Abstract
돼지의 태아 프로그래밍에 대한 연구는 배아 또는 태아의 성별이 발달 결과에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 배아의 성을 확인하는 능력은 특히 초기 개발에 대한 많은 실험이 필요하다. 본 프로토콜은 PCR에 사용할 돼지 게놈 DNA의 저렴하고 신속하고 비 독성 제제를 보여준다. 하루 30 배아는 인도적 본 프로토콜에 대한 기관 동물 정책 및 복지위원회가 설정 한 가이드 라인에 따라 수집해야합니다. 이 PCR 기반 sexing 기술에 대한 전체 배아의 제조는 단순히 미리 냉각 막자 사발을 사용하여 미세한 분말로 분쇄 냉동 배아를 포함한다. PCR 품질 DNA는 알칼리 용해 시약 뜨거운 인큐베이션함으로써 배아 분말 소량 방출된다. 그 다음, DNA 용액을 중화 완충액과 혼합하고 PCR에 직접 사용했다. 두 프라이머 쌍은 detec하기 위해 생성된다높은 정밀도와 특이 X- 염색체의 Y- 염색체 (SRY)와 ZFX 영역의 영역을 결정 t 특정 성. 동일한 프로토콜 일 이전 다른 신장 배아 (주 14 주 10)에 적용 할 수있다 (30)의 자동화 및 높은 것이 가능하게 배아 다수 선별 경우 이러한 프로토콜은 96 솟아 플레이트로 수행 될 수있다 처리량 섹스 입력합니다.
Introduction
돼지는 인간과 가축 부문 모두에서 개발, 유전학과 영양의 기초 연구 대상이되고있다. 인간에 대한 생물 의학 연구 모델로 돼지의 전위 생리적 유사성에 기인 할 수있다. 가축, 성비의 조작 선택 유전자 개선 프로그램 (1)의 효과를 향상시킬 수있다. 개별 배아를 Sexing하는 것은 포함하지만 초기 배아 개발 2시 유전자형, 후성 유전학 성적 이형 태성의 X 불 활성화에 국한되지 많은 실험 연구에 사용되는 기본 도구입니다.
생쥐의 연구는 산모의식이 요법과 다른 요인은 성별 불균형 3 발생할 수 있습니다 것이 좋습니다. 돼지에서 성비 불균형의 원인은 아버지의 품종 4, 자궁 용량 5, 모돈의 대사 상태 (6)을 포함한다. 배아 및 새끼 관찰 차이 자체에 의해 영향을받을 수 있기 때문에xual의 이형 태성은, 연구자들은 자신의 연구에 대한 결론을 도출하기 전에 배아 섹스와 섹스 비율을 알고 있어야합니다. 개발의 날 (30)에 돼지 배아를 sexing을위한 효율적인 툴과 프로토콜의 개발은 여기에서 논의 될 것이다.
섹스 입력의 다양한 방법 모델 생물과 가축의 유전 연구를 위해 개발되었습니다. 특히 가축에, 남성과 여성의 초기 배아를 식별하는 육종 프로그램에 대한 유전 적 선택을 향상시키기 위해 매우 일반적이다. 김사 7 강렬한 형광 8,9 기술을 사용하여 돼지의 핵형 초기 배아는 성 입력을 위해 사용되어왔다. 그러나, 이들 방법은 시간 소모적이고 신속하고 정확하게 다수의 배아 스크리닝에 적합하지 않다.
가장 효과적인 성 입력 방법은 열 안정성 DNA 폴리머 라제 및 프라이머 쌍을 사용하여 DNA의 증폭이다. PCR 법에 의한 DNA의 sexing는 오보다, 특정 신속하고 민감할수 있답니다 다공질 재료의 미세한 양을 요구. 첫 번째 PCR 기반의 배아 sexing 인간 (10)에서 수행하고, 나중에 마우스 (11), 소 (12), 버팔로 (13)와 양 (14) 착상 전 배아에서했다. 돼지에서 초기 DNA 섹스 입력 방법은 Y 염색체 특이 DNA 프라이머 (15)의 한 쌍을 통해 착상 전 배아를 위해 설립되었다. 그러나 성 결정을위한 가장 일반적인 PCR 프라이머 말레 특정 SRY 유전자 (16) 및 X 및 Y 염색체 17 모두에 위치 징크 핑거 유전자의 비 성 차별적 영역의 Y 염색체로부터 선택 하였다. 이어서,이 프라이머는 아연 핑거 유전자의 X- 염색체를 검출하는 프라이머의 향상된 특이성이 연구에서 30 일 된 배아의 성을 확인하기 위해 적용되어왔다.
