Nøyaktig og Fenol Gratis DNA sexing av Dag 30 svinekjøtt embryoer ved PCR

Abstract

Forskning på prenatal programmering i grisen har vist at kjønn på utvikling av embryo eller foster kan påvirke utviklings utfallet. Derfor er det nødvendig muligheten til å bestemme et embryo er sex i mange eksperimenter spesielt om tidlig utvikling. Den foreliggende protokoll demonstrerer en billig, rask og ikke-toksiske fremstilling av gris genomisk DNA for bruk med PCR. Dag 30 embryo må humant samles i henhold til retningslinjer fastsatt av Institutional Animal politikk og velferdskomiteer for denne protokoll. Fremstillingen av hele embryoet for denne PCR-basert sexing teknikk innebærer ganske enkelt å slipe den frosne embryo til et fint pulver ved anvendelse av en pre-avkjølt morter. PCR-kvalitet DNA frigjøres fra en liten mengde av embryo pulver ved å bruke en varm inkubasjon i en alkalisk lyserings reagens. Deretter blir DNA-løsning blandet med nøytralisering buffer og anvendt direkte for PCR. To primerpar genereres til Detect spesifikk kjønn bestemmelse region av Y-kromosom (SRY) og ZFX region av X- kromosom med høy nøyaktighet og spesifisitet. Det samme protokollen kan brukes på andre langstrakte embryoer (dag 10 til dag 14) tidligere enn dag 30. I tillegg kan denne protokollen gjennomføres med 96-flommet plater når screening et stort antall embryoer, noe som gjør det mulig for automatisering og høy gjennomstrømming sex skrive.

Introduction

Den gris har blitt en grunnleggende forskning fag i utvikling, genetikk og ernæring i både menneskelige og husdyr sektorer. Potensialet av griser som biomedisinske modeller for human forskning kan tilskrives deres fysiologiske likheter. I husdyr, kan manipulering av kjønnsfordelingen forsterke virkningen av seleksjon og genetisk forbedringsprogrammer ^1. Sexing individuelle embryo er et grunnleggende verktøy som brukes i mange eksperimentelle undersøkelser inkludert men ikke begrenset til genotype, epigenetikk og X inaktivering av kjønnsdimorfisme under tidlig embryoutvikling ^2.

Studier på mus tyder på at mors kosthold og andre faktorer kan føre til kjønnsubalansen ^tre. I griser, årsaker til sex ratio ubalanse inkluderer faderlig rase ^4, livmor kapasitet ^5, og purka metabolske tilstand ^6. Siden forskjellene observert i embryoer og kull kan være påvirket av seg selvxual dimorphism, bør forskerne være oppmerksom på embryo sex og kjønnsfordelingen før trekke konklusjoner om deres forskning. Utviklingen av effektive verktøy og protokoller for sexing gris embryo på dag 30 av utbyggingen vil bli diskutert her.

Forskjellige metoder for sex typing har blitt utviklet for genetiske studier i modellorganismer og husdyr. Spesielt i husdyr, identifisere mannlige og kvinnelige tidlige embryoer er en svært vanlig praksis å forbedre genetisk seleksjon for avlsprogram. Tidlig embryo karyotypering i gris ved hjelp Giemsa ⁷ eller intens fluorescens ^8,9 teknikker har blitt brukt for sex skrive. Men disse fremgangsmåter er tidkrevende og ikke egnet for screening av et stort antall embryoer raskt og nøyaktig.

Den mest effektive sex skrive metoden er DNA-amplifikasjon ved anvendelse av en varmestabil DNA-polymerase og et par av primere. DNA sexing ved hjelp av PCR-metoden er mer spesifikk, rask og følsom, oare som krever en liten mengde av cellulære materialer. Den første PCR-basert embryo sexing ble utført på mennesker ^10, og senere i mus ^11, storfe ^12, bøffel ¹³ og sau ¹⁴ pre-implantasjon embryoer. I gris, ble den tidligste DNA-typing kjønn metode etablert for pre-implantation embryo via et enkelt par av Y-kromosom spesifikk DNA-primere ^15. Imidlertid var de mest vanlige PCR-primere for kjønnsbestemmelse valgt fra Y-kromosomet av mannlig spesifikk SRY gen ¹⁶ og den ikke-kjønn diskriminerende område av et sink-finger-genet lokalisert på både X- og Y-kromosom ^17. Senere har disse primere er anvendt for å bestemme kjønn på dag 30 embryoer i denne studien med forbedret spesifisitet av primerne for å detektere bare X- kromosomet til en sink-finger-genet.

