Abstract
domuz prenatal programlama içine Araştırma gelişen embriyonun veya fetüsün cinsiyet gelişim sonucunu etkilemeye göstermiştir. Bu nedenle, bir embriyonun cinsiyetini belirleme yeteneği özellikle erken gelişimi ile ilgili birçok deneyler gereklidir. Bu protokol, PCR ile kullanım için domuz genomik DNA ucuz, hızlı ve toksik olmayan hazırlanmasını ortaya koymaktadır. Gün 30 embriyolar insanca mevcut protokol için Kurumsal Hayvan Politikası ve Refah Komiteleri tarafından oluşturulan kurallara göre toplanan gerekir. Bu PCR bazlı cinsiyet tayini tekniği bütün embriyo hazırlanması sadece önceden soğutulmuş bir havan ve havan tokmağı kullanılarak ince bir toz halinde donmuş embriyo taşlama içerir. PCR kalitede DNA alkalin liziz reaktifi sıcak inkübasyon uygulayarak embriyo tozu küçük bir miktar serbest bırakılmaktadır. Daha sonra, DNA solüsyonu nötralizasyon tamponu ile karıştırılmış ve PCR için doğrudan kullanılmıştır. İki primer çiftleri DETEC için oluşturulacakyüksek doğruluk ve özgüllük ile X- kromozomunun Y kromozomu (SRY) ve ZFX bölgenin bölgesini belirleyen t özgü seks. aynı protokol gün daha önce başka bir uzun embriyolar (gün 14 gün 10) uygulanabilir 30. otomasyon ve yüksek için uygun hale embriyo çok sayıda tarama Ayrıca, bu protokol 96 dönüştü plakalı yapılabilir verim seks yazarak.
Introduction
yerli domuz, insan ve hayvan sektörlerinde gelişme, genetik ve beslenme temel bir araştırma konusu haline gelmiştir. insan araştırma için biyomedikal model olarak domuz potansiyel fizyolojik benzerlikler isnat edilebilir. Hayvancılık, cinsiyet oranı manipülasyon seçimi ve genetik iyileştirme programları 1 etkinliğini artırabilir. Bireysel embriyolar sexing dahil ancak erken embriyo gelişimi 2 sırasında genotip, epigenetik ve cinsel dimorfizm X inaktivasyonu ile sınırlı değildir, birçok deneysel araştırmalarda kullanılan temel bir araçtır.
Farelerde yapılan çalışmalar, anne beslenme ve diğer faktörler, cinsiyet dengesizliği 3 neden olabileceğini düşündürmektedir. Domuzlarda, cinsiyet oranı dengesizlik nedenleri baba cins 4, rahim kapasitesi 5 ve sow metabolik durumunu 6 içerir. embriyolar ve yavrularına gözlenen farklılıklar se etkilemiş olabilir berixual dimorfizm araştırmacılar araştırma ile ilgili kararınızı vermeden önce embriyo cinsiyet ve cinsiyet oranları farkında olmalıdır. gelişme 30. günde domuz embriyolar sexing verimli araçlar ve protokollerin geliştirilmesi burada ele alınacaktır.
seks yazarak çeşitli yöntemler model organizmaların ve hayvancılık genetik çalışmalar için geliştirilmiştir. Özellikle hayvancılık, erkek ve kadın erken embriyolar belirlenmesi ıslah programları için genetik seçimi geliştirmek için çok yaygın bir uygulamadır. Giemsa 7 veya yoğun floresan 8,9 teknikleri kullanılarak domuz Karyotipleme erken embriyolar seks yazım için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu metodlar zaman alıcı ve hızlı ve doğru bir şekilde embriyo sayıda taranması için uygun değildir.
