Introduction
Cancer de l' ovaire épithélial (COE) est la cause la plus fréquente de décès par cancer gynécologique, avec une estimation 21,290 nouveaux diagnostics aux États - Unis en 2015 et environ 14.180 décès 1. La grande majorité (> 75%) des femmes sont diagnostiquées avec la maladie à un stade avancé (stade III ou IV) caractérisée par diffuse des métastases intra-péritonéale et de mauvais pronostic. La maladie récidive dans la cavité péritonéale après une chimiothérapie de première ligne est également courante et représente une cause majeure de mortalité 2,3. COU métastase par un mécanisme unique impliquant à la fois dans le prolongement direct de la tumeur primaire vers les organes péritonéaux voisins ainsi que par la dissociation ou l'excrétion des cellules de la surface de la tumeur primaire en tant que cellules individuelles ou des agrégats multicellulaires. Les cellules sont éliminées dans la cavité péritonéale, dans laquelle ils résistent l' apoptose induite par le détachement-4. Accumulation de l'ascite péritonéale est commun, comme les cellules tumorales hangar bloquent le drainage lymphatique péritonéale et tumors produisent des facteurs de croissance qui modifient la perméabilité vasculaire. Une partie des cellules tumorales hangar fixer à la surface des organes péritonéale et structures , y compris l' intestin, le foie, l' épiploon et le mésentère, après quoi ils ancrent et prolifèrent pour produire de multiples lésions secondaires largement diffusées 3,5. métastase hématogène est rare. Ainsi, la gestion clinique consiste habituellement en chirurgie cytoreductive y compris "debulking optimale", définie comme la résection de la tumeur tout visible (peu importe la taille). Cytoréduction complète est associée à une augmentation significative de la survie globale 6,7 et est associée au défi de l' identification et l' élimination des lésions <0,5 cm.
petits modèles animaux ont démontré l'utilité dans la recherche de cancer de l'ovaire dans l'amélioration de notre compréhension de la progression de la maladie aussi bien dans l'identification de biomarqueurs et de tests de nouvelles chimiothérapies ou des approches de thérapie combinaison de pronostic. Comme le primairele site de l'incidence du cancer de l'ovaire et de la métastase est la cavité péritonéale, les modèles orthotopique de EOC métastases implique l'analyse et la caractérisation des maladies intrapéritonéale. Bien qu'il y ait eu des améliorations récentes dans la capacité de cellules tumorales d'image, même au niveau de la cellule unique, il existe encore des difficultés importantes dans la quantification de la charge de la tumeur métastatique du COU. Ces défis se posent en raison du nombre, la taille et la localisation anatomique des lésions métastatiques. En outre, il existe un besoin de cellules cancéreuses d'étiquettes pour les distinguer des cellules normales de l'hôte. Des études antérieures ont utilisé des protocoles ou la transfection de cellules tumorales avec la luciférase 8,9 marquage à base d' anticorps. Marquage fluorescent direct des cellules cancéreuses a été d' abord rapportée par Chishima et ses collaborateurs en 1997 10. Des marqueurs fluorescents ne nécessitent pas l' addition d' un substrat exogène et fournissent une spécificité exquise des cellules tumorales, en fournissant un moyen plus efficace pour suivre les métastases du cancer 11,12
Nous décrivons ici un procédé d'imagerie optique destiné à l' analyse quantitative de la maladie métastatique au moyen d' un modèle de xénogreffe orthotopique syngénique constitué de la protéine fluorescente rouge (RFP) -tagged cellules murines de cancer de l' ovaire ID8 13 et des souris C57 / BL6 immunocompétentes. Nous démontrons une nouvelle méthode de rapport de la charge tumorale en combinant la quantification in vivo et l' imagerie ex vivo par prélèvement de tissu auto-fluorescence. Cette approche a une utilité potentielle dans des études visant à évaluer l'effet de facteurs génétiques, épigénétiques ou micro-environnement spécifique des modifications et / ou des modalités de traitement des métastases spécifique d'un organe de cancer de l'ovaire.