돼지의 착상 전 배아에서 게놈 DNA를 proteinas와 버퍼링 그대로 배반포를 노출하여 추출 할 수있다전자 K (16) 또는 개별 초기 분열에서 몇 세포의 생검을 고려하여 15 배아 직접 PCR을 위해 그들을 사용. 그러나 돼지의 혈액, 머리카락, 조직 또는 크기가 몇 센티미터 이상의 큰 수태에서 DNA의 방출을 효과적으로 테 K 방법을 사용하여 수행되지 않습니다. 이들 물질에 대한 DNA 추출 방법은 시간이 많이 걸리고, 페놀 / 클로로포름 프로토콜 6 비싼 열 기반 키트 (18)를 사용하여 설정 하였다. 잠재적 독성 화학 물질의 사용을 피하기 위해, 저렴하고 쉬운 페놀없는 DNA 추출 방법을 개발하는 경향이있다. 마우스 (19) 및 (20) 지브라 피쉬 조직으로부터 PCR 품질 게놈 DNA의 분리를위한 프로토콜이 이러한 유형의 핫 수산화 나트륨 및 트리스 (유능한)를 사용하여 구축되었다. 이 연구는 PCR 섹스인가요 수정 및 재 설계 이중 프라이머 쌍은 일의 세포 용 해물 (30) 돼지 배아에 직접 입력하여 DNA를 얻을 수있는 프로토콜을 제공높은 정확도.
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Protocol
동물 관리 지침에 캐나다 협의회와 학부 동물 정책 복지위원회의 승인에 따라 - 알버타 대학의 가축, 임신 모돈은 임신과 태아의 (30)는 수집 된 약의 날 훈련 된 직원에 의해 안락사시켰다. 과정에서 항상 시험 장갑을 사용합니다.
1. 샘플 수집 및 샘플 보관
- 방혈 다음 고정 볼트를 사용하여 모돈을 안락사. 각 안락사 모돈에서 생식 책자와 배아를 수집하기 위해 시험 장갑을 착용 할 것.
참고 : 샘플 및 이식란의 신속한 수집을 얼음 또는 액체 질소는 마이크로 어레이 및 qPCR에 다른 분자 작품에 대한 높은 품질의 조직에서 발생합니다 건조. - 자궁을 해부 부드럽게 기본 자궁 벽 (21)로부터 자신의 배외 (extraembryonic) 태반 막 내의 모든 배아를 분리합니다. 모성 조직 오염이없는 것을 확인합니다.
- 레냉동하기 전에 모든 가능한 배아의 코드 길이와 무게.
- 각각의 배아를 수집하고 즉시 스냅 액체 질소로 냉동 전에 알루미늄 호일을 마무리.
- 직접 -80 ° C 냉장고에 액체 질소에서 냉동 배아를 전송합니다.
2. 연삭 배아
- 샘플 수에 필요한 샘플 ID 모든 샘플 튜브 (15 ml)에 라벨하는 분석한다.
- 반 전체에 드라이 아이스와 열 컨테이너를 입력하고 드라이 아이스에 미리 라벨링 샘플 튜브를 삽입합니다.
- 얼음 컨테이너를 건조 C의 냉동고 -80 °에서 미리 냉장 박격포와 방앗 공이를 전송하기 위해 상단에 시험 장갑 또 한 쌍의 겨울 장갑을 착용 할 것.
- 드라이 아이스에 박격포 내부의 냉동 배아를 놓습니다.