En etkili seks yazım metodu, ısı sabit DNA polimeraz ve bir çift primer kullanılarak DNA amplifikasyon. PCR yöntemi ile DNA cinsiyet tayini O, daha özel bir hızlı ve duyarlı birnly hücresel malzemelerin bir dakika miktarda gerektirir. İlk PCR tabanlı embriyo cinsiyet tayini insanlarda 10 üzerinde gerçekleştirilir ve daha sonra fareler 11, sığır 12, manda, koyun 13 14 pre-implantasyon embriyoları oldu. Domuz, erken DNA seks yazarak yöntemi Y-kromozomu spesifik DNA primerleri 15 tek çifti üzerinden pre-implantasyon embriyoları için kurulmuştur. Bununla birlikte, cinsiyet tespiti için en yaygın PCR primerleri, bir erkek spesifik SRY 16 ve X ve Y kromozom 17 hem de yer alan bir çinko parmak geninin olmayan seks ayırt bölgenin Y kromozom seçilmiştir. Daha sonra, bu primer, bir çinko-parmağı genin sadece X kromozomu tespit etmek için primerler geliştirilmiş özgüllük bu çalışmada gün 30 embriyo cinsiyet belirleme uygulanmıştır.
domuz pre-implantasyon embriyoları genomik DNA proteinas tamponu için sağlam bir blastosist maruz bırakılarak elde edilebilire K 16 veya bireysel erken bölünme birkaç hücre biyopsi alarak 15 embriyolar ve direkt PCR için bunları kullanarak. Bununla birlikte, domuz kanı, saç, dokular ya da boyut olarak birkaç santimetre üzerinde büyük konseptus DNA salgılanmasının etkin bir şekilde proteinaz K yöntemiyle yapılmaz. Bu malzemeler için DNA ekstraksiyon yöntemleri zaman alıcı fenol / kloroform protokolleri 6 ya da pahalı sütun tabanlı kitleri 18 kullanılarak kurulmuştur. potansiyel olarak toksik kimyasalların kullanımını önlemek için, ucuz, kolay ve fenol içermeyen DNA ekstraksiyon yöntemleri geliştirmek için bir eğilim vardır. Fare 19 ve zebra balığı 20 dokularından elde edilen kalite genomik DNA izolasyonu için protokol Bu tür sıcak sodyum hidroksit ve tris (Hotshot) kullanılarak kurulmuştur. Bu çalışma, PCR seks için Hotshot değiştirilmiş ve yeniden tasarlanmış dubleks primer çiftleri Günün hücre lizatları 30 domuz embriyolar ile doğrudan yazarak DNA elde etmek için bir protokol sağlaryüksek doğruluk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi ile ve Fakülte Hayvan Politikası ve Refah Kurulu onayı gereğince - Alberta Üniversitesi'nden Hayvancılık, hamile sows gebelik ve embriyo 30 toplandı yaklaşık Gününde eğitilmiş personeli tarafından ötenazi uygulandı. işlemleri sırasında her zaman muayene eldivenleri kullanın.
1. Örnek Toplama ve Numune Depolama
- kansız bırakılarak, ardından tutucu cıvata kullanılarak ekmek öldürülür. Her ötenazi ekmek üreme yolları ve embriyolar toplamak için muayene eldiven giyin.
Not: örnekler ve embriyo transferi hızlı toplama buz veya sıvı azot gibi mikrodizi ve qPCR gibi diğer moleküler işler için daha yüksek kalitede dokularda neden olur kuru. - Rahim incelemek ve yavaşça yatan rahim duvarından 21 kendi extraembryonic plasental membranların içindeki tüm embriyolar ayırın. Hiçbir anne doku kirlenme olduğundan emin olun.
- Yenidendonma önce tüm canlı embriyoların kordon uzunluğu ve ağırlığı.
- her embriyo toplayın ve hemen ek sıvı azot ile dondurma önce bir alüminyum folyo içinde tamamlamayı.
- doğrudan -80 ° C derin dondurucuda sıvı azot dondurulmuş embriyolar transfer.
2. Öğütme Embriyolar
- numune sayısı için gerekli Numune No Tüm numune tüpleri (15 mi) etiketi analiz edilecek.
- yarım dolu kuru buz ile ısı kabı doldurmak ve kuru buz içinde önceden etiketlenmiş örnek tüp yerleştirin.