Genomisk DNA fra svin pre-implantasjon embryo kan hentes ut ved å utsette et intakt blastocyst til buffer med proteinase K ¹⁶ eller ved å ta en biopsi av noen få celler fra den individuelle tidlig spalting embryoer ¹⁵ og ved hjelp av dem for direkte PCR. Men utgivelsen av DNA fra svin blod, hår, vev eller et stort Conceptus over noen få centimeter i størrelse er ikke effektivt gjøres ved hjelp av proteinase K-metoden. DNA ekstraksjonsmetoder for disse materialene er etablert ved hjelp av enten tidkrevende fenol / kloroform protokoller ⁶ eller dyrt kolonne basert kits ^18. For å unngå bruk av potensielt toksiske kjemikalier, er det en tendens til å utvikle billige, enkle og fenol-fri DNA-ekstraksjonsmetoder. Denne type av protokoll for isolering av PCR-kvalitet genomisk DNA fra mus ¹⁹ og sebrafisk ²⁰ vev har blitt etablert ved hjelp av varmt natriumhydroksyd og Tris (hotshot). Denne studien gir en protokoll for å få DNA med modifiserte hotshot og redesignet duplex primerpar for PCR sex skrive direkte fra cellelysater av Day 30 svin embryoer medhøy nøyaktighet.

Protocol

I samsvar med den kanadiske Rådet for dyrestell retningslinjer og med godkjenning av fakultetet Animal Policy and Welfare Committee - Oppdrett av University of Alberta, ble gravide purker avlivet av opplært staber på ca dag 30 av svangerskapet og embryoer ble samlet. Bruk eksamen hansker hele tiden under prosedyrene.

1. Prøvetaking og prøveoppbevaring

1. Avlive purke hjelp fange bolt fulgt av blodtapping. Bruk undersøkelseshansker for å samle den reproduktive traktater og embryoer fra hver avlives purke.
   Merk: Rapid innsamling av prøver og overføre embryoene tørris eller flytende nitrogen vil resultere i høyere kvalitet vev for andre molekylære verk som mikromatriser og qPCR.
2. Dissekere livmoren og forsiktig skille alle embryoer innenfor sine extraembryonic placenta membranene fra den underliggende livmorveggen ^21. Pass på at det ikke er mors vev forurensning.
3. Reledning lengde og vekt av alle levedyktige embryoer før frysing.
4. Samle hver enkelt embryo og umiddelbart pakk den opp i en aluminiumsfolie før snap frysing med flytende nitrogen.
5. Overfør de frosne embryoene fra flytende nitrogen direkte til en -80 ° C fryser.

2. Sliping Embryoet

1. Merke alle prøverørene (15 ml) med prøve ID er nødvendig for det antall prøver som skal analyseres.
2. Fyll termisk beholder med tørris til halvfull og sett den pre-merkede prøverør i tørris.
3. Bruk vinterhansker med et annet par av undersøkelseshansker på toppen for å overføre pre-kjølt mørtel og pestles fra -80 ° C fryser til tørris container.
4. Plasser den frosne embryo på innsiden av mørtel på tørris.
5. Hell tilstrekkelig flytende nitrogen for å dekke embryo og male den med pistill til et fint pulver.
6. Overfør embryoet pulveret til en pre-merket prøverør med en MICRospatula (figur 1) og plasser røret i en -80 ° C fryser.
7. Bruk en ren pre-kjølt morter for hvert embryo og endre eksamens hansker etter sliping hvert embryo for å unngå krysskontaminering mellom prøvene.