- 배아를 커버하고 미세 분말로 유봉으로 갈아 충분한 액체 질소를 따르십시오.
- MICR으로 미리 라벨링 샘플 튜브 배아 분말 전송ospatula (그림 1) 및 -80 ° C의 냉동고에 튜브를 배치합니다.
- 각각의 배아에 대한 깨끗한 사전 냉장 박격포와 유 봉을 사용하여 샘플 간의 교차 오염을 방지하기 위해 각 배아를 분쇄 한 후 시험 장갑을 변경합니다.
3. 게놈 DNA 준비 수산화 나트륨 방법 수정 사용
- 샘플 수에 필요한 모든 라벨 마이크로 원심 튜브 (1.5 ml)을 분석한다.
- 배아로부터 분말을 함유하는 샘플 튜브를 전송 -80 ° C에 냉동 컨테이너에 드라이 아이스로 앞서 개시한다.
- 각각의 미리 라벨링 된 마이크로 원심 튜브에 50 밀리미터의 NaOH (수산화 나트륨)을 180 μL 피펫.
- 95 ° C에 인큐베이터 및 예열을 켭니다.
- 50 mM의 수산화 나트륨 용액을 함유하는 미리 라벨링 microcentrifuge 관으로 샘플 관으로부터 배아 분말의 정확한 양 (약 5 ~ 10 mg)를 (도 2) 전송 이쑤시개를 사용한다.
- 유 당겨페이지 같은 이쑤시개 천천히 끈적 끈적 끈적한 흰색 투명 같은 물질 (그림 3)과 같이 DNA 용 해물을 시각화합니다.
- 5 분 동안 95 ℃에서 예열 된 인큐베이터 DNA 해물과 마이크로 원심 튜브에 옮긴다. 즉시 얼음으로 가득 스티로폼 상자에 튜브를 전송합니다.
- 직접 microcentrifuge 관에 1 M 트리스 - 염산 20 μl를 추가하고 부드럽게 튜브를 도청하여 섞는다. pH가 원심 분리에 앞서 약 8.0 (그림 4) 보장하기 위해 산도 용지를 사용하십시오.
주의 : 샘플 제제의 다수를 처리 할 때, 랜덤 pH를 확인하는 몇몇 시료를 선택하는 것도 수용 가능하다. - 불용 조직 파편을 제거하기 위해 실온에서 2 분 동안 미세 원심 2,000 XG에서 DNA 해물과 튜브를 원심 분리기.
- 전송 새로운 튜브로 가기 맑은 상층 액 150 ㎕를 96 웰 플레이트.
참고 : 명확한 DNA 용 해물이 PC에서 템플릿으로 사용할 준비가R 반응하고 2 주 동안 39 ° C에서 안정하다거나 해 -20 ° C에 보관 될 수있다.
4. 디자인 성 특정 PCR 프라이머
- NCBI 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에서 돼지 섹스 결정 지역 Y (SRY)에 대한 가입 번호 (NM_214452.3) 및 아연 손가락 단백질 X-링크 (ZFX) 유전자 (XM_005673501.1)을 구합니다 /.
- 복사 및 온라인 프라이머 디자인 도구 이러한 NCBI의 가입 번호를 붙여 넣습니다.
주 : 길이로 Tm GC %의뿐만 아니라 PCR 생성물 크기 (BP) 컴퓨터 스크린 상에 생성된다 (도 5)을 포함하여 가장 프라이머 정보. - 이 시퀀스 만 각각 SRY 및 ZFX (그림 6)에 대한 X와 Y 염색체에있는 보장하기 위해 현재 돼지 게놈 데이터베이스 (104)에 대해 염기 폭발 프로그램 (BLASTN)를 사용하여 이러한 프라이머의 특이성을 확인합니다.
직접 DNA 해물 5. 게놈 DNA PCR
- 용도15 ㎕의 PCR 반응을위한 주형으로서 DNA 파쇄물의 1 μL.