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Protocol
Toutes les études in vivo ont été approuvées par l'Université de Notre Dame de protection des animaux et l' utilisation Comité et ont utilisé des souris C57 / BL6J féminins.
1. murin cancer de l'ovaire Culture cellulaire
- Rendre le milieu de l'ovaire de souris ID8 de cellules de cancer de la culture comme suit: 1 L de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 4% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de pénicilline / streptomycine, 5 pg / ml d'insuline, 5 pg / ml de transferrine et 5 ng / ml de sélénite de sodium.
- Transduction ID8 cellules de cancer ovarien murin 13 pour exprimer Red Fluorescent Protein (RFP) en utilisant des particules lentiviraux achetés dans le commerce exprimant RFP et un marqueur de sélection (gène blasticidine). A noter que la protéine fluorescente verte peut être utilisée, mais elle fournit un signal de fluorescence plus faible.
- Immédiatement avant la transduction, les cellules en culture à 50-70% de confluence et ajouter du milieu frais (sans la pénicilline / streptomycine) contenant 1 ml de polybrène (5 ug / ml finalla concentration).
- Doucement pipette DP-lentivirus (20 pi) goutte à goutte dans le plat et incuber à 37 ° C pendant 72 heures. Retirer moyen et incuber avec du milieu frais pendant 24 heures. Commencer la sélection de cellules transduites par l' ajout blasticidine dans le milieu de culture (5 pg / ml) et de surveiller les globules rouges en utilisant la microscopie à fluorescence (figure 1 ).
- Culture des cellules de la DP-tagged en milieu ID8 par ensemencement d' environ 10 6 cellules dans une boîte de culture de tissus et de visualiser tous les jours à l' aide d' un microscope optique jusqu'à ce que la monocouche cellulaire est confluentes.
- Lorsque confluentes, récolter les cellules en utilisant la trypsine (0,25%, 3 min) et retourner le ballon à 37 ° C incubateur jusqu'à ce que les cellules sont détachées.
- Neutraliser la trypsine avec 6 ml de milieu de culture contenant du sérum ID8. Pipeter haut et en bas contre le fond du plat, puis transfert à un tube conique de 15 ml. Centrifugeuse à 1200 RPM pendant 2 min, puis aspirer le milieu en utilisant un glass pipette.
- Laver les cellules avec un tampon phosphate salin (PBS) en remettant en suspension doucement dans 6 ml de PBS chaud et centrifugation comme dans 1.5 ci-dessus. Remettre en suspension dans du PBS à une concentration finale de 5 x 10 6 cellules / ml. Gardez les cellules chaudes (37 ° C) jusqu'à ce que l' injection.
2. L' injection intra-péritonéale de cellules ID8 et l'imagerie in vivo
- Injecter chaque souris avec 2 mL de la solution chaude ID8-PBS pour un total de 10 millions de cellules par le biais intra-péritonéale (ip) injection. Laisser les cellules tumorales de se développer in vivo pendant environ 10 semaines avec l' imagerie en direct chaque semaine.
- Immédiatement après l' injection et chaque semaine par la suite, peser les souris puis anesthésier chaque souris en utilisant isofluorane (débit de 2,5% dans 0,5 L / min O 2 flux). Remarque: Les souris ont été pesées, et non comme une mesure quantitative de la charge tumorale, mais plutôt une mesure plus générale de progression physique de chaque souris durant l'étude. Les souris pèsentts ont été comparés à leurs propres valeurs de poids précédentes.
- Anesthetize souris en plaçant dans une chambre isofluorane. Maintenir une anesthésie constante tandis que la numérisation en positionnant la tête de la souris dans le nez cône d'exposition à 2,5% isofluorane de débit tout au long de la procédure.