- Buz kabı kuru ° C derin dondurucuda -80 önceden soğutulmuş harç ve havan aktarmak için üst muayene eldiveni başka bir çift ile kış eldiven giyin.
- kuru buz üzerinde harç içinde donmuş embriyo yerleştirin.
- embriyo kapak ve ince bir toz haline tokmak ile öğütmek için yeterli bir sıvı azot dökün.
- Bir MICR ile önceden etiketlenmiş numune tüpü embriyo toz transferiospatula (Şekil 1) ve -80 ° C derin dondurucuda tüp yerleştirin.
- Her embriyo için temiz bir ön-soğutulmuş havan kullanın ve örnekler arasındaki çapraz kontaminasyonu engellemek için her bir embriyo öğütüldükten sonra muayene eldivenleri değiştirin.
3. Genomik DNA Hazırlama Sodyum hidroksit Yöntemi Modifiye kullanarak
- numune sayısı için gerekli etiket Tüm mikrosantrifüj tüpleri (1.5 mi), analiz edilecek.
- elde edilen embriyo tozu içeren örnek tüplerini aktarın -80 ° C derin dondurucuda bir kapta kuru buz ile önceden başlamadan.
- Her bir önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpüne 50 mM NaOH (sodyum hidroksit) ile 180 ul pipet.
- 95 ° C'ye kadar bir kuluçka öncesi ısı açın.
- 50 mM NaOH çözeltisi ihtiva eden bir ön-etiketli mikrosantrifüj tüpüne Örnek borusundan embriyo tozun doğru miktarda (yaklaşık 5-10 mg) (Şekil 2) aktarmak için bir kürdan.
- u çekinp aynı kürdan yavaş yavaş bir yapışkan, aşırı duygusal, beyaz, şeffaf benzeri bir madde (Şekil 3) DNA lizatı görselleştirmek için.
- Beş dakika süre ile 95 ° C'de önceden ısıtılmış bir inkübatör DNA lizat ile mikrosantrifüj tüpleri aktarın. Hemen buz dolu bir strafor kutu tüp aktarın.
- doğrudan mikrosantrifüj tüpüne 1 M Tris-HCI 20 ul ilave edin ve tüp hafifçe dokunarak karıştırın. PH santrifüj önce yaklaşık 8.0 (Şekil 4) sağlamak için pH kağıdı kullanın.
Not: Örnek hazırlıkları çok sayıda uğraşırken, rastgele pH'ı kontrol etmek birkaç örnek almak kabul edilebilir. - çözülmemiş doku çöküntüsü ortadan kaldırılmaktadır oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde 2,000 xg DNA lisatı ile tüp santrifüjleyin.
- Devri, yeni bir tüp içine, berrak yüzer 150 ul ya da 96 gözlü plakalar.
Not: berrak DNA lizat PC şablon olarak kullanıma hazırR, reaksiyon ve iki hafta içinde 4 ° C'de stabildir, ya da, bir yıl boyunca -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
4. Tasarım Sex-spesifik PCR primerler
- NCBI web sitesinden http://www.ncbi.nlm.nih.gov gelen Domuz seks belirleyici bölge Y (SRY) için katılım numaralarını (NM_214452.3) ve ve çinko parmak protein X'e bağlı (ZFX) genleri (XM_005673501.1) elde /.
- Kopyala ve bir online astar tasarım aracı bu NCBI erişim numaraları yapıştırın.
Not: Uzunluk, Tm ve GC% olarak PCR ürün hacmi (bp), bilgisayar ekranında oluşturulur (Şekil 5) de dahil olmak üzere iyi primerler bilgileri. - Bu dizilerin yalnızca sırasıyla SRY ve ZFX (Şekil 6) X ve Y kromozomu üzerinde yer sağlamak için mevcut domuz genomik veri tabanında 104 karşı nükleotit Blast programı (BLASTN) kullanarak bu primerlerin özgüllük doğrula.
Doğrudan DNA Lisatlar 5. genomik DNA, PCR
- kullanım15 ul PCR reaksiyonu için şablon olarak DNA, lizat yalnızca 1 | il.
