Summary
يصف هذا البروتوكول رواية وكفاءة طريقة لبدء استثابي بسرعة الاستجابة للإيثانول في الفئران التي، خلافا للطرق القياسية، لا يحتاج إلى الحرمان من الماء أو السكرين / السكروز يتلاشى لبدء الاستجابة.
Abstract
وتستخدم أساليب الإدارة الذاتية عن طريق الفم هواء فعال عادة لدراسة خصائص يعزز من الايثانول في الحيوانات. ومع ذلك، فإن الأساليب القياسية تتطلب السكرين / يتلاشى السكروز، والحرمان من المياه و / أو التدريب الموسع لبدء استثابي الاستجابة في الفئران. وتصف هذه الورقة رواية وكفاءة طريقة لبدء استثابي بسرعة الاستجابة لالإيثانول الذي ترونه مناسبا المجربون ولا تتطلب الحرمان من الماء أو السكرين / يتلاشى السكروز، وبالتالي القضاء على إرباك المحتمل لاستخدام المحليات في الإيثانول دراسات الإدارة الذاتية استثابي. مع هذا الأسلوب، الفئران ويستار عادة اكتساب والحفاظ على الإدارة الذاتية من حل الإيثانول 20٪ في أقل من أسبوعين من التدريب. وعلاوة على ذلك، تركيزات الإيثانول الدم والمكافآت هي مرتبطة بشكل إيجابي لدورة الإدارة الذاتية 30 دقيقة. وعلاوة على ذلك، النالتريكسون، دواء وافقت عليها الهيئة للاعتماد على الكحول التي قد تظهر لقمع الإيثانول الإدارة الذاتيةفي القوارض، الجرعة بشكل تابع يقلل من تناول الكحول والدافع للاستهلاك الكحول للفئران، إدارة الذات الايثانول 20٪، وبالتالي التحقق من صحة استخدام هذه الطريقة الجديدة للدراسة خصائص يعزز من الكحول في الفئران.
Introduction
وقد أثبتت تطوير نماذج حيوانية لدراسة آثار يعزز من المخدرات أداة هامة لدراسة ادمان المخدرات البشري. وبشكل أكثر تحديدا، استثابي الإدارة الذاتية هي النموذج السلوكي المستخدمة على نطاق واسع التي هي واحدة من أكثر الوسائل فعالية لتقييم الآثار يعزز إيجابية من حل الإيثانول تستهلك شفويا. أما القضية الأولى في تطوير هذا النموذج الذوق مكره الرئيسي لتركيزات عالية من الإيثانول لمعظم القوارض، وهي الظاهرة التي يشترك أيضا في البشر مع خبرة قليلة أو معدومة مع الكحول 1. بروتوكول قياسي للتغلب على هذا الحاجز يتطلب الحرمان من الماء و / أو السكرين أو السكروز يتلاشى لاقتناء وصيانة الإدارة الذاتية. ومع ذلك، هذين النهجين ليست مفيدة. أنها تتطلب فترات طويلة من التدريب لمجرد الشروع في الاستجابة للإيثانول والحصول على معدل النجاح النسبي لاكتساب. يقدم استخدام المحليات أيضا التحيز المحتمل فيتفسير البيانات الإدارة الذاتية. لا تنطبق هذه القيود إلى بروتوكول التالي.
لفترة وجيزة، وقد أظهرت شمشون وزملاؤه 2 ما هو مطلوب حل الإيثانول في حل الحلو من 20٪ سكروز وثم يتلاشى من حلاوة أكثر من 4 أسابيع من التدريب لبدء الاستجابة لمدة 10٪ من الإيثانول في الماء. علاوة على ذلك، حققت كمية الإيثانول يمكن الاعتماد عليها عادة في 6-8 أسابيع 1-3. هذا النهج هو مشكلة كبيرة. أولا، فإنه يتطلب فترات طويلة من التدريب قبل المحققين يمكن أن تبدأ لقياس الإيثانول الإدارة الذاتية. في المقابل، عن طريق الوريد الإدارة الذاتية من الكوكايين أو الهيروين تتطلب 0-1 أيام من التدريب قبل الدواء على رافعة توصيل المواد الغذائية في طعام الحيوانات المحظورة، ومستقرة الاستجابة لمكافحة المخدرات وغالبا ما يتحقق في 10-12 أيام 4،5. الحد آخر من هذا الأسلوب هو حقيقة أن السكرين والسكروز ومجزية للغاية للفئران وتثير أنماط نشاط المخ الصورةimilar إلى تعاطي المخدرات، وبالتالي تقديم قدرات ليفند في الإيثانول الإدارة الذاتية يدرس 6-9. وأخيرا، الفئران اكتساب الإدارة الذاتية من حل الإيثانول باستخدام هذه الطريقة تظهر التباين في اقتناء واستجابة معدل 1،10، مع نسبة كبيرة من الفئران استبعاد باستمرار من التجارب بسبب استحواذ ناجحة و / أو عدم كفاية معدل الاستجابة.