3. Genomisk DNA forberedelse på Modifisert Natriumhydroksid Method

1. Merk alle mikrosentrifugerør (1,5 ml) som er nødvendig for antallet prøver som skal analyseres.
2. Overfør prøverørene som inneholder embryo pulver fra -80 ° C fryser i en beholder med tørr is, før bruk.
3. Pipettere 180 ul 50 mM NaOH (natriumhydroksyd) i hvert forhåndsmerkede mikrosentrifugerør.
4. Slå på en inkubator og pre-varme til 95 ° C.
5. Bruk en tannpirker for å overføre den korrekte mengde av embryo pulver (ca. 5-10 mg) (figur 2) fra prøverøret i et på forhånd merket mikrosentrifugerør inneholdende 50 mM NaOH-oppløsning.
6. Trekk up den samme tannpirker langsomt for å visualisere DNA-lysatet som en klebrig, seig, hvit gjennomsiktig lignende stoff (figur 3).
7. Overfør mikrosentrifugerør med DNA lysat til den forvarmede inkubator ved 95 ° C i fem minutter. overføre Umiddelbart røret til en styrofoam boks fylt med is.
8. Tilsett 20 pl av 1 M Tris-HCl direkte inn i mikrosentrifugerør og bland det ved å banke lett på røret. Bruker et pH-papir for å sikre at pH-verdien er ca. 8,0 (figur 4) før sentrifugering.
   Merk: Når du arbeider med et stort antall prøve forberedelser, er det akseptabelt å tilfeldig plukke noen prøver å kontrollere pH.
9. Sentrifuger røret med DNA-løsningen ved 2000 x g i en mikrosentrifuge i to minutter ved romtemperatur for å fjerne uoppløste rester vev.
10. Overføre 150 ul av den øverste klare supernatanten til et nytt rør, eller 96-brønners plater.
    Merk: Den klare DNA lysat er klar til å bruke som en mal på PCR reaksjon og det er stabilt ved 4 ° C i to uker, eller den kan oppbevares ved -20 ° C i ett år.

4. Design Sex-spesifikke PCR primere

1. Skaff tiltredelses tall for svinekjøtt sex bestemme region Y (SRY) (NM_214452.3) og og sink finger protein X-linked (ZFX) gener (XM_005673501.1) fra NCBI nettstedet http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
2. Kopier og lim inn disse NCBI deponeringsnummer til en online primer designverktøy.
   Merk: Den beste primere informasjon, inkludert lengde, Tm og GC% samt PCR produkt størrelse (bp) vil bli generert på dataskjermen (Figur 5).
3. Valider spesifisiteten av disse primere ved bruk av nukleotid-Blast program (Blastn) mot strømmen fra svin genomiske databasen 104 for å sikre at disse sekvensene bare lokalisert på kromosom X og Y for henholdsvis SRY og ZFX (figur 6).

5. Genomisk DNA PCR direkte fra DNA Lysates

1. Brukkun 1 ul DNA-lysatet som et templat for en 15 pl PCR-reaksjon.
   Merk: En high throughput screening-metode for 96-brønners plater PCR kan utføres på lignende måte ved bruk av en multikanal pipette.
2. Gjør følgende for den første PCR: forberede en PCR rør for ingen mal negativ kontroll og to ekstra rør for positive kontroller ved å legge til en fil (0,5 ng) kommersielt innhentet kjent sex svin genomisk DNA. Senere har en prøve fra den siste vellykkede sexing analyse som en positiv kontroll og kjøre sammen med den nye PCR reaksjon for kjønnsbestemmelse.
3. Bruk noen Hotstart klar mix PCR enzymet og forberede en mester blanding ved å legge grunning og nuklease fritt vann avhengig av det totale antall PCR reaksjoner. Tilsett 1 pl av DNA-lysat til en pre-eksisterende PCR-rør med 14 ul av PCR masterblanding. Legg primere slik at sluttkonsentrasjonen av primerne fra to kjønnsspesifikke gener er 0,3 uM i totalt 15 pl PCR-reaction.
4. Still opp den følgende PCR-programmet i en termosykler: 95 ° C i 3 minutter, 35 sykluser hver med en 20 sek smeltetrinnet 98 ° C, etterfulgt av en 15 sek glødetrinn ved 65 ° C, etterfulgt av en 15 sek forlengelsestrinn ved 72 ° C. I et siste trinn, inkubere reaksjonene i 1 min ved 72 ° C og fortsette å inkubere ved 4 ° C inntil fjerning av PCR-rør for gelelektroforese verifisering for å bestemme kjønn.
   Merk: PCR betingelser og optimalisering er i henhold til bruksanvisningen til PCR kit nevnt i Materials tabell.
5. Legg riktig mengde giftfri drivhus fluorescerende SYBR DNA gel stain når du forbereder en 2% TBE agarosegel.
   Merk: Etidiumbromid kan erstattes for drivhus fluorescerende flekk hvis det ikke er tilgjengelig.
6. Tilsett 1,5 mL av laste fargestoff (10x) inn i PCR-rør og bland godt ved pipettering av PCR-reaksjonsbuffer opp-og-ned.
7. Last 10 ul av prøven inn i brønnen og run agarosegelen med passende spenningsinnstillinger (små gel-apparat ved 100 V, 96-brønners gel-apparat ved 150 V inntil farvebåndet går halvveis gjennom gelen).
8. Observer og juster band intensiteter under fluorescerende lys innstillingen ved hjelp av en laserskanner og ta et bilde av gelen. Merk: Common gel Kameraer kan erstatte den etidiumbromidgel.
9. Bestem sex av svin embryoer ved å identifisere fostre med ett band som en kvinnelig og to band som en mannlig (figur 7).

