке переводе на другую образца эмбриона.
Соответствующее количество эмбрионов порошка должен быть добавлен к модифицированным раствором для лизиса 50 мМ NaOH, показан на фиг.2В. Избыточное количество эмбрионов порошка представлен на фиг.2A и его следует избегать. Аналогично, на фиг.2С, количество эмбрионов порошка может быть недостаточным для последующих процедур. Хотя взвешивания порошка эмбрионов для каждого образца можно, это не практично, когда скрининг эмбрионов секс в широкомасштабном исследовании с участием более ста эмбрионов.
Количество ДНК может быть заметно проверяется с помощью зубочистки, чтобы проверить на липкой гooey подобные вещества, как показано на рисунке 3, если это сомнительно, был ли добавлен соответствующее количество порошка в предыдущем шаге.
Добавление нужное количество нейтрализации раствора важно после лизировать порошок эмбриона. Рисунок 4 показывает изменение рН после и перед добавлением нейтрализации раствора. Этот шаг важен, чтобы убедиться, что рН слегка щелочной (около 8,0) и, следовательно, по аналогии с большинством буферов реакции ПЦР.
Специфика олиго праймеров является наиболее важным элементом для точности определения пола ДНК в процессе ПЦР. Специфичность олиго праймеров может быть подтверждена с помощью программы NCBI BLASTN. Одном месте будет обнаружен на Х-хромосоме в некодирующей области 3'гена ZFX для каждой последовательности праймера (фиг.6А) для самок. Аналогичная ситуация обнаруживается только на Y-хромосоме в кодирующей области гена SRY (6В
Частота повторения ошибок из-за отсутствия определения пола может быть очень низким (<1%), как показано в таблице 1, когда все шаги действовать осторожно и правильно. Тем не менее, в некоторых редких случаях, перекрестное загрязнение между лизатов ДНК двух разных образцов возможно и может быть обнаружен с помощью ПЦР, как указано с красной звездой в геле (фиг 7). Этот тип обвязочной рисунком в самки могут быть интерпретированы как перекрестного загрязнения с мужской образца.
Это маловероятно, что появление очень слабой нижней полосы происходит из-за конкуренции грунтовочного реагентов для ПЦР. В этом случае, чем меньше ампликона (400 п.н.), связанные с геном SRY будет генерировать больше ПЦР-продукта быстрее, чем более высокой полосы, соответствующей гену ZFX. В этом протоколе, один недостаток заключается в определении перекрестного загрязнения мужского образца с самкой. Потому что наша главная цель заключается не количественное число копий для каждого гена-мишени, крошечноеКоличество порошка из женского образца не будет легко визуализировать на геле.
Протокол ДНК определение пола представлены здесь является наиболее экономически эффективным методом для выявления эмбрионов секс в конце беременности и может быть применен к другим крупных сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, козы и овцы. Кроме того, подобный метод ДНК определение пола была применена у свиней, связанных с свиноматок метаболическое состояние 18. Другое расследование исследования с использованием Sexing ДНК могут быть применены для изучения геномной механизм импринтинга в пренатальном программировании постнатального развития у свиньи 22. Широкий спектр применения в животноводстве с использованием ДНК ПЦР Sexing можно таких как программы разведения Выбор предварительно секса и эпигенетических эффектов питанием и инфекционными заболеваниями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить сотрудничество и финансовые взносы следующей исследовательской финансирующей организации: Alberta животноводства и мясопереработки Agency Ltd., свинина CRC, Alberta свинина, Hypor A Hendrix Genetics Company и NSERC CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
References
- Seidel, G. E. Economics of selecting for sex: the most important genetic trait. Theriogenology. 59, 585-598 (2003).
- Gutiérrez-Adán, A., et al. Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development. Reprod. Domest. Anim. 41, Suppl 2. 54-62 (2006).
- Rosenfeld, C. S., Roberts, R. M. Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review. Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).
- Gorecki, M. T. Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758). Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).
- Chen, Z. Y., Dziuk, P. J. Influence of initial length of uterus per embryo and gestation stage on prenatal survival, development, and sex ratio in the pig. J. Anim. Sci. 71, 1895-1901 (1993).
- Vinsky, M. D., Novak, S., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Foxcroft, G. R. Nutritional restriction in lactating primiparous sows selectively affects female embryo survival and overall litter. Reprod. Fertil. Dev. 18, 347-355 (2006).
- Cassar, G., King, W. A., King, G. J. Influence of sex on early growth of pig conceptuses. J. Reprod. Fertil. 101, 317-320 (1994).
- Zudova, D., Rezacova, O., Kubickova, S., Rubes, J. Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 102, 179-183 (2003).
- Hornak, M., Oracova, E., Hulinska, P., Urbankova, L., Rubes, J. Aneuploidy detection in pigs using comparative genomic hybridization: from the oocytes to blastocysts. PLoS One. 7, (2012).
- Handyside, A. H., Pattinson, J. K., Penketh, R. J., Delhanty, J. D., Winston, R. M., Tuddenham, E. G. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet. 1, 347-349 (1989).
- Wilton, L. J., Shaw, J. M., Trounson, A. O. Successful single-cell biopsy and cryopreservation of preimplantation mouse embryos. Feri. Steril. 51, 513-517 (1989).
- Peura, J. M., Turunen, M., Janne, J. A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction. Theriogenology. 35, 547-555 (1991).
- Rao, K. B., Pawshe, C. H., Totey, S. M. Sex determination of in vitro developed buffalo (Buhalus buhalis.) embryos by DNA amplification. Mol. Reprod. Dev. 36, 291-296 (1993).
- Herr, C. M., Matthaei, K. I., Petrzak, U., Reed, K. C. A rapid Y-chromosome-detecting ovine embryo sexing assay. Theriogenology. 33, 245 (1990).
- Fajfar-Whetstone, C. J., LaneRayburn, A., Schook, L. B., Wheeler, M. B. Sex determination of porcine during preimplantation embryos via y-chromosome specific DNA sequences. Animal Biotechnology. 4, 183-193 (1993).
- Pomp, D., Good, B. A., Geisert, R. D., Corbin, C. J., Conley, A. J. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim. Sci. 73, 1408-1415 (1995).
- Aasen, E., Medrano, J. F. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Biotechnology (N Y). 8, 1279-1281 (1990).
- Oliver, G., et al. Restricted feed intake in lactating primiparous sows. II. Effects on subsequent litter sex ratio and embryonic gene expression. Reprod Fertil. Dev. 23, 899-911 (2011).
- Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R. L., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29, 52-54 (2000).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos. Biotechniques. 43, 610-614 (2007).
- Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts. Animal. 8, 293-299 (2014).
- Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L. Prenatal programming of postnatal development in the pig. Control of Pig Reproduction VIII. Rodriguez-Martinez, , Nottingham University Press. 212-213 (2009).