على النقيض من ذلك، مع هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة كفؤ بسيط لاقتناء وصيانة طريق الفم الإدارة الذاتية من الايثانول 20٪ في محلول المياه التي لا تتطلب الحرمان من الماء، والسكروز / السكرين يتلاشى أو التدريب الوصول الموسعة. وكشف التحقيق مؤخرا أن الإدارة الذاتية لإنتاج الإيثانول عن طريق الفم يعرض على شكل حرف U منحنى الاستجابة للجرعة مقلوب مع أكبر قدر من السعرات الإيثانول خلال الإدارة الذاتية في تركيز الايثانول 20٪، وبالتالي توفير الأساس المنطقي لاختيار 20٪ من محلول الإيثانول في experim لديناتصميم ental 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تتم جميع الإجراءات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. رعاية الحيوان والإسكان
- ولدى وصوله في المستعمرة، الفئران منزل الذكور ويستار وزنها 200-225 غرام عند وصوله في أزواج في درجة الحرارة (21 درجة مئوية) والبيئة التي تسيطر عليها الرطوبة مع دورة ضوء الظلام 12 ساعة عكسه.
ملاحظة: اعتمادا على منطق التجارب، قد تكون الفئران واحد يضم. - السماح للفئران حتى يتأقلم إلى الحظيرة ودورة الخفيفة لمدة أسبوع على الأقل قبل البدء في التجربة والتعامل معها يوميا. وزن الحيوانات مرة واحدة أسبوعيا.
- إعطاء الفئران حرية الوصول إلى تشاو ومياه الصنبور لمدة التجربة (الحرمان من الماء وليس من الضروري لبدء الاستجابة 12). إجراء جميع التجارب السلوكية خلال المرحلة المظلمة من دورة ضوء الظلام في غرفة اختبار المظلمة.
ملاحظة: على الرغم من أننا نستخدم بشكل روتيني الشباب البالغين فئران ويستار الذكور (أيام بعد الولادة 62-65)، وهذا عrotocol يمكن أن يكون نظريا مناسبة للتحقيق في سلالات أخرى من الفئران، وكذلك الجنس و / أو سن الخلافات.
2. التدريب هواء فعال
- إجراء جميع عمليات التدريب السلوكي والتجارب في غرف استثابي متطابقة قياس 30.5 × 29.2 × 24.1 سم وتحتوي على طوابق شبكة والمقالي النفايات واصطف مع أغطية فراش (تغيرت بين الحيوانات للحد من الاشارات رائحة)، ويضم في مقصورات-المخففة صوت مجهزة مراوح العادم للتهوية .
ملاحظة: يتم تدريب الفئران عن طريق تكييف هواء فعال، من يوم 1 من التدريب (ردا على رافعة ضرورية للحصول على معزز) بين + 1 ساعة و+ 8 ساعات من دورة الظلام. ليس هناك ما قبل التعرض للكحول، ولا الطعام أو السوائل قبل تشكيل التدريب الكحول. - تجهيز كل غرفة استثابي مع أضواء التحفيز، مضخات الحقنة واثنين من العتلات قابل للسحب وضعه أفقيا إلى وعاء كوب السائل. غرف واجهة والتحكم بواسطة الكمبيوتر باستخدام البرنامج المناسب.
ملاحظة:ومعظم البائعين توفير حزم الإدارة الذاتية تحتوي على جميع العناصر الضرورية وكذلك البرمجيات واجهات اللازمة للسيطرة على المجلسين. - كتابة برنامج تكييف هواء فعال، الذي يبدأ الجدول الزمني للنسبة الثابتة (FR) من 20٪ من الإيثانول التعزيز (جدول الإجرائي الذي يتم تعزيز استجابة إلا بعد عدد معين من الردود) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. على سبيل المثال، في لنسبة ثابتة 1، الفئران يجب أن تنتج رد واحد للحصول على معزز (راجع قسم ملفات التعليمات البرمجية الإضافية للحصول على مثال برنامج FR1). تنفيذ الأوامر التالية.
- تمديد اثنين من العتلات بمناسبة بداية الدورة وللإشارة إلى توافر الكحول.
ملاحظة: يتم مكافأة واحدة الصحافة رافعة على رافعة المرتبطة الإيثانول (نشط) من خلال تقديم وبلغ حجم التداول 100 ميكرولتر من 20٪ من الإيثانول في المياه في المتاخمة الشرب بشكل جيد ويبدأ 5-ق فترة ما يصاحب ذلك من المهلة بشرت به إضاءة للجديلة الضوء فوق رافعة. يتم إدخال الضوء جديلة في يوم 1 من التدريب. - خلال فترة المهلة، سجل يستجيب على الرغم من أنه لا يوجد لديه عواقب حسب الجدول الزمني. ردود سجل على رافعة أخرى (غير نشطة) على الرغم من أنها لا تكون له عواقب السلوكية. ملاحظة: يخدم رافعة الخاملة كعنصر تحكم لتقييم السلوك غير محددة.
- تسجيل عدد من الردود على رافعة النشطة (معدلات الاستجابة) وعدد من المكافآت الايثانول 20٪ حصل.
- بعد انقضاء مدة 30 دقيقة، وسحب العتلات اثنين للإشارة إلى نهاية الدورة وللإشارة إلى نهاية توافر الكحول.
- حفظ وأرشفة كافة البيانات.
- تمديد اثنين من العتلات بمناسبة بداية الدورة وللإشارة إلى توافر الكحول.
- قبل البدء في دورة تدريبية، والتحقق من حسن سير العمل في جميع الأجهزة في كل غرفة استثابي (روافع قابل للسحب، السائل موزع).
- إعداد 20٪ ت / ت حل الإيثانول من 190 إثبات (95٪) من الإيثانول المخفف في مياه الحنفية.