Representative Results

Et representativt resultat av kjønnsbestemmelse fra 345 DNA-lysater screening ved PCR er vist i figur 7 og oppsummert i tabell 1.

Som det kan ses på figur 7, er primerne glødetemperaturen ved 65 ° C er den optimale tilstand i denne PCR-protokollen generere lik intensitet og betinget amplikon størrelser (figur 5) mellom forskjellige prøver.

To amplifiserte produkter av SRY (400 bp) og ZFX (506 bp) er vist i gelen bilde (figur 7). Mann embryoer viste to DNA-fragmenter med riktig størrelse på den øvre (400 bp) og lavere (506 bp) band. Intensiteten av disse to båndene ble vist å være lik i de fleste mannlige individer. Alle de kvinnelige embryoene viste bare et enkelt DNA-fragment som tilsvarer den ZFX genet ligger iX-kromosom.

DNA-lysatene oppnådd fra den modifiserte 50 mM NaOH kan anvendes direkte for PCR med en høy suksessrate og nøyaktighet. DNA lysatene viste ingen PCR reaksjon hemming etter screening 345 embryoer. Bare tre personer var ikke sexed og andelen av kvinnelige fostre var noe høyere enn menn (tabell 1).

Figur 1:. Embryo Powder Transfer Overføre embryo pulver til en 15 ml tube.

Figur 2: Samle og overføre Embryo Powder med en tannpirker (A) En overdreven mengde embryo pulver man følger til tannpirker.. (B) Riktig mengdeembryo pulver man følger den tannpirker som skal overføres til den alkaliske lyserings reagensoppløsningen. (C) For lite embryo pulver holde tannpirker.

Figur 3:. DNA Visualisering Technique sakte trekke opp tannpirker, etter å ha lagt fosteret pulver, for å avgjøre om fosteret DNA er oppløst som et klebrig gooey hvit gjennomsiktig-lignende stoff.

Fig. 4: pH Bekreftelse (A) pH-verdien av natriumhydroksyd (alkalisk lysis-reagens) oppløsning er 12,0. (B) Etter tilsetning nøytralisering buffer til lysis buffer, farge indikasjon på pH-papir er grønn og pH-verdien bør være rundt 8,0.

Figur 5:.. Sex-spesifikke Primer Informasjon Sequence navn, sekvenser og fragment lengde hentet fra primer designverktøy Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: Kartlegging av Svinekjøtt Sex-spesifikke primere på kromosom X og Y. (A) Plassering av forover og reversert primere som er angitt på ZFX genet. (B) Plassering av fremover og bakover, primere som er angitt på SRY-genet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7:. PCR Amplification svine Sex-spesifikke gener fra dag 30 Embryoet 2% TBE agarosegel farget med SYBR DNA gel flekken med de kjente positive kontroller er angitt med mannlige og kvinnelige symboler. To band angitt som hanner og en eneste band som kvinner. Rød stjerne antydet den mulige kontaminering av prøver i brønnen med utseendet av en meget svak nedre bånd (400 bp) sammenlignet med øvre bånd (506 bp) PCR-produktet forårsaket av SRY Y-spesifikke primere. Rød pil indikerer ingen mal PCR negativ kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

sexing PCR	embryo Count
♀	185	53.60%
♂	157	45.50%
Ukjent	3	0,90%
Total	345	100%

Tabell 1: Andel Kvinne, Mann og ukjente etter PCR sexing blant 345 Dag 30 embryoer.

Discussion

De fleste av de eksisterende protokoller svin embryoer DNA sex typing er bare egnet for tidlig pre-implantasjon scenen ^15,16. Vi har utviklet en protokoll egnet for svin embryo screening sent i svangerskapet. Basert på studier med liknende utviklingsstadier av embryoer fra tidligere studier ^6,18, er den foreliggende protokoll anses å være sikrere og lave kostnader.

