Introduction
Los microARNs se han convertido en nuevas dianas terapéuticas debido a su papel universal en la regulación de la expresión génica y pruebas directas de la participación en la enfermedad. MiRNAs se están explorando activamente por su potencial como fármaco dirigido a 1,2. Además, alteraciones en la expresión de los genes miARN están asociados con varias enfermedades 3 y simulación de estos cambios por la perturbación artificial de expresión de los genes miARN se puede utilizar para estudiar las vías celulares implicadas en la manifestación de la enfermedad. Entrega específica de tejido de miARN fármacos dirigidos es actualmente un gran desafío para el desarrollo de fármacos basados miARN. Antagomirs e imita miARN son agentes prometedores para perturbar los niveles de miRNA 4-6. Sin embargo, las características especiales que mejoran su especificidad y eficacia tienen que ser incorporado en el diseño de antagomirs antes de que puedan ser utilizados para la perturbación in vivo de la expresión de los genes miARN.
Los microARN son especialmente relevantes como objetivos en neurodegenerativa actualmente incurable y enfermedades del neurodesarrollo. La barrera sangre-cerebro plantea una restricción a la entrega de antagomirs en el cerebro. Inyecciones estereotácticas son ampliamente utilizados en modelos de roedores para entregar moléculas a lugares específicos en el cerebro 7. Se requiere habilidad, amplia inversión en instrumentación y el tiempo. Inyecciones estereotáxicas son invasivas, implica cirugía, causar al menos leve lesión y se limita a la entrega local. El uso de péptidos penetrantes de células con una preferencia por las neuronas de orientación puede contrarrestar estas limitaciones, ya que pueden ser entregados a través de la ruta trans-vascular, pero romper la barrera hematoencefálica. Tal péptido derivado de la rabia Virus de la glucoproteína (RVG), se utilizó previamente para entregar siRNA contra virus de encefalitis japonesa en ratones 8. Encontramos que el uso del péptido para antagomir entrega, miRNAs puede ser efectivamente derribado en el cerebro del ratón 9.
ontenido "> El segundo gran reto de miARN knock-down surge desde el pequeño tamaño de miRNAs y la presencia de isoformas de secuencias estrechamente relacionadas. Tomamos el ejemplo de la MMU-miR-29 familiar que consta de tres isoformas estrechamente relacionados, miR-29a , b y c. antagomirs son también en general modificada a lo largo de la columna vertebral para aumentar su estabilidad y hacerlas resistentes al ataque de nucleasas. Locked Nucleic Acids (LNA) ofrecen una ventaja adicional que mejoran la estabilidad térmica e incluso conducir a la degradación orientar sobre y más allá impedimento estérico 10. La introducción de modificaciones a lo largo de la columna vertebral puede ser eficaz, pero caro. Hemos visto anteriormente que las modificaciones más allá de un número óptimo pueden no mejorar aún más la eficacia. El diseño de la antagomir por lo tanto, implica la modificación óptima de la antagomir.Para antagomir complejo no covalente con el péptido neurotrópico, un hepta- cargada a la extensión nona-arginina se utiliza el. D-argininaresiduos se utilizan ya que confieren mayor estabilidad ya que no son susceptibles a la escisión por proteasas. Hepta a estiramientos-nona arginina actúan agentes celulares penetrante como eficientes, a pesar de que no confieren especificidad de tipo celular. Al enlazar covalentemente el péptido RVG al enlazador nona-arginina, un neurotrópico, péptido celular penetrante se generó. Los residuos cargados positivamente del péptido interactúan con la columna vertebral de ácido nucleico cargado negativamente, para formar complejos. Estos complejos se pueden utilizar para transfectar eficazmente ADN o ARN en células cultivadas e in vivo en los tejidos.
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Protocol
Nota: Todo el procedimiento incluyendo sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Ética Animales (AICE) en el Instituto de Genómica y Biología Integrativa, Nueva Delhi (IGIB / AEC / 10/2013). Este protocolo se ajusta específicamente para la ejecución selectiva de antagomir-29 en el cerebro y desmontables de miR-29.
1. antagomir Estrategia Diseño
- Recuperar la secuencia de los genes miARN maduro de miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
- Recuperar las secuencias de miembros de la familia miARN relacionados utilizando el enlace de "familia de genes" en el registro miRBase
(Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009). - Invertir complementar la secuencia: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html proporciona una herramienta conveniente pararevertir secuencias del complemento.
- Marque las posiciones que ser modificados por LNA utilizando las siguientes pautas:
- Elige residuos de timina colocados 3-4 bases aparte para la modificación LNA, ya pirimidinas LNA son más estables que las purinas 12.
- Elija residuos de citosina separadas por 3-4 residuos si paso anterior produce menos de cinco modificaciones.
- Dar prioridad a las cinco modificaciones en el extremo 5 'del antagomir, ya que esto evita la secuencia de semillas.
Preparación Complejo 2. antagomir-neuropéptido
Nota: Este es el paso más crítico en el protocolo y que necesita la estandarización. Para estandarizar el protocolo de cualquier oligonucleótido marcado con fluorescencia (FLO) se puede utilizar en lugar de la antagomir 9. Los péptidos deben ser de alta pureza (calidad HPLC, pureza 98%) y .Sequences cargo de péptido y antagomir se dan en la Tabla 1.