ملاحظة: يمكن أن تظل الحل الايثانول في درجة حرارة الغرفة. اعتماداعلى الشركة المصنعة، قد تكون الحلول الأسهم الإيثانول تصل إلى 99.98٪. لاحظ أيضا أنه في حين أن في معظم المخطوطات المنشورة، يتم عرض عادة تركيزات الإيثانول حجم / حجم، البعض قد تقديمها لوزن / حجم. - ملء المحاقن مع الحل الايثانول 20٪ وتأكد من عدم وجود تسرب أو فقاعات الهواء في خطوط ضخ. دفع يدويا كمية صغيرة من الايثانول من خلال خطوط ضخ للتأكد من أن الإيثانول سيتم تسليمها بشكل صحيح في وعاء من الاستجابة عززت الأولى. تجفيف وعاء مع منشفة ورقية، وتأكد من أنها فارغة قبل بدء الدورة.
- تحميل البرنامج الذي يتحكم في جدول FR من 20٪ من الإيثانول التعزيز
- قطار operant- والفئران ساذجة المخدرات تحت جدول زمني FR1 في تقرير المصير، تدير 20٪ من الإيثانول دون الحرمان من الماء خلال 30 جلسات دقيقة.
- نقل الفئران من الحظيرة إلى غرفة الاختبار باستخدام قفص النقل.
- تعيين كل فأر لغرفة واحدة.اتخاذ كل فأر الفردية من القفص النقل ووضعها في غرفة الإدارة الذاتية المعينة.
- محاولة للحفاظ على شروط التجربة تتفق كل يوم. لذلك، دائما اختبار الفئران في غرفة الإدارة الذاتية نفسها تقريبا في نفس الوقت كل يوم.
- بدء تشغيل البرنامج الذي يبدأ الجدول الزمني FR1 من 20٪ من الإيثانول التعزيز.
- في نهاية الدورة، وإزالة الفئران من غرف الإدارة الذاتية وإعادتها إلى الحظيرة.
- من أجل تأكيد يدويا أن الحل الكحول المستهلكة من قبل الحيوانات، واستخدام منشفة ورقية ومعرفة ما اذا كان يتم تجفيفها وعاء. بدلا من ذلك، استخدم 1 أو 2 مل حقنة وجمع السائل المتبقي في وعاء لتقدير حجم التي لا تستهلك.
ملاحظة: للحصول على قياس أكثر دقة (ولكن أيضا أكثر تكلفة)، فمن الممكن لتجهيز كل غرفة مع نظام lickometer متصلة وعاء كوب السائل التي تتيح للإحصاء دقيق للعقق التي تنتجها الفئران خلال الدورة الإدارة الذاتية. - تنظيف الجدران وشبكة أرضية كل غرفة مع مطهر السطح.
- بعد الاستعمال، والحفاظ على خطوط ضخ من قبل تنظيفها بمحلول الإيثانول 70٪. عندما لا تكون قيد الاستعمال، إدراج الغطاء لتجنب العفن والغبار.
- بعد كل دورة، وجمع وتحليل البيانات التي تم إنشاؤها. بوجه أخص، وحساب متوسط عدد المطابع رافعة نشطة، ومتوسط عدد المكافآت الكحول التي تم الحصول عليها، فضلا عن متوسط عدد المطابع رافعة الخاملة.
ملاحظة: في معظم الصحف، ويرد استهلاك الكحول أيضا كمية الإيثانول في جم / كجم (الجسم). ويمكن حساب كمية الإيثانول باستخدام الصيغة التالية:
مع حجم المستهلكة (مل) - عدد من المكافآت المكتسبة ± موحدة حجم / الثواب وكثافة الايثانول في درجة حرارة الغرفة - 0.789 غرام / مليلتر.
على سبيل المثال، إذا كان الفئران وزنها 400 غرام حصل 20 ريواطلقة من 20٪ حل ت / ت الإيثانول:
- عقد دورات 5/6 أيام في الأسبوع حتى استقرار الأداء (كما هو موضح ما لا يقل عن 15 جلسة وأي تغيير أكبر من 15٪ في العدد الإجمالي من المكافآت المكتسبة خلال 3 جلسات الأخيرة).
ملاحظة: بمجرد الفئران قد وصلت إلى خط الأساس مستقرة على FR1، يمكن تعديل برنامج تكييف هواء فعال وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لزيادة عدد الردود اللازمة للحصول على مكافأة الكحول. يمكن على سبيل المثال أن تكون زيادة لنسبة ثابتة لFR2 أو FR3 من أجل تقليل تعزيز عرضي. - قياس تركيزات الإيثانول في الدم:
- للتأكد من أن المكافآت التي تم الحصول عليها في جلسة الإدارة الذاتية يتم استهلاكها من قبل الفئران، وقياس تركيزات الإيثانول الدم بعد الإدارة الذاتية. مرة واحدة الفئران قد وصلت إلى خط الأساس مستقرة، وجمع الدم من الوريد الذيل الأفقي التالية فوراالدورة. إدراج 23 G الإبرة في الأوعية الدموية، وجمع 50 عينة ميكرولتر الدم باستخدام الأنابيب الشعرية.
- نقل عينات الدم 50 ميكرولتر إلى 10 قارورة فراغ الرأس مل وإضافة 50 ميكرولتر من 1: الكحول 1000 الإيزوبروبيل وفقا لمعايير الداخلي. إعداد المنحنى القياسي 10-300 ملغ / ديسيلتر من المعايير الإيثانول. عينات العملية مع العينات فراغ الرأس مع العمود اللوني 13 وفقا لإعدادات المصنع.
- نسبة التقدمية
- استخدام التقدمية جداول نسبة (PR) لتقييم الدافع من الحيوانات تستهلك مكافأة 14. العلاقات العامة هو الجدول الزمني الإجرائي الذي يتم زيادة عدد الردود للحصول على معزز تدريجيا (وبعبارة أخرى، يتعين على الفئران أن نعمل بجد لكل مكافأة متتالية).