참고 : 96 웰 PCR 플레이트에 대한 고 처리량 스크리닝 방법은 멀티 채널 피펫을 사용하여 유사한 방식으로 수행 될 수있다. - 단지 첫 번째 PCR을 위해 다음을 수행하십시오 시판 알려진 섹스 돼지 게놈 DNA 1 μL (0.5 NG)를 추가하여 더 템플릿 음성 대조군과 양성 대조군을위한 두 개의 추가 튜브에 대해 하나의 PCR 튜브를 준비합니다. 그 후, 양성 대조군으로 성공적인 마지막 sexing 분석에서 샘플을 포함 성 결정을위한 새로운 PCR 반응과 함께 실행.
- 모든 핫 스타트 준비 믹스 PCR 효소를 사용하여 프라이머를 첨가하여 마스터 믹스를 제조 및 PCR 반응의 총 수에 따라 자유로운 물 클레아. PCR 마스터 믹스를 14 μL로 기존의 PCR 튜브에 DNA 용해 액 1 μl를 추가한다. 프라이머를 추가하여 두 성별 특정 유전자의 프라이머를 최종 농도 15 μL의 PCR (R)의 합계는 0.3 μM임을eaction.
- 열 순환기 다음 PCR 프로그램을 설정 : 3 분, 95 ° C 35 사이클 15 초 신장 단계 다음 65 ℃에서 15 초간 어닐링 단계 다음 20 초 용융 단계 98 ° C, 각각의 72 ° C에서. 최종 단계에서, 72 ℃에서 1 분 동안 반응을 부화 성을 결정하는 전기 영동 검증 PCR 튜브를 제거 할 때까지 4 ℃에서 배양을 계속.
참고 : PCR 조건과 최적화 재료 표에 언급 된 PCR 키트의 설명서에 따라 있습니다. - 2 % TBE 아가 로스 젤을 준비 할 때 비 독성 녹색 형광 SYBR DNA 젤 얼룩의 적절한 금액을 추가합니다.
참고 : 사용할 수없는 경우 에티 디움 브로마이드가 녹색 형광 얼룩 대체 할 수 있습니다. - PCR 튜브에 로딩 염료 (10 배)의 1.5 μl를 추가하고, PCR 반응 버퍼 상하 피펫 팅하여 잘 섞는다.
- 잘 연구에 시료의 부하 10 μL유엔 적절한 전압 설정을 사용하여 아가 로스 젤 (염료 밴드까지 100 V에서 작은 젤 장치, 150 V에서 96 웰 젤 장치는 젤을 통해 절반 방법을 실행).
- 관찰 및 레이저 스캐너를 사용하여 형광 설정하에 밴드 강도를 조정하고, 겔의 이미지를 캡처. 주 : 일반 겔 메이져는 에티 디움 브로마이드 젤 치환 될 수있다.
- 여성으로 하나의 밴드와 남성과 같은 두 개의 밴드 (그림 7)와 배아를 식별하여 돼지 태아의 성별을 결정합니다.
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Representative Results
PCR에 의한 DNA 345 스크리닝 용 해물로부터 성 결정의 대표적인 결과가도 7에 도시되고 표 1에 요약 하였다.
도 7에서 알 수있는 바와 같이, 65 ℃에서 프라이머의 어닐링 온도가 다른 시료 중이 PCR 프로토콜에 유사한 강도와 프리디 케이드 앰플 리콘 크기를 생성 (도 5)의 최적의 조건이다.
SRY (400 BP)와 ZFX (506 BP)의 두 증폭 된 제품은 젤 사진 (그림 7)에 표시됩니다. 남성 배아는 상부 (400 BP)의 정확한 크기와 하부 (506 bp의) 밴드와 함께 두 개의 DNA 단편을 보여 주었다. 두 밴드의 강도는 가장 남성 개인 동등한 것으로 나타났다. 모든 암 배아에만 위치하고 ZFX 유전자에 대응하는 하나의 DNA 단편을 보였다X 염색체.
변형의 50 mM NaOH를 얻은 DNA 해물 높은 성공률 정밀도 PCR에 직접 사용될 수있다. DNA 용 해물은 345 배아를 선별 한 후 모든 PCR 반응 억제를 보이지 않았다. 단지 세 개인 거세 없었고 여성 배아의 비율은 남자 (표 1)보다 약간 높았다.