- Decidir el número de mesesles de antagomir a inyectar en base a la carga molar en antagomir, su toxicidad y el peso del ratón. Calcular el número de moles de péptido a inyectar basa en relación de carga molar de antagomir: péptido.
NOTA: Estandarizar relación de carga molar de antagomir: péptido de la toxicidad y la entrega efectiva en el cerebro del ratón. Utilice diferentes relaciones de carga molar de oligonucleótido marcado con fluorescencia: péptido de la normalización. Encontramos que antagomir-29 y el control eran ambos tóxicos en 4microgram / gramo de peso corporal del ratón. Antagomir-29 y el control se utilizaron a 2microgram / gramo de peso corporal, pero es probable que varíe para cada microRNA esta concentración efectiva. - Diluir el péptido y antagomir en tubos de microcentrífuga separados de soluciones madre estéril con 10% de D-glucosa a la concentración final deseada como calculada en el paso 1.
- Mantenga el tubo de microcentrífuga con la solución de péptido en un vórtice a velocidad moderada vórtex.
- Añadir 1/3 de la unantagomir solución al tubo de solución de péptido, lentamente, gota a gota, mientras se mezcla a fondo en un mezclador de vórtice.
- Continuar mezclando de soluciones en el vórtice para el próximo 1 min y deje reposar la mezcla durante 1 minuto.
- Repita el paso 4 y 5 de dos veces más para mezclar el restante antagomir solución con la solución de péptido en el mismo tubo de microcentrífuga. La adición lenta es crítica para la formación de complejos de mono-dispersa que son eficaces en la transfección. Además rápido puede conducir a la agregación de los complejos y su precipitación.
- Incubar el complejo durante 30 min a TA sin agitación con vórtex. Durante este tiempo de incubación, aclimatarse a los ratones el laboratorio donde se llevarán a cabo inyecciones.
3. cola vena Inyección de Complejo antagomir-neuropéptido
- Para frenar el animal, coloque el ratón en un retenedor o decapicone del tamaño adecuado.
- Limpie la superficie de la cola utilizando pr hisopo de algodóne-empapado en agua caliente (aproximadamente 40 ° C). Esto promoverá la vasodilatación y aumentar la visibilidad de la vena.
- Acércate a la cola con un volumen pequeño (0,5-1,0 cc) jeringa de insulina en un ángulo de 15 a 20 °. Tenga cuidado de no introducir el aire en la jeringa. Comience en la parte distal de la cola. Inyectar el complejo. Retire la aguja y aplique una gasa con antiséptico directamente en el sitio de inyección (aproximadamente 5 a 10 segundos) para detener cualquier sangrado.
- Vuelva a colocar el ratón en una jaula de ventilación individual en el grupo de 3-5, con la mazorca de maíz y papel de seda como enriquecimiento. No guarde los ratones no inyectados e inyectados en una misma jaula.
4. Los ensayos de comportamiento
Nota: Mantenga el intervalo de tiempo de 3-4 horas entre ensayos de inyección y de comportamiento para permitir la recuperación después de la inyección. Traiga el ratón para una habitación tranquila. No moleste a los animales durante este período de aclimatación.
- Aclimatar el ratón a lanuevo ambiente durante 30 minutos y luego comenzar los siguientes ensayos de comportamiento. Mantenga una distancia de 10 minutos entre cada ensayo conductual.
- Juntando las extremidades posteriores:
NOTA: Esta prueba indica disfunción motora y deterioro neurológico.- Levante el ratón con cuidado mediante la celebración de cerca de la base de la cola en el fondo claro.
- Compruebe la posición de las extremidades posteriores de 10-15 seg. Ensancha ratón tipo salvaje extremidades posteriores lejos de abdomen, mientras que un ratón atáxica tiende a retraer uno o ambos miembros posteriores hacia el abdomen más de 50% del tiempo de 13 suspendido.
- Devuelva el ratón a la jaula
- Prueba Ledge:
- Levante el ratón con cuidado mediante la celebración de la cola y mantenerlo en la cornisa de una jaula.
- Observe el ratón específicamente en la esquina de la jaula. Wild tipo de ratón puede pasar las esquinas fácilmente sin miedo y perder el equilibrio. Ratón atáxica pierde su equilibrio, congelación o sacude mientras camina por la cornisa de la jaula y en las esquinas.
- Mantenga el ratón suavemente con una mano y aplicar la tinta en las extremidades traseras por un cepillo.
- Coloque la lámina absorbente en el suelo de una pista estrecha.
- Permita ratón para caminar o correr sobre una lámina absorbente en una línea recta en una pista de aterrizaje de un extremo a otro.
- Repetir el proceso dos veces más con cada ratón utilizando lámina absorbente fresco.
- Medir la distancia entre dos pasos consecutivos en el movimiento hacia adelante. No incluya primeros y últimos huellas donde el animal se acaba de iniciar y terminar su recorrido, respectivamente.