ملاحظة: على عكس الاب الدورات، لا يتم توقيت جلسة العلاقات العامة وسيتم إنهاء مرة واحدة فقط 30 دقيقة قد انقضت دون نسبة إنجازها.- وضع الفئران في صناديق استثابي المسندة إليهم والسماحلهم بالاستجابة لل20٪ من الإيثانول في إطار الجدول الزمني العلاقات العامة في تعزيز: حافظ على جميع ظروف تجريبية مماثلة لتلك المستخدمة في جدول FR (راجع الخطوة 2.3)، باستثناء زيادة شرط استجابة أو تكلفة ضمن الدورة (أي عدد من المطابع رافعة مطلوب على رافعة النشطة للحصول على مكافأة الإيثانول واحدة) وفقا للمعادلة التالية: 1، 2، 3، 4، 6، 8، 10، 12، 16، 20، 24، 28، 32 ... ملاحظة: مثال على يتم توفير برنامج العلاقات العامة في قسم الملفات رمز البرامج الملحقة.
- إنهاء دورة العلاقات العامة مرة واحدة قد انقضت مدة 30 دقيقة دون أجر.
ملاحظة: يتم تعريف توقف هو الشرط استجابة الانتهاء الماضي خلال دورة العلاقات العامة.
- استخدام التقدمية جداول نسبة (PR) لتقييم الدافع من الحيوانات تستهلك مكافأة 14. العلاقات العامة هو الجدول الزمني الإجرائي الذي يتم زيادة عدد الردود للحصول على معزز تدريجيا (وبعبارة أخرى، يتعين على الفئران أن نعمل بجد لكل مكافأة متتالية).
3. اختبار لصحة التنبؤية لنموذج هواء فعال من الكحول الذاتي الإدارة
ملاحظة: بمجرد الفئران التي حصلت على خط الأساس مستقرة الإدارة الذاتية (راجع الخطوة 2)، فمن الممكن لتقييم صحة التنبؤية لهذا النموذج من قبلاختبار فعالية النالتريكسون، وهو دواء وافقت عليها الهيئة حاليا لإدمان الكحول في خفض 20٪ من الإيثانول الإدارة الذاتية. ونحن نوصي بذلك الاختبار على أعلى FR التي تحققت خلال التدريب (FR2)، عندما الردود مرتفعة بشكل موثوق. وبمجرد إنشاء صحة التنبؤية، ونموذج يمكن استخدامها لتقييم المرشحين دواء جديد.
- قبل يوم الاختبار، وإعطاء الفئران حقن المياه المالحة تحت الجلد 30 دقيقة قبل دورات الإدارة الذاتية لروض لهم الحقن خلال مدة لا تقل عن دورتين الإدارة الذاتية متتالية أو حتى الاستجابة لالإيثانول لا يتأثر حقن محلول ملحي (كما هو موضح أي تغيير أكثر من 15٪ في العدد الإجمالي للمكافآت حصل خلال الجلسات الأخيرة (2)).
- حل النالتريكسون في المياه المالحة وضبط درجة الحموضة للوصول إلى حياد لتسهيل الحقن للحيوانات. حقن المخدرات في حجم 1.0 مل / كغ 30 دقيقة قبل جلسة، وذلك باستخدام الطريق تحت الجلد الإدارة. ملاحظة: لتريوفر ature أدلة جيدة لاختيار الجرعة التي تتراوح بين 0.1 - 1mg / كغ، وهكذا يتم استخدام 0.1، 0.3 و 1 ملغ / كغ في هذا البروتوكول.
ملاحظة: تشير البحوث إلى استخدام كل الطرق تحت الجلد والغشاء البريتوني الإدارة لالنالتريكسون، على الرغم من قوتها قد تختلف مع الحقن تحت الجلد الراهن 30 أضعاف أكثر قوة أن الحقن داخل الصفاق 15. لهذا السبب، فإننا ننصح باستخدام الطريق تحت الجلد كما تم التحقق من صحة استخدام هذا الطريق لحقن النالتريكسون وتكرارها من قبل مختبرات مختلفة في مجموعة واسعة من التركيز بين 0.1 و 1 ملغ / كغ 12،15،16. - خلال يوم الاختبار، حقن الفئران في ذلك على نحو متوازن / عشوائي في التصميم بين-المواد عبر واحدة من دورات النالتريكسون الجرعات أربعة (0، 0.1، 0.3 و 1 ملغ / كلغ) 30 دقيقة قبل الدورة الإدارة الذاتية.
- بين كل دورة الجرعات، والسماح الفئران لتبييض الدواء مع ما لا يقل عن دورتين الإدارة الذاتية متتالية أو حتى الاستجابة لالإيثانول هو العودة الى الاساس. ملاحظة: ونتيجة لذلك، في نهاية الاختبار، تم حقن جميع الفئران مع كل من الجرعات أربعة.