그림 1 :. 배아 분말 전송 15 ML 튜브에 배아 분말을 전송.
그림 2 : 수집 및 이쑤시개로 배아 분말 전송 (A) 이쑤시개에 배아 분말 부착의 과도한 양의.. (B)의 정확한 양은이쑤시개에 부착 배아 분말 알칼리 용해 시약 용액에 전송한다. (C) 이쑤시개에 부착 배아 분말의 양이 불충분.
그림 3 :. DNA의 시각화 기술은 천천히 배아의 DNA가 끈적 끈적 끈적한 흰색 투명 같은 물질로 용해 된 경우 결정하기 위해, 배아 분말을 추가 한 후, 이쑤시개를 잡아 당깁니다.
도 4 :. pH를 확인 수산화 나트륨 (알칼리 용해 시약) 용액 (A)의 pH는 12.0이다. 용해 완충액을 첨가 한 후, 중화 완충액 (B)는 pH가 용지의 색 표시가 녹색이고 pH는 약 8.0이어야한다.
그림 5 :.. 성별 특정 뇌관 정보 시퀀스 이름 시퀀스 및 프라이머 디자인 도구에서 얻은 앰플 리콘 길이 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : ZFX 유전자에 지정된 앞으로의 염색체 X와 Y (A) 위치에 돼지 섹스 특정 프라이머의 매핑과 반전 프라이머. (B) 전방의 위치와 SRY 유전자에 지정 프라이머를 반전. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 :. 날 30 배아에서 돼지 섹스 특정 유전자의 PCR 증폭 알려진 긍정적 인 컨트롤 SYBR의 DNA 젤 얼룩 염색 2 % TBE 아가로 오스 겔은 남성과 여성의 기호로 표시됩니다. 두 밴드는 남성과 여성으로 하나의 밴드로 표시. 레드 스타 상위 대역 SRY Y 특이 적 프라이머에 의한 (506 bp의) PCR 제품에 비해 매우 희미한 낮은 대역 (400 BP)의 모양에 잘 가능한 샘플 오염을 지적했다. 빨간색 화살표가없는 템플릿 PCR 음성 대조군을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| PCR을 Sexing | 배아 카운트 | |
| ♀ | (185) | 53.60 % |
| ♂ | 157 | 45.50 % |
| 알 수 없는 | 삼 | 0.90 % |
| 합계 | (345) | 100 % |
표 1 : 345 일 30 배아 중 PCR Sexing 후 남성과 알 수없는 여성의 비율입니다.
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Discussion
돼지 배아의 DNA 섹스 입력과 관련된 기존 프로토콜의 대부분은 초기 착상 전 단계 (15, 16)에만 적합하다. 우리는 성공적으로 임신 후기 돼지 배아 선별에 적합한 프로토콜을 개발했습니다. 이전 연구 6,18 배아의 발달 단계와 유사한 연구에 근거하여, 본 프로토콜은 안전하고 저비용으로되는 것으로 간주된다.
이 프로토콜은 또한 96- 웰 플레이트에 DNA 해물로 전송하여 PCR을 이용하여 성별에 대한 입력 샘플들의 다수 적합하다. 플레이트 포맷은 멀티 채널 피펫을 사용하여 PCR 반응을위한 DNA를 전사 파쇄물 1 μl를 허용함으로써 높은 처리량 스크리닝 할 수있다.
그러나, 절차에 관련된 여러 단계를주의 깊게 수행해야합니다. 보다 효율적으로 변성의 50 mM NaOH를 용해 방법을 수행하기 위해 개별적으로 냉동 배아 미세 분말로 접지되어야사전 냉장 (-80 ° C) 박격포와 유 봉을 사용. 그림 1과 같이 부드럽게 천천히, 15 ML 튜브에 분말을 긁어에 의해, 드라이 아이스에 배아 분말을 유출하지 마십시오. 각각의 샘플이 매우 다른 배아 샘플로 전송 장갑 분말을 방지하는 것이 좋습니다 후 시험 장갑을 변경.