Not: 96 oyuklu plakalar PCR için bir yüksek veri akışı tarama yöntemi, bir çok kanallı pipet kullanarak benzer bir şekilde gerçekleştirilebilir. - İlk PCR için aşağıdakileri yapın: ticari olarak elde bilinen seks domuz genomik DNA 1 ul (0.5 ng) ekleyerek hiçbir şablon negatif kontrol ve pozitif kontroller için iki ek borular için bir PCR tüpü hazırlayın. Daha sonra, bir pozitif kontrol olarak, son başarılı cinsiyet tayini analizi bir örnek vardır ve cinsiyet tespiti için yeni bir PCR reaksiyonunda ile birlikte çalışır.
- Herhangi bir HotStart hazır karışım PCR enzimi kullanın ve ekleyerek primerler tarafından ana karışımı hazırlamak ve PCR reaksiyonlarının toplam sayısına bağlı olarak ücretsiz su nükleaz. PCR Master Mix 14 ul önceden var olan bir PCR tüpü içerisine DNA lizat için 1 ul ekle. primerler ekleme gibi, iki cinsiyete spesifik genlerden primerlerin nihai konsantrasyon 15 | il PCR r, toplam 0.3 uM olduğunu,eaction.
- termal siki üs cihazında Aşağıdaki PCR programı ayarlama: 3 dakika, 95 ° C 35 döngü 15 saniye uzatma adımı, ardından 65 ° C'de 15 saniye tavlama aşamasına ve ardından bir 20 saniye Erime aşama 98 ° C, her 72 ° C'de. Son bir adımda, 72 ° C'de 1 dakika için reaksiyonlar inkübe ve cinsiyet belirlemek için jel elektroforezi doğrulama için PCR tüpü çıkarılması kadar 4 ° C'de inkübe devam etmektedir.
Not: PCR koşulları ve optimizasyon Malzemeleri Tablo belirtilen PCR kiti kılavuzuna göredir. - % 2 TBE agaroz jel hazırlanırken, toksik olmayan yeşil-floresan SYBR DNA jel leke uygun miktarda ekleyin.
Not: mevcut değilse Ethidium bromür sera floresan leke ikame edilebilir. - PCR tüp içine yükleme boyası (10x) 1.5 ul ekleyin ve PCR reaksiyon tamponu yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın.
- oyuk ve r içine örnek yüklenebilir 10 ulun uygun voltaj ayarlarıyla agaroz jel (boya bant kadar 100 V küçük jel cihaz, 150 V, 96 oyuklu jel aparatı jeli içinden yarım çalışır).
- Gözlemleyin ve bir lazer tarayıcı kullanılarak floresan ışığı ayarı altında bantları yoğunlukları ayarlayın ve jel bir görüntü yakalamak. Not: Genel jel görüntüleyici etidyum bromür jel için ikame edilebilir.
- Bir kadın olarak bir bant ve bir erkek olmak üzere iki bant (Şekil 7) ile embriyolar tanımlayarak domuz embriyoların cinsiyeti belirlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PCR ile 345 DNA Lizatlar taramadan cinsiyet tayini temsili bir sonuç Şekil 7'de gösterilen ve Tablo 1'de özetlenmiştir.
Şekil 7'de görüldüğü gibi, 65 ° C 'de primer tavlama ısısı farklı örnekleri arasında, bu PCR protokolü içindeki yoğunluk ve esas amplikon boyutları üretilmesi (Şekil 5) uygun bir durumdur.
SRY (400 bp) ve ZFX (506 bp), iki amplifiye ürün jeli resim (Şekil 7) gösterilmiştir. Erkek embriyolar üst (400 bp) doğru boyut ve düşük (506 bp) bantları ile iki DNA fragmanlarının gösterdi. Bu iki bantların yoğunluğu çoğu erkek bireylerde eşit olduğu gösterilmiştir. Tüm kadın embriyolar, sadece yer ZFX genine tekabül eden tek bir DNA fragmanını göstermiştirX kromozomu.
tadil edilmiş 50 mM NaOH elde edilen DNA lizatları yüksek başarı oranı ve doğruluk ile PCR için direkt olarak kullanılabilir. DNA lizatları 345 embriyolar eleme sonra herhangi bir PCR reaksiyon engelleyecek durumda değildir. Sadece üç kişi cinsiyette değildi ve kadın embriyoların yüzde erkeklerde (Tablo 1) biraz daha yüksek oldu.