- بعد هذه المرحلة، تحديد الجرعة الأكثر فعالية (1 ملغ / كلغ) واختبار تأثير النالتريكسون على الدافع من الحيوانات للاستهلاك الكحول باستخدام جدول زمني نسبة التقدمية (راجع الخطوة 2.12).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 سلوك الإدارة الذاتية التمثيلي للفئران ويستار operant- والمخدرات ساذجة (ثمانية أفواج مختلفة تصل إلى ما مجموعه 239 الفئران) تدريب على جدول زمني FR1 في تقرير المصير، إدارة 20٪ من الإيثانول دون الحرمان من الماء أو السكرين / السكروز يتلاشى خلال جلسات مدة الواحدة 30 دقيقة. مع هذا البروتوكول، الفئران الشروع رافعة الضغط للحصول على مكافأة الإيثانول بسرعة كبيرة، وبالفعل الحصول على أكثر من 10 جوائز خلال الدورتين الأولى (الشكل 1A). أن تصل معدلات الاستجابة مستقرة على رافعة النشطة جلسة 10 من الإدارة الذاتية، والحصول على متوسط 23.7 ± 0.7 المكافآت على FR1 (الشكل 1B)، وهو ما يمثل متوسط كمية الإيثانول من 0.86 غرام / كغ.
ويبين الشكل 2 آثار جرعات مختلفة من النالتريكسون على الكحول الإدارة الذاتية. لتقييم صحة التنبؤية لنموذج حيواني من السعي الإيثانول، وفعالية النالتريكسون، وهو دواء وافقت عليها الهيئة حاليا لإدمان الكحول، يجب التأكد من صحتها على مجموعة من الحيوانات المدربة وفق مواعيد تعزيز الموسعة نسبة ثابتة 3 (FR3). ومن المتوقع أن تنتج انخفاضا تعتمد على الجرعة في إدارة الكحول النفس (الشكل 2A و 2B)، فضلا عن انخفاض الدافع للحصول على الكحول والعلاج مع النالتريكسون تقييمها باستخدام جدول زمني نسبة التقدمية (الشكل 2C).
الشكل 1: فئران ويستار اكتساب والحفاظ على الإدارة الذاتية من 20٪ من الإيثانول. ج: المكافآت متوسط (± SEM) حصل خلال الجلسات 30 دقيقة الإدارة الذاتية (FR1، مرحلة الاستحواذ) من 20٪ من الإيثانول (ن = 239 الفئران). باء: المكافآت متوسط التي تم الحصول عليها خلال جلسات الإدارة الذاتية 30 دقيقة (FR1، FR2 ومستقرالمرحلة) 20٪ (ن = 239 الفئران). C: يعني المطابع النشطة وغير النشطة رافعة (± SEM) أنجزت خلال 30 دقيقة دورات الإدارة الذاتية (FR1، FR2، مرحلة مستقرة) 20٪ (ن = 239 الفئران). D: عدد من المكافآت المكتسبة خلال دورة واحدة الإدارة الذاتية 30 دقيقة مقابل BEC (ملغم / دل) (ن = 36 الفئران، R 2 = 0.67، ف <0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النالتريكسون يقلل كل من الإدارة الذاتية والتحفيز على استهلاك الكحول. ج: يعني المطابع النشطة رافعة (± SEM) أنجزت خلال جلسة 30 دقيقة الإدارة الذاتية (FR3) من 20٪ من الإيثانول التالية إما مالحة أو العلاج النالتريكسون (0.1، 0.3 أو 1 ملغ / كلغ) في فئران ويستار (ن = 16) (** = ف <0.01،*** = P <0.001). باء: المكافآت متوسط (± SEM) حصل خلال جلسة لمدة 30 دقيقة الإدارة الذاتية (FR3) من 20٪ من الإيثانول التالية إما مالحة أو العلاج النالتريكسون (0.1، 0.3 أو 1 ملغ / كلغ) في فئران ويستار (ن = 16) ( ** = ف <0.01، *** = P <0.001). C: يعني توقف (± SEM) تم التوصل إليها خلال جلسة العلاقات العامة من 20٪ من الإيثانول التالية إما مالحة أو العلاج النالتريكسون (1 ملغ / كلغ) في فئران ويستار (ن = 16) (* = ف <0.05). D: عدد من الجوائز (± SEM) حصل خلال جلسة العلاقات العامة من 20٪ من الإيثانول التالية إما مالحة أو العلاج النالتريكسون (1 ملغ / كلغ) في فئران ويستار (ن = 16) (* = ف <0.05). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع هذا البروتوكول، ونحن تقديم طريقة جديدة للحصول على والحفاظ على الاستقرار عن طريق الفم الإدارة الذاتية من 20٪ من الإيثانول في الفئران التي، على عكس النماذج الكلاسيكية من الإيثانول الإدارة الذاتية، لا تتطلب استخدام الحرمان من الماء والتدريب الوصول الموسعة، أو السكرين / السكروز يتلاشى 12. وعلاوة على ذلك، النالتريكسون، وهو دواء وافقت عليها الهيئة حاليا لإدمان الكحول، ويقلل بنجاح الكحول الإدارة الذاتية والدافع للاستهلاك الكحول من فئران ويستار تدرب مع هذا البروتوكول. توفر هذه النتيجة التحقق من صحة الدوائي مهم من البروتوكول كما هو يتفق مع التقارير السابقة تبين أن النالتريكسون فعال في الحد من استهلاك الكحول في الفئران غير معتمدة 16-18. النالتريكسون هو مستقبلات المواد الأفيونية التي أظهرت نتائج واعدة في كل النماذج الحيوانية من تناول الكحول والتجارب السريرية. في النماذج الحيوانية، النالتريكسون فعال في الحد من استهلاك الكحول والذاتينواقص الإدارة في الحيوانات غير التي تعتمد على 16،17،19، دون أن يؤثر ذلك السلوك غير محددة (المطابع رافعة الخاملة) 12. وقد ثبت أيضا أنها فعالة في الحد من تناول الطعام. على سبيل المثال، فإنه يقلل بنجاح كمية السوائل الفئران من كلا حل غير السعرات الحرارية الحلو من السكرين وكذلك استساغة عالية والسعرات الحرارية الشوكولاته الشراب 20. يقلل النالتريكسون أيضا السكروز الإدارة الذاتية 16، وتناول الماء بعد الحرمان من الماء 21، وكذلك اختيار السكرين في اختيار اثنين من زجاجات وضع 22. كل ذلك معا، وتشير هذه النتائج إلى أن النالتريكسون ربما لا يؤثر الكحول الاستجابة عن طريق تحوير قيمة السعرات الحرارية من المعززات السائلة، ولكن الأرجح من خلال خفض قيمة مكافأة فورية من الكحول.