- Utilisez crème dépilatoire pour enlever les poils sur le torse et l'abdomen de chaque souris, comme les cheveux noirs provoque une atténuation du signal de fluorescence. Les souris sont baignées à l'eau tiède après application de la crème dépilatoire et séchées avec RT serviettes en papier.
- Bien que anesthésié, scanner le corps entier de chaque souris à l'aide d'un petit système d'imagerie optique animal. Numériser toutes les souris dans une cohorte à chaque point de temps. Utiliser le protocole de deux étapes suivantes (figure 2A):
- Dans l'étape 1, pour observer les cellules tumorales marquées par fluorescence (RFP), exécuter l'acquisition multispectrale pour recueillir un total de 5 images en utilisant des filtres d'excitation de 440 nm, 460 nm, 480 nm, 520 nm et 540 nm et un filtre d'émission de 600 nm. Utilisez les paramètres suivants d'acquisition: une exposition standard de 15 sec, 2 x 2 binning, FOV de 160 mm, et f arrêt de 1,1.
- Dans l'étape 2, pour observer l'animal entier, acquérir une image de réflectance en utilisant un filtre ouvert d'excitation (lumière blanche), un filtre d'émission ouverte, une exposition standard de 0,2 s avec 2 x 2 binning et un FOV de 16 cm. Remarque: Le temps d'imagerie réelle est ~ 1 min.
3. Souris Dissection et Image Acquisition
- Lorsque l' imagerie en direct montre la présence d'une maladie étendue intra-péritonéale ou les animaux présentent une accumulation d'ascite (comme en témoigne la distension abdominale), la perte ou le gain de poids corporel supérieur à 20%, de la léthargie ou d' autres signes de détresse, euthanasier chaque souris à l' aide de CO 2 anesthésie suivie d'une dislocation cervicale.
- Couper la peau en avant le long de la ligne médiane ventrale de la souris, en utilisant dissectio pointuen ciseaux, à partir du haut des cuisses vers le bas de la cage thoracique. Prenez soin de couper à travers seulement la couche de peau (Figure 2Bi). Séparez délicatement la peau du tissu péritonéal, en étant sûr de ne pas percer la paroi péritonéale.
- Avec des ciseaux de dissection pointues, coupées latéralement à la fois sur le fond de la cage thoracique et le haut des cuisses pour créer deux volets de la peau (figure 2B ii, iii).
- Placez chaque souris sur sa face ventrale (cavité péritonéale vers le bas) avec les lambeaux de peau ouvris et scanner chaque souris avec ses organes in situ en utilisant le petit système d'imagerie optique animale (figure 3A, B).
- Utilisez les mêmes paramètres d'acquisition d'image comme décrit dans 2.4.1.-2.4.2.
- Continuer à disséquer la souris en extrayant les organes péritonéale individuels, y compris le foie, épiploon / pancréas, l'estomac, le diaphragme, l'intestin grêle, gros intestin, à gauche et à droite du péritoine, les ovaires, kidneys, mésentère et coussinet adipeux.
- Observer, énumérer et enregistrer les tumeurs visibles sur chaque organe. Utilisez un étrier pour mesurer le diamètre de chaque tumeur.
- Désigner les tumeurs de moins de 2 mm de diamètre plus petit, entre 2 et 5 mm en moyenne et supérieure à 5 mm en général.
- Placer les organes sur le gabarit de balayage d' un organe (figure 4) qui identifie un emplacement prédéterminé pour chaque organe. Utilisez PBS pour maintenir les organes humide.
- Balayez chaque feuille d'organes à l' aide du petit système d'imagerie optique animale (figure 3C, D).
- Utilisez les mêmes paramètres d'acquisition d'image comme décrit dans l'étape 2.4.
- Après la numérisation, placez les organes dans 10% de formaldéhyde pour permettre un traitement ultérieur pour l'histologie.
4. Quantification de la tumeur Burden dans ee Fluorescence Images
- Afin de réduire la quantité d'auto-fluorescence dans chaque balayage multispectral, premier UNMIX les fichiers en utilisant un logiciel disponible avec le petit système d'imagerie animale.