Şekil 1:. Embriyo Toz Transfer 15 ml tüp embriyo tozu aktarılması.
Şekil 2: Toplama ve Kürdan ile Embriyo Pudra aktarılması (A) kürdan embriyo toz yapışan bir aşırı miktarda.. (B) Doğru miktardakürdan yapışan embriyo toz alkali liziz reaktifi çözeltisine aktarılması. (C) kürdan bağlı kalarak embriyo tozu bir miktarı yetersiz.
Şekil 3:. DNA Görselleştirme Tekniği Yavaş embriyo DNA yapışkan yapışkan beyaz şeffaf benzeri bir madde olarak çözülmüş olup olmadığını belirlemek için, embriyo tozu ekledikten sonra, kürdan yukarı çekin.
Şekil 4: Ph. Teyit sodyum hidroksit (alkali liziz reaktifi) çözeltisi (a) pH 12.0. Liziz tamponuna eklenmesi nötralizasyon tamponu sonra (B) pH kağıdı renk göstergesi yeşil ve pH yaklaşık 8.0 olmalıdır.
Şekil 5:.. Cinsiyet özgü Astar Bilgi Dizi isimleri, Diziler ve astar tasarım aracı elde edilen amplikon uzunluğu bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: ZFX geni belirtilen ileri kromozom X ve Y (A) Konumu Domuz Sex özgü astar haritalanması ve ters primerler. (B) ileri Yeri ve SRY belirtilen primerler ters. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7:. Gün 30 embriyoların Domuz Sex-özgü genler PCR amplifikasyonu bilinen, pozitif kontroller ile SYBR DNA jel leke ile boyanmış% 2 TBE agaroz jeli, erkek ve dişi sembollerle belirtilmiştir. İki bant erkek ve kadın gibi tek bir bant halinde gösterdi. Kırmızı Yıldız üst bant SRY Y özgü primerler kaynaklanan (506 bp) PCR ürününe kıyasla çok hafif bir alt bant (400 bp) bir görünüme sahip oyuk olası numune kontaminasyonu göstermektedir. Kırmızı ok hiçbir şablon PCR negatif kontrol olduğunu belirtir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| PCR sexing | embriyo Sayısı | |
| ♀ | 185 | 53,60% |
| ♂ | 157 | 45.50% |
| bilinmeyen | 3 | % 0.90 |
| Toplam | 345 | % 100 |
Tablo 1: 345 Gün 30 Embriyolar arasında PCR cinsiyet tayini sonrasında erkek ve Bilinmeyen Kadın, yüzdesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Domuz embriyolar DNA seks yazarak ilgili mevcut protokollerin en erken evre öncesi implantasyon aşamasında 15,16 için uygundur. Biz başarıyla Geç gebelik sırasında domuz embriyo tarama için uygun bir protokol geliştirmiştir. Daha önceki çalışmalarda 6,18 embriyoların içindeki gelişim aşamalarında çalışmalara dayanarak, bu protokol, daha güvenli ve daha düşük maliyetli olarak kabul edilir.
Bu protokol, aynı zamanda, bir 96-yuvalı plaka içine bir DNA lizatlarının aktarılarak PCR kullanılarak cinsiyet tayini için örnek bir sayıda için uygundur. plak format, çok kanallı pipet kullanılarak PCR reaksiyonu için transfer DNA'sı lizat için 1 ul sağlayarak yüksek verimli tarama sağlar.