وهناك العديد من المزايا الهامة لهذا النموذج. أولا، في الفترة اكتساب أسرع من مع النماذج السابقة. الفئران تصل معدلات إلحاحا رافعة نشطة للو ذات صلةVELS من الايثانول 23 في أسبوع واحد. نماذج يتلاشى السكر مقرها تتطلب ستة إلى ثمانية أسابيع من الاختبار لإنتاج كمية الإيثانول موثوق 1،3، وبالتالي إضاعة الوقت الثمين والموارد. ثانيا، هذا النموذج يلغي انخفاض ملحوظ في استهلاك الإيثانول شائع بعد إزالة المحليات، وبالتالي ربما يقلل من معدل الاستنزاف في الإيثانول الإدارة الذاتية يدرس 24 ساعة. تم تشغيل ثمانية أفواج مختلفة من الفئران التي تبلغ ما مجموعه 239 فئران ويستار operant- والمخدرات ساذجة باستخدام هذا البروتوكول و 9 فقط معايير تلبية لفشله في الحصول على الإدارة الذاتية (كما هو موضح ما لا يقل عن 10 المطابع رافعة نشطة خلال آخر 3 استقرت بين نسبة ثابتة 1 جلسات). وهكذا، هذا البروتوكول تدريب رواية غلة معدل الاستحواذ الناجح للإعجاب من 96٪. مع هذا البروتوكول، وصلت الفئران معدلات الاستجابة قوية في أقل من أسبوعين، مما أدى إلى متوسط كمية الإيثانول من 0.86 غرام / كغ. هذا المستوى من استهلاك ما يعادلتلك التي توصلت إليها الفئران تدرب مع السكروز / السكرين يتلاشى الإجراءات التي عادة ما حققت متوسط استهلاك ما بين 0.5 و 0.8 جم / كجم 1،2،23،25.
وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج يبسط تفسير الدراسات الإيثانول الإدارة الذاتية عن طريق إزالة يفند نظرا لخصائص مجزية بطبيعتها من السكرين والسكروز في الجرذان. وكانت خصائص الادمان المحتملة من المكافآت الغذاء وأكثر من ذلك ولا سيما من الأطعمة مستساغا مثل السكر موضع اهتمام في السنوات الأخيرة، ويؤكد في النهاية على الحاجة إلى نموذج أكثر تحديدا من الإيثانول الإدارة الذاتية. على سبيل المثال، هناك أدلة تدعم فكرة أن السكروز في حد ذاته قد يكون الادمان في الفئران، كما تعرض الفئران السلوكيات مثل مخاطر الإكثار، والسعي، وانسحاب ردا على الإفراط في تناول السكروز 26-28. وبالإضافة إلى ذلك، والسكروز والسكرين وأكثر التسليح من تعاطي المخدرات مثل الكوكايين والمواد الأفيونية 6-8،29 وهذه المحلياتتغيير تفعيل فوس في مناطق الدماغ بما في ذلك النواة المتكئة بطريقة مماثلة لالايثانول وغيرها من المخدرات من تعاطي 9. وأخيرا، وهذا النموذج هو مناسب لدراسة النماذج الحيوانية من الانتكاس المخدرات. لقد أظهرنا سابقا أن الحيوانات المدربة باستخدام هذا الإجراء تمكنت من اطفاء بقوة ردودهم على الكحول 12، على غرار ما يتم الحصول عليها عادة مع النماذج الكلاسيكية من الإيثانول الذاتي إدارة 25. ويمكن بعد هذه الحيوانات أن تعاد من خلال الاستفادة من الضغوطات 12 أو عن طريق العودة للضوء جديلة 30.
الإيثانول هو دواء متناقضة، والذي يمارس خصائص مجزية ومكره. ويعتقد على نطاق واسع أن طعم مكره الأساسي من الإيثانول يشكل عائقا كبيرا لتحقيق استقرار الإدارة الذاتية في معظم القوارض، وخاصة في تركيزات عالية 1. ومع ذلك، فإن الدراسة التحقيق في التفاعل الذوق في الفئران من مجموعة واسعة من تركيزات الايثانول (من 5 إلى 40٪ ت / ت) surprisiوجدت ngly أن عدد أساس المتعة، ولكن لا مكره، ردود فموي وجهي تميل إلى زيادة مع تركيز الإيثانول أعلى 31. وعلاوة على ذلك، مع التعرض المتكرر للكحول، انخفض عدد الردود فموي وجهي مكره عندما تعرضت الفئران لتركيزات عالية من الإيثانول (20 إلى 40٪ ت / ت)، في حين أنها ظلت دون تغيير مع تركيز أقل (5-10٪ ت / ت). وبالمثل، الفئران التي لديها وصول هواء فعال المتزامن لاثنين من الحلول الايثانول 23 وردت أكثر لتركيزات أعلى (20 أو 40٪ ت / ت) من أقل (10٪ ت / ت، والتركيز الذي غالبا ما يستخدم في السكروز / السكرين يتلاشى الإجراء) والإدارة الذاتية لإنتاج الإيثانول عن طريق الفم يعرض على شكل حرف U منحنى الاستجابة للجرعة مقلوب مع أكبر قدر من السعرات الإيثانول خلال الإدارة الذاتية في 20٪ تركيز الايثانول 11. وتشير هذه البيانات إلى أن تركيزات أعلى من الإيثانول قد تكون أكثر جدوى وأقل مكره للفئران، موضحا لماذا الفئران تكتسب الإدارة الذاتية من 20٪ من الإيثانول في سبروتوكول اور من دون الحاجة إلى الإيثانول قبل التعرض أو السكروز / السكرين يتلاشى الإجراء.
ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن هذا النموذج لا تنتج مستوى تصاعد الإيثانول الإدارة الذاتية وارتفاع تركيزات الدم الإيثانول. لذلك، هذا النموذج لا يسبب الاعتماد البدني في الفئران، وينبغي أن يقترن مع نماذج أخرى إذا كان الهدف من التجربة هو للحث على الإفراط في استهلاك الكحول في القوارض.
كما هو الحال مع العديد من المهام السلوكية، أول معلمة الحرجة هي للحفاظ على شروط التجربة متسقة الإمكان كل يوم. بشكل أكثر تحديدا، ينبغي دائما أن يتم اختبار الفئران في غرفة الإدارة الذاتية نفسها. يجب أن تحدث الدورة في نفس الوقت (± 30 دقيقة) في كافة مراحل التجربة برمتها. يجب أن ظلت تكوين غرفة (راجع الخطوة 2.2) دون تغيير. خلال التدريب الإدارة الذاتية، يمكن أن الدورتين الأولى ستكون حاسمة. وينبغي إيلاء اهتمام خاص إلى thه أنابيب توصيل الدواء، وعاء كوب السائل، ورافعة، ومضخات الحقن. ومن الأهمية بمكان أن الإيثانول يتم تسليم بشكل صحيح في وعاء من الاستجابة عززت الأولى، لأن أي خلل يمكن أن يؤخر أو يعوق الحصول على الإيثانول الإدارة الذاتية.
وباختصار، فإن النموذج الجديد من الفئران لتدريب استثابي الإدارة الذاتية من الكحول عن طريق الفم وصفها في هذا البروتوكول تحسن كبير في كفاءة من خلال خفض وقت التدريب مع زيادة معدل الاستحواذ، يبسط الإجراءات بشكل عام بالاضافة الى تفسير النتائج، ويتم التحقق من صحة كنموذج السليم للشرب الإيثانول عن طريق التجربة النالتريكسون. هذا البروتوكول هو مناسبة لتحقيق خصائص مجزية وتحفيزية من الكحول في الفئران ويمكن الجمع بين إجراءات الإدارة الذاتية استثابي الكلاسيكية مثل الإعادة نماذج لتقييم الأساس العصبي للسلوك التماس الإيثانول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مجلس الأبحاث السويدي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extra Tall MDF Sound Attenuating Cubicle, Interior: 22"W x 22"H x 16"D | Med Associates Inc. | ENV-018MD | |
| Extra Tall Modular Test Chamber with modified Top, Waste Pan and Photobeam | Med Associates Inc. | ENV-007CT-PH | |
| Stainless Steel Grid Floor for Rat or Small Primate | Med Associates Inc. | ENV-005 | |
| Retractable Lever | Med Associates Inc. | ENV-112CM | 2 by SA chambers |
| Stimulus Light, 1" White Lens, Mounted on Modular Panel | Med Associates Inc. | ENV-221M | 2 by SA chambers |
| Dual Cup Liquid Receptacle with 18 ga Stainless Steel Pipes | Med Associates Inc. | ENV-200R3AM | |
| Single Speed Syringe Pump, 3.33 rpm | Med Associates Inc. | PHM-100 | |
| Liquid Delivery Kit | Med Associates Inc. | PHM-122-18 | |
| SmartCtrl 8 Input / 16 Output Package | Med Associates Inc. | DIG-716P2 | |
| MED-PC software | Med Associates Inc. | SOF-735 | |
| http://www.mednr.com/ | Med Associates Inc. | A website that is open-source and has been created to offer researchers a place to exchange MEDState Notation code | |
| Kendall Monoject 20 cc Syringes, Regular Luer Tip | VWR International | MJ8881-520657 | |
| Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP, KOPTEC | Decon Labs | 2801 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | Hospira | 0409-4888-50 | |
| Naltrexone hydrochloride | Sigma Aldrich | N3136-1G | |
| 23 G BD PrecisionGlide Needles | BD | 305145 | |
| Minivette POCT 50 µL, K3EDTA | Sarstedt | 17.2113.150 | For capillary blood collection |
References
- Koob, G. F., et al. Animal models of motivation for drinking in rodents with a focus on opioid receptor neuropharmacology. Recent developments in alcoholism : an official publication. of the American Medical Society on Alcoholism, the Research Society on Alcoholism, and the National Council on Alcoholism. 16, 263-281 (2003).
- Samson, H. H. Initiation of ethanol reinforcement using a sucrose-substitution procedure in food- and water-sated rats. Alcoholism, clinical and experimental research. 10, 436-442 (1986).
- Weiss, F., Mitchiner, M., Bloom, F. E., Koob, G. F. Free-choice responding for ethanol versus water in alcohol preferring (P) and unselected Wistar rats is differentially modified by naloxone, bromocriptine, and methysergide. Psychopharmacology. , 178-186 (1990).