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Representative Results
Usando el procedimiento que aquí se presenta, complejos de oligonucleótido 50microgram marcado con fluorescencia (FLO) y ~ 850microgram RVG péptido 1:15 relación de carga molar: se prepararon (FLO péptido) y se inyecta una sola vez a través de la vena de la cola. Complejo de la no-neurotrópico Matrix Virus de la Rabia (RVM) péptido y FLO fue utilizado como un control de entrega. Al día siguiente, los ratones se aislaron cerebro y el hígado y se prepararon suspensiones de células individuales. Las células se observaron bajo el microscopio para fluorescencia verde. Complejo FLO-RVG fue entregado con éxito con un menor tiempo de un día y detectado como una fluorescencia verde en las células cerebrales, pero no en el hígado (Figura 2B, 2D) mientras que el péptido RVM entregado FLO para el hígado, pero no en las células del cerebro ( Figura 2A, 2C).
Para desmontables miR-29 en el antagomir cerebro de ratón contra el miR-29 se diseñaron con cinco modificaciones LNA. El, secuencia de dirección no miARN codificado utilizado como antagomir acondicionadocontrol. Complejo de 50microgram antagomir-control o antagomir-29 con ~ péptido RVG 850microgram se preparó y se inyecta a través de vena de la cola durante un transcurso de tiempo de 3 días, seguido por ensayos diarios de comportamiento como se muestra en la figura 1. Con el fin de lograr el máximo efecto de caída, complejos eran inyecta una vez al día durante 3 días consecutivos. El cuarto día los ensayos de comportamiento se realizaron sin inyección. Análisis de la huella de ratón mostró una reducción significativa en la longitud del paso de antagomir-29 RVG ratones inyectados (Figura 3A-3B). Miembro Posterior juntando ensayo de antagomir-29 RVG ratones inyectados claramente mostró un comportamiento atáxica con tendencia a retractarse de una o ambas extremidades posteriores hacia el abdomen. En la prueba de cornisa antagomir-29 RVG inyectó ratones mostraron congelación o sacudiendo el comportamiento con pérdida del equilibrio en la esquina de la jaula. Los ratones fueron sacrificados mediante la inyección de clorhidrato de xilazina (16milligram / kg) y tiopental sódico (80milligram / kg) en cuarto día (24 horas después de la última inyección de complejo).Se utilizaron muestras de cerebro para realizar el análisis molecular y celular. El ARN total recogido de la corteza, cerebelo y el hipocampo. Ensayo cuantitativo en tiempo real PCR mostró clara reducción en los niveles de expresión de ambas isoformas de miR-29, miR-29a (Figura 4A) y miR-29b (Figura 4B), en el antagomir-29 RVG inyecta partes del cerebro de ratones.
Figura 1. Esquema de inyección en la vena de la cola del ratón y el comportamiento.
Con el fin de orientar el miR-29 en el cerebro, el dominio antagomir o antagomir-29 con el péptido RVG se inyectó una vez al día durante 3 días consecutivos a través de la vena de la cola. Los ensayos de comportamiento se realizaron a diario, después de un periodo de 3 horas, para permitir que el ratón para recuperarse de la inyección. En cuarto día sólo ensayos de comportamiento se realizaron y los ratones fueron sacrificados y el tejido cerebral se recogieron para PCR en tiempo real y el culo celularays. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. péptido RVG entrega marcado con fluorescencia oligonucleótido específicamente para el cerebro del ratón.
Utilizando el método descrito en este artículo, se prepararon complejos de oligonucleótidos marcados con fluorescencia (FLO) y RVG péptido / RVM y se inyectaron sólo una vez a través de vena de la cola. Complejo FLO-RVG se detectó como una fluorescencia verde en las células del cerebro, pero no en el hígado (B, C), mientras que el péptido RVM entregado FLO para el hígado, pero no el cerebro (A, C) 9. Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
Figura 3. miR-29 tumbar conduce al comportamiento atáxica.
Ensayos de huella de ratón (A) en el cuarto día mostraron una reducción clara en la distancia entre dos pasos consecutivos para el ratón tratado con antagomir-29 (B) (**) valor de p <0,001; n = 3 (Figura modificada de 9.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. antagomir-29 y RVG complejo regula a la baja de miR-29 en el cerebro del ratón.
El ARN total recogido de tres partes del cerebro. Ensayo cuantitativo en tiempo real PCR se realizó para estimar los niveles de expresión de ambas isoformas de miR-29, miR-29a (A) y miR-29b (B) 9.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Secuencia | Cargar | Largo |
| RVG-péptido | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASn-GGGG-rrrrrrrrr * | 11 + | 41 |
| RVM-péptido | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-GGGG-rrrrrrrrr * | 11 + | 40 |
| Control antagomir (revueltos) | 5 'C CAA T CGAC C AA C 3' | 14 - | 14 |
| Antagomir-29 | 5 'C AC T GA T TT C AAA T GG 3' | 16 - | 16 |
| * Argininaresiduos en el extremo C-terminal de RVG y RVM péptidos están en forma D. | |||
| Se subrayan LNA bases modificadas en las secuencias antagomir. |
Tabla 1. Secuencias de péptido y antagomirs
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
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