- Chargez d' abord la DP: In Vivo fichier spectral, suivi par le Autofluor: Dans le fichier Vivo Rouge dans la fenêtre Images Unmixed et sélectionnez UNMIX.
- Exporter les fichiers .bip que 16 bits .tiff Format (unscaled).
- Utilisez le logiciel ImageJ (ex vivo des organes, puis le corps entier de la souris avec les organes in situ).
- Utilisez la commande Fichier> Ouvrir pour ouvrir les fichiers .tiff des fichiers de modèle d'analyse d'organes 16 bits dans ImageJ.
- Sous Image> Réglage> Luminosité / Contraste, choisissez de définir la valeur minimale affichée à 0 et le maximum valeur affichée à 35353 puis sousImage> Tables de recherche, sélectionnez Red Hot. Remarque: Différents modèles animaux exigent différents niveaux de luminosité, mais il est important de maintenir la luminosité uniforme dans une étude donnée.
- Utilisation de l'outil Sélection au lasso, dessiner une région libre-forme de sélection d'intérêt (ROI) autour de chaque organe et utiliser l'outil de mesure (CTRL + M) pour calculer la surface de chaque organe; enregistrer la zone de surface de chaque organe dans une feuille de calcul.
- Avec le retour sur investissement dessiné autour de chaque organe, clic droit dans le ROI et sélectionnez Duplicate pour inclure uniquement l'organe.
- Tout en regardant l'organe individuel, sous Image> Réglages> Seuil, choisissez de définir le seuil de l'image à un niveau seuil inférieur de + 1200 et un seuil supérieur Niveau de + 1700 pour sélectionner ONLy les régions fluorescentes les plus vives et vérifier pour sélectionner Arrière - plan foncé; sélectionnez OK. Remarque: Les images peuvent nécessiter une manipulation manuelle des curseurs de seuil dans ImageJ de sorte que les zones les plus brillantes sont sélectionnées précédemment pour l'étape de l'analyse, comme indiqué ci-dessus. modèles de maladies différentes exigeront des contraintes différentes de seuil, mais il est important de maintenir les niveaux cohérents tout au long d'une étude donnée de seuil.
- Sous Analyse> Analyser les particules, modifier la taille (pixels ^ 2) à 10-Infinity, choisir d'afficher: Outlines, vérifier pour sélectionner uniquement "Afficher les résultats" et cliquez sur OK pour mesurer à la fois les zones et les densités intégrées premières de ces régions lumineuses, tumeurs jugées.
- Enregistrer les valeurs de la zone de surface et la densité Raw intégrée de la sélection de chaque tumeur affichée dans la
- Sous Analyse> Outils> Bar Calibration, ajouter une barre d'échelle d'étalonnage pour les images des organes. Remarque: Dans cet exemple, cela a été fait en changeant l'emplacement supérieur droit, la couleur de remplissage noir, le Label Couleur White, le nombre d'étiquettes à 5, les décimales à 0, la taille de police à 12 et le zoom Facteur à 4,0 et permettant Text Bold.
- Sous Fichier> Enregistrer sous ..., sauf le montage comme .tiff et .jpeg.
- Utilisez la commande Fichier> Ouvrir pour ouvrir le fichier .jpeg des organes puis sous Insertion> Zone de texte
- Utilisez la commande Fichier> Ouvrir pour ouvrir chacun des fichiers .tiff des scans corporels dans ImageJ 16 bits dans l' ordre du nombre de souris.
- Sous Image> Réglages> Luminosité / Contraste, choisissez de définir la valeur minimale affichée à 0 et le maximum valeur affichée à + 35353 puis sous Image> Tables de recherche, sélectionnez Red Hot.
- Sous Fichier> Enregistrer sous ..., sauf le montage comme. Tiff et .jpeg.