배아 분말을 적당한 양의 50 mM NaOH를 수정 용해 액에 첨가 할 수는도 2b에 도시되어있다. 배아 분말의 과잉은도 2a에 제공된다 피해야한다. 마찬가지로,도 2c에 배아 분말의 양은 하류 절차에 충분하지 않을 수 없었다. 각 샘플에 대해 배아 분말을 칭량하는 것이 가능하지만 백 배아를 통해 관련된 대규모 연구에 배아 성을 스크리닝 할 때 실용적이지 않다.
DNA의 양이 눈에 띄게 스티커 g를 확인하기 위해 이쑤시개를 사용하여 확인 할 수있다이 분말을 적당량 이전 단계에서 추가되었는지 의심스러운 경우,도 3에 도시 된 바와 같이 ooey 같은 물질.
중화 용액의 적당량을 첨가하여 배아 분말 용균 후 중요하다. (4)이 후, 중화 용액을 첨가하기 전에 pH 변화를 나타낸다. 이 단계는 pH가 (8.0 주위) 약 알칼리성이 있는지 대부분의 PCR 반응 버퍼에 따라서 유사한 것이 중요하다.
올리고 프라이머 특이성 DNA의 PCR 동안 sexing의 정확도에있어서 가장 중요한 원소이다. 올리고 프라이머 특이성 NCBI BLASTN 프로그램을 통해 확인할 수있다. 하나의 위치는 여성에 대한 각각의 프라이머 서열 (도 6A)에 대한 ZFX 유전자의 3 '비 코딩 영역의 X 염색체에서 발견됩니다. 유사한 상황은도 6B (에만 SRY 유전자의 코딩 영역에서 Y 염색체 검출
모든 단계에 신중하고 정확하게 수행 할 때, 표 1에 나타낸 바와 같이 아니 섹스 식별 인한 오류율이 매우 낮은 (<1 %) 일 수있다. 그러나, 일부 드문 경우에, 두 개의 다른 샘플의 DNA 해물과 교차 오염을 가능 겔 레드 스타 (도 7)에 표시된 바와 같이 PCR에 의해 검출 될 수있다. 여성의 줄무늬 패턴이 유형 남성 샘플 교차 오염으로 해석 될 수있다.
매우 희미한 밴드 하부의 모양이 PCR 시약 용 프라이머의 경쟁에 기인하는 것이 어렵다. 이 경우 SRY 유전자에 관련된 작은 앰플 리콘 (400 염기쌍)은 ZFX 유전자에 대응하는 상위 대역보다 더 빠른 PCR 생성물을 생성 할 것이다. 이 프로토콜에서는 하나의 단점은 여성과 남성 샘플의 교차 오염의 결정이다. 우리의 주요 목표는 카피 수의 정량은 각각의 타겟 유전자, 작은 아니므여성 샘플에서 분말의 양이 젤에 시각화하기 쉽지 않을 것이다.
여기에 제시된 DNA의 sexing 프로토콜 임신 후기 배아 성을 확인하기위한 가장 비용 효율적인 방법이며, 소, 염소 및 양으로 다른 많은 가축 동물에 적용될 수있다. 또한, 유사한 DNA의 sexing 방법은 모돈의 대사 상태 (18)에 관련된 돼지에 적용되었습니다. DNA의 sexing을 사용하여 다른 연구 조사 돼지 22 산전 산후 개발 프로그래밍 동안 유전체 각인 기법을 연구하기 위해 적용될 수있다. DNA PCR의 sexing을 사용하여 가축의 응용 프로그램의 넓은 범위는 사전 성별 선택 육종 프로그램, 영양 및 감염성 질환의 후생 유전 학적 효과로 가능하다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 협력과 다음의 연구 자금 지원 기관의 재정 지원을 인정하고 싶습니다 : 앨버타 가축 및 육류 기관 (주), 돼지 고기 CRC, 앨버타 돼지 고기, Hypor 헨드릭스 유전학 회사와 NSERC CRSNG합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
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