- Koya, E., et al. Role of ventral medial prefrontal cortex in incubation of cocaine craving. Neuropharmacology. 56, 177-185 (2009).
- Karlsson, R. M., Kircher, D. M., Shaham, Y., O'Donnell, P. Exaggerated cue-induced reinstatement of cocaine seeking but not incubation of cocaine craving in a developmental rat model of schizophrenia. Psychopharmacology. , 45-51 (2013).
- Augier, E., Vouillac, C., Ahmed, S. H. Diazepam promotes choice of abstinence in cocaine self-administering rats. Addiction biology. 17, 378-391 (2012).
- Cantin, L., et al. Cocaine is low on the value ladder of rats: possible evidence for resilience to addiction. PloS one. 5, (2010).
- Lenoir, M., Serre, F., Cantin, L., Ahmed, S. H. Intense sweetness surpasses cocaine reward. PloS one. 2, (2007).
- Spangler, R., et al. Opiate-like effects of sugar on gene expression in reward areas of the rat brain. Brain research. Molecular brain research. , 134-142 (2004).
- Rassnick, S., Pulvirenti, L., Koob, G. F. SDZ-205,152, a novel dopamine receptor agonist, reduces oral ethanol self-administration in rats. Alcohol. 10, 127-132 (1993).
- Carnicella, S., Yowell, Q. V., Ron, D. Regulation of operant oral ethanol self-administration: a dose-response curve study in rats. Alcoholism, clinical and experimental research. 35, 116-125 (2011).
- Augier, E., et al. Wistar rats acquire and maintain self-administration of 20 % ethanol without water deprivation, saccharin/sucrose fading, or extended access training. Psychopharmacology. , (2014).
- Macchia, T., et al. Ethanol in biological fluids: headspace GC measurement. Journal of analytical toxicology. 19, 241-246 (1995).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134, 943-944 (1961).
- Williams, K. L., Broadbridge, C. L. Potency of naltrexone to reduce ethanol self-administration in rats is greater for subcutaneous versus intraperitoneal injection. Alcohol. 43, 119-126 (2009).
- Czachowski, C. L., Delory, M. J. Acamprosate and naltrexone treatment effects on ethanol and sucrose seeking and intake in ethanol-dependent and nondependent rats. Psychopharmacology. , 335-348 (2009).
- Stromberg, M. F., Volpicelli, J. R., O'Brien, C. P. Effects of naltrexone administered repeatedly across 30 or 60 days on ethanol consumption using a limited access procedure in the rat. Alcoholism, clinical and experimental research. 22, 2186-2191 (1998).
- Stromberg, M. F., Casale, M., Volpicelli, L., Volpicelli, J. R., O'Brien, C. P. A comparison of the effects of the opioid antagonists naltrexone, naltrindole, and beta-funaltrexamine on ethanol consumption in the rat. Alcohol. 15, 281-289 (1998).
- Gonzales, R. A., Weiss, F. Suppression of ethanol-reinforced behavior by naltrexone is associated with attenuation of the ethanol-induced increase in dialysate dopamine levels in the nucleus accumbens. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 10663-10671 (1998).
- Biggs, T. A., Myers, R. D. Naltrexone and amperozide modify chocolate and saccharin drinking in high alcohol-preferring P rats. Pharmacology, biochemistry, and behavior. 60, 407-413 (1998).
- Beczkowska, I. W., Bowen, W. D., Bodnar, R. J. Central opioid receptor subtype antagonists differentially alter sucrose and deprivation-induced water intake in rats. Brain research. 589, 291-301 (1992).
- Cooper, S. J. Effects of opiate agonists and antagonists on fluid intake and saccharin choice in the rat. Neuropharmacology. 22, 323-328 (1983).
- Samson, H. H., Pfeffer, A. O., Tolliver, G. A. Oral ethanol self-administration in rats: models of alcohol-seeking behavior. Alcoholism, clinical and experimental research. 12, 591-598 (1988).
- Koob, G. F., Weiss, F. Pharmacology of drug self-administration. Alcohol. 7, 193-197 (1990).
- Schank, J. R., et al. The Role of the Neurokinin-1 Receptor in Stress-Induced Reinstatement of Alcohol and Cocaine Seeking. Neuropsychopharmacology : official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. , (2013).
- Avena, N. M., Bocarsly, M. E., Rada, P., Kim, A., Hoebel, B. G. After daily bingeing on a sucrose solution, food deprivation induces anxiety and accumbens dopamine/acetylcholine imbalance. Physiology. 94, 309-315 (2008).
- Avena, N. M. The study of food addiction using animal models of binge eating. Appetite. 55, 734-737 (2010).
- Morgan, D., Sizemore, G. M. Animal models of addiction: fat and sugar. Current pharmaceutical design. 17, 1168-1172 (2011).
- Lenoir, M., Cantin, L., Vanhille, N., Serre, F., Ahmed, S. H. Extended heroin access increases heroin choices over a potent nondrug alternative. Neuropsychopharmacology : official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 38, 1209-1220 (2013).
- Augier, E., et al. The mGluR2 Positive Allosteric Modulator, AZD8529, and Cue-Induced Relapse to Alcohol Seeking in Rats. Neuropsychopharmacology : official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41, 2932-2940 (2016).
- Bice, P. J., Kiefer, S. W. Taste reactivity in alcohol preferring and nonpreferring rats. Alcoholism, clinical and experimental research. 14, 721-727 (1990).