Analyse 5. Données
- Ajouter les zones de sélection des tumeurs et des densités intégrées brutes, respectivement, pour chaque organe de chaque souris et enregistrer la superficie totale de la tumeur d'un organe pour chaque souris.
- Normaliser la zone enregistrée et integrat brutles valeurs de densité ées pour la taille de chaque organe en divisant la surface de la tumeur et le total des valeurs de densité intégrées brutes par la surface de l' organe correspondant (tableau 1).
- Calculer et tracer la moyenne des deux zones de surface de la tumeur normalisées et les valeurs de densité normalisées intégrées brutes (figure 5A, B).
- Comparez ces valeurs moyennes à celles obtenues en comptant visuellement les tumeurs qui étaient visibles à l'oeil nu lors de l'inspection de chaque organe pour les lésions métastatiques.
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Representative Results
Le mécanisme métastatique du cancer des ovaires est caractérisé par des métastases hautement diffuse intrapéritonéal constitué de nombreuses lésions de diverses tailles, y compris de multiples petits (<2 mm) des lésions. Ainsi, l' utilisation de cellules tumorales marquées DP (figure 1) et l' imagerie optique fournit une méthode alternative pour le comptage manuel et la mesure de la taille des lésions. Le développement de la charge tumorale au fil du temps peut être déterminé par semaine de pesée de souris et de mesure de la circonférence abdominale afin d' évaluer la présence potentielle de l' ascite. Imagerie optique in vivo fournit une approche complémentaire pour évaluer la charge de la tumeur (Figure 2). Cancer de l'ovaire se métastase à plusieurs sites dans la cavité péritonéale et les conducteurs moléculaires des métastases spécifiques au site sont actuellement inconnus. En plus de la détermination de la charge globale de la tumeur, le sacrifice suivant dissection minutieuse peut être réalisée afin d'évaluer et de quantifier spécifique au site patterns de métastases. Ainsi, l' imagerie optique des organes péritonéale in situ (Figure 3A, B) combinés avec des ex vivo évaluation des organes individuels (figure 3C, D) peut fournir des données utiles sur l' ensemble vs la charge tumorale spécifique d'organe. Les analyses présentées dans la figure 3 représente les résultats de l' analyse des cavités abdominales et des organes individuels de souris avec un degré de variation de la charge tumorale. Par exemple, la figure 3C représente la charge tumorale le plus dans les épiploon / pancréas, des ovaires et du mésentère de souris A. Par rapport à ces mêmes organes de souris B, une différence significative dans le signal est considéré (Figure 3D). L'utilisation du modèle de balayage d'organes (Figure 4) facilite l' identification de la charge tumorale spécifique d'organe. L'observation de la charge tumorale différentielle est confirmée quantitativement en termes de surface de la tumeur et de l' intensité du signal de la tumeur (tableau 1, figure 5).
figure 2 et 3 illustrent la large gamme de la charge tumorale qui peut être imagée et quantifiée en utilisant cette méthode. Les données du tableau 1 illustrent cette large gamme d'applicabilité pour quantifier les deux tumeurs de surface et l' intensité du signal de la tumeur. Par exemple, lorsque l'on regarde l'épiploon / pancréas de souris A par rapport à celle de la souris B, la surface spécifique de la tumeur normalisée est 26 fois plus élevé chez la souris A que la souris B. En outre, la grande plage d'intensité de signal est également illustré dans l'omentum / pancréas de souris A et B; la densité brute intégrée normalisée de la souris A est 56 fois supérieure à celle de la souris B. Ces résultats démontrent la validité de comparaing de la charge tumorale de plusieurs essais assujettit par rapport à l'autre, tant en termes de surface de la tumeur et de l'intensité du signal de la tumeur, en utilisant cette méthode rapide qui ne nécessite pas plus d'une analyse histologique.