Ancak, prosedür ilgili çeşitli adımlar dikkatli yapılmalıdır. daha verimli bir şekilde modifiye edilmiş, 50 mM NaOH liziz yöntemini gerçekleştirmek için, tek tek, dondurulmuş embriyo ince ebatlı tozun topraklanmış olması gerekirönceden soğutulmuş bir (-80 ° C) havan ve tokmak kullanılarak. Şekil 1'de gösterildiği gibi nazikçe ve yavaşça, 15 ml tüp içine toz kazıma, kuru buz üzerinde embriyo tozu dökülmesini önlemek. Her numune çok başka embriyo örnek transfer eldiven üzerinde toz önlemek için tavsiye edilir sonra muayene eldivenleri değiştirilmesi.
Embriyo tozun uygun miktarda tadil edilmiş 50 mM NaOH lizis çözeltisine ilave edilecek Şekil 2B'de de gösterilmiştir. Embriyo tozun aşırı miktarda Şekil 2A'da gösterilmiştir ve bundan kaçınılmalıdır. Benzer şekilde, Şekil 2C, embriyo tozu miktarı aşağı işlemler için yeterli olabilir. Her numune için, embriyo toz ağırlığındaki mümkün olsa da yüz embriyolar üzerinde kapsayan geniş bir çalışmada embriyo seks tarama, bu pratik değildir.
DNA miktarı gözle görülür yapışkan g kontrol etmek için bir kürdan kullanılarak doğrulanmıştır edilebilirtozun, uygun miktarda bir önceki basamakta ilave edildi şüphelidir ise, Şekil 3'de gösterildiği gibi, Ooey benzeri bir madde.
Nötralizasyon solüsyonu doğru miktarda eklenmesi embriyo tozu parçalama sonra önem taşımaktadır. 4 sonra ve nötralizasyon solüsyonu eklemeden önce pH değişikliği göstermektedir. Bu adım, pH (8.0 civarında) hafif alkalin olduğundan emin ve en PCR reaksiyon tampon nedenle benzer hale önemlidir.
oligo primerlerin Özgünlük PCR esnasında DNA cinsiyet tayini doğruluğu için en önemli unsurdur. oligo primerlerin özgüllük NCBI BLASTN programı aracılığıyla teyit edilebilir. Tek bir konum kadınlarda her bir primer dizisi (Şekil 6A) için ZFX geninin 3 'kodlayıcı olmayan bölgesinde X kromozomu üzerinde tespit edilecektir. Benzer bir durum, Şekil 6B, (sadece SRY geninin kodlama bölgesinde, Y kromozomu üzerinde saptanır
Tüm adımlar dikkatli ve doğru devam zaman, Tablo 1'de gösterildiği gibi hiçbir seks kimlik nedeniyle hata oranı çok düşük (<% 1) olabilir. Bununla birlikte, bazı nadir durumda, iki farklı örnek DNA lizatları arasındaki çapraz kontaminasyon mevcuttur ve jel kırmızı bir yıldız (Şekil 7) ile gösterildiği gibi, PCR ile tespit edilebilir. Kadında çizgi bantlaşma modeli, bu tür erkek örnek ile çapraz bulaşma olarak yorumlanabilir.
Çok hafif daha düşük bir bandın gösterilmesi PCR için primer rekabet nedeniyle olası değildir. Bu durumda, SRY ilişkin daha küçük bir amplikon (400 bp) ZFX genine karşılık gelen daha yüksek bant daha hızlı daha fazla PCR ürünü oluşturur. Bu protokol, tek dezavantajı kadın ile bir erkek numunenin çapraz kontaminasyon belirlenmesidir. Bizim asıl amacımız kopya sayısının ölçümü her bir hedef gen için, küçük olmadığındankadın numuneden toz miktarı jel üzerinde görselleştirmek için kolay olmaz.