Denne protokollen er også egnet for et stort antall prøver for sex skrive ved hjelp av PCR ved overføring av DNA-lysater inn i en 96-brønns plate. Platen formatet kan high-throughput screening ved å tillate overføring 1 ul DNA-lysat for PCR-reaksjon ved anvendelse av en multikanal pipette.

Imidlertid bør flere trinn som er involvert i fremgangsmåten gjøres forsiktig. For å utføre den modifiserte 50 mM NaOH lyseringsmetoden mer effektiv, har individuelt frosne embryo for å være jordet til fint pulverved hjelp av en på forhånd avkjølt (-80 ° C) morter. Unngår å søle embryo pulver på tørris, ved langsomt og forsiktig å skrape pulveret i 15 ml rør, som vist i figur 1. Endring av undersøkelseshansker etter at hver prøve er sterkt anbefalt å unngå pulver på hansken overføring til en annen embryo prøven.

Den passende mengde av embryo pulver som skal tilsettes til den modifiserte 50 mM NaOH lyseringsløsning er vist i figur 2B. En overdreven mengde av embryoet pulver er vist i figur 2A og bør unngås. Likeledes, i figur 2C, kan mengden av embryoet pulver være utilstrekkelig for nedstrøms prosedyrer. Selv veiing embryo pulver for hver prøve er mulig, er det ikke praktisk når screening embryo sex i stor skala studie som involverte over hundre embryoer.

Mengden av DNA kan bli synlig kontrolleres ved hjelp av en tannpirker for å se etter den klebrige gooey-lignende stoff, som vist i figur 3, dersom det er tvilsomt om den passende mengde av pulver ble tilsatt i det foregående trinn.

Legge riktig mengde nøytralisering løsning er viktig etter lyse embryoet pulver. Figur 4 viser pH-endring etter og før du legger nøytralisering løsning. Dette trinnet er viktig å sørge for at pH er svakt alkalisk (rundt 8,0) og derfor lik de fleste PCR-reaksjons buffere.

Spesifisitet av oligo primerne er det viktigste element for nøyaktigheten av DNA sexing i løpet av PCR. Spesifisiteten til oligo primerne kan bekreftes gjennom NCBI Blastn program. En enkelt sted vil bli detektert på X-kromosomet i 3'-ikke-kodende region av genet ZFX for hver primer sekvens (figur 6A) for kvinner. En lignende situasjon blir detektert bare i y-kromosom i den kodende region av SRY-genet (figur 6B

Feilrate på grunn av ingen sex identifikasjon kan være meget lav (<1%) som vist i tabell 1, når alle trinn gå forsiktig og på riktig måte. Men i noen sjeldne tilfeller, er krysskontaminering mellom DNA lysatene av to forskjellige prøver mulig og kan påvises ved PCR som indikert med en rød stjerne i gel (Figur 7). Denne typen banding mønster i hunn kan tolkes som krysskontaminering med en mannlig prøven.

Det er usannsynlig at utseendet av en meget svak nedre bånd er på grunn av den konkurranse primer for PCR-reagenser. I dette tilfellet er den mindre fragment (400 bp) som er relatert til den SRY genet vil generere mer PCR-produkt raskere enn den høyere bånd som tilsvarer den ZFX genet. I denne protokollen, er en ulempe fastsettelse av smitte av en mannlig prøve med en kvinne. Fordi vårt hovedmål er ikke kvantifisering av kopiantall for hvert mål gen, en litenMengden av pulver fra den kvinnelige prøven ville ikke være lett å visualisere på gelen.

DNA sexing protokollen presenteres her er den mest kostnadseffektive måten å identifisere embryo sex sent i svangerskapet og kan brukes til andre store husdyr dyr som storfe, geit og sau. Også har lik DNA sexing metode er anvendt griser knyttet til purker metabolske tilstand ^18. En annen forskning etterforskning ved hjelp av DNA sexing kan brukes til å studere genomisk imprinting mekanismen under prenatal programmering av postnatal utvikling hos grisen ^22. Et bredt spekter av applikasjoner i husdyr som bruker DNA PCR sexing er mulig for eksempel pre-sex utvalg avlsarbeid, og epigenetiske effekter av ernæring og infeksjonssykdommer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used - quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.