Burada sunulan bir DNA cinsiyet tayini protokolü geç gebelik esnasında embriyo cinsel tespit etmek için en ekonomik bir yöntem olup, sığır, keçi ve koyun gibi diğer büyük çiftlik hayvanlarına uygulanabilir. Ayrıca, benzer DNA cinsiyet tayini yöntemi dişi domuzlar, metabolik durum 18 ile ilişkili domuzlarda uygulanmıştır. DNA cinsiyet tayini kullanarak başka araştırma inceleme domuz 22 doğum sonrası gelişim prenatal programlama sırasında genomik baskı mekanizmasını incelemek için uygulanabilir. DNA PCR cinsiyet tayini kullanılarak hayvancılık uygulamaları geniş bir yelpazede, önceden cinsiyet seçimi yetiştirme programları ve beslenme ve bulaşıcı hastalıkların epigenetik etkileri mümkün değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar işbirliği ve aşağıdaki araştırma fonu ajansı mali katkılarını kabul etmek istiyorum: Alberta Hayvancılık ve Et Ajansı Ltd., Domuz CRC, Alberta domuz, Hypor A Hendrix Genetik Firma ve NSERC CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
References
- Seidel, G. E. Economics of selecting for sex: the most important genetic trait. Theriogenology. 59, 585-598 (2003).
- Gutiérrez-Adán, A., et al. Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development. Reprod. Domest. Anim. 41, Suppl 2. 54-62 (2006).
- Rosenfeld, C. S., Roberts, R. M. Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review. Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).
- Gorecki, M. T. Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758). Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).
- Chen, Z. Y., Dziuk, P. J. Influence of initial length of uterus per embryo and gestation stage on prenatal survival, development, and sex ratio in the pig. J. Anim. Sci. 71, 1895-1901 (1993).
- Vinsky, M. D., Novak, S., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Foxcroft, G. R. Nutritional restriction in lactating primiparous sows selectively affects female embryo survival and overall litter. Reprod. Fertil. Dev. 18, 347-355 (2006).
- Cassar, G., King, W. A., King, G. J. Influence of sex on early growth of pig conceptuses. J. Reprod. Fertil. 101, 317-320 (1994).
- Zudova, D., Rezacova, O., Kubickova, S., Rubes, J. Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 102, 179-183 (2003).
- Hornak, M., Oracova, E., Hulinska, P., Urbankova, L., Rubes, J. Aneuploidy detection in pigs using comparative genomic hybridization: from the oocytes to blastocysts. PLoS One. 7, (2012).
- Handyside, A. H., Pattinson, J. K., Penketh, R. J., Delhanty, J. D., Winston, R. M., Tuddenham, E. G. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet. 1, 347-349 (1989).
- Wilton, L. J., Shaw, J. M., Trounson, A. O. Successful single-cell biopsy and cryopreservation of preimplantation mouse embryos. Feri. Steril. 51, 513-517 (1989).
- Peura, J. M., Turunen, M., Janne, J. A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction. Theriogenology. 35, 547-555 (1991).
- Rao, K. B., Pawshe, C. H., Totey, S. M. Sex determination of in vitro developed buffalo (Buhalus buhalis.) embryos by DNA amplification. Mol. Reprod. Dev. 36, 291-296 (1993).
- Herr, C. M., Matthaei, K. I., Petrzak, U., Reed, K. C. A rapid Y-chromosome-detecting ovine embryo sexing assay. Theriogenology. 33, 245 (1990).
- Fajfar-Whetstone, C. J., LaneRayburn, A., Schook, L. B., Wheeler, M. B. Sex determination of porcine during preimplantation embryos via y-chromosome specific DNA sequences. Animal Biotechnology. 4, 183-193 (1993).
- Pomp, D., Good, B. A., Geisert, R. D., Corbin, C. J., Conley, A. J. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim. Sci. 73, 1408-1415 (1995).
- Aasen, E., Medrano, J. F. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Biotechnology (N Y). 8, 1279-1281 (1990).
- Oliver, G., et al. Restricted feed intake in lactating primiparous sows. II. Effects on subsequent litter sex ratio and embryonic gene expression. Reprod Fertil. Dev. 23, 899-911 (2011).
- Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R. L., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29, 52-54 (2000).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos. Biotechniques. 43, 610-614 (2007).
- Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts. Animal. 8, 293-299 (2014).
- Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L. Prenatal programming of postnatal development in the pig. Control of Pig Reproduction VIII. Rodriguez-Martinez, , Nottingham University Press. 212-213 (2009).