Figure 1. Cellules ID8 murin Cancer ovarien DP Express (A) image. Phase de cellules ID8. (B) image Fluorescence des cellules ID8. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. imagerie optique en direct de C56 / BL6 souris avec intra-péritonéale Tumor Burden. (A) la crème dépilatoire a été utilisé pour enlever hai r de la surface ventrale de la souris avant la numérisation. (B) Schéma montrant ligne médiane ventrale initiale et incisions latérales. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Endpoint Numérisation du commerce intra-péritonéale charge tumorale. (A, B) Les souris sont d' abord imagée avec des organes in situ (face ventrale vers le bas) après l' ouverture de la surface ventrale de la souris. (C, D) Imagerie des organes individuels. Chaque organe est disséqué, la charge tumorale visuelle enregistrée, et placé sur le gabarit de balayage d'organes aux fins d'analyse.target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Modèle de numérisation Organ. les organes disséqués sont placés sur le gabarit de balayage d'un organe pour maintenir l'identification de position des différents organes au cours du balayage.
.. Figure 5. Normalized données quantitatives pour la Épiploon / Pancréas, Ovaires et Mesentery données ont été analysées comme décrit dans le protocole et comme indiqué dans le tableau 1 Mouse A se réfère à la souris numérisée dans le panneau 3A; souris B fait référence à la souris numérisée dans le panneau 3B. (A) zone tumorale Normalisée. analyse Fluorescence signal de quantification de ces trois organes a été réalisée et quantifiée en termes d'un rapportde la tumeur de surface à la zone entière de la surface d'organes pour les deux souris. (B) Normalized densité intégrée brut. Fluorescence analyse signal de quantification de ces trois organes a été réalisée et quantifiée en termes d'un rapport de la densité intégrée brute à l'ensemble de la surface d'organes pour les deux souris.
| Épiploon / Pancréas | |||
| Normalized zone tumorale | Normalized Densité Raw Integrated | ||
| Souris A | 0,5346 | 5.11E + 07 | |
| Souris B | 0,0203 | 8.97E + 05 | |
| ovaires | |||
| Normalized zone tumorale | Normalized Densité Raw Integrated | ||
| Souris A | 4.79E + 07 | ||
| Souris B | 0,0123 | ||
| mesentery | |||
| Normalized zone tumorale | Normalized Densité Raw Integrated | ||
| Souris A | 0,2951 | 2.22E + 07 | |
| Souris B | 0,0098 | 4.15E + 05 | |
Tableau 1. Tumeur Normalized Zone et Normalized RawLes valeurs de densité intégrées dans le Épiploon / Pancréas, Ovaires et Mesentery des deux souris A et souris B. Poster dissection et la numérisation, chaque organe a été segmentés et sa fluorescence quantifiées afin de déterminer la proportion de la zone de la tumeur à la surface totale des organes et les intensités des fluorescence pour ces zones tumorales. Les épiploon / pancréas, des ovaires et du mésentère ont été sélectionnés car ils avaient les plus forts signaux de fluorescence au sein des deux groupes témoins positifs et négatifs.
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Discussion
Contrairement aux études utilisant des cellules cancéreuses d'ovaire humain qui doivent être menées dans des souris immunodéprimées, le protocole décrit ci-dessus utilise des souris immunocompétentes C57 / BL6 et des cellules syngéniques de souris de cancer de l'ovaire. Bien que cette évaluation du rôle potentiel des infiltrats immunitaires dans la progression tumorale et les métastases permet, la présence de cheveux noirs sur la surface abdominale rend l'imagerie moins sensible. Utilisation d'un épiler pour éliminer les poils avant l'imagerie améliore l'acquisition d'images, mais prend du temps, en particulier pour des expériences d'imagerie nécessitant longitudinale. souris glabres 'nude' peuvent être utilisés dans ce protocole et ne nécessitent pas l'enlèvement dépilatoire à base de cheveux. En outre, des souris nude ne disposent pas d'un système immunitaire fonctionnant alors peuvent également être utilisées pour évaluer la croissance des cellules cancéreuses d'ovaire humain dans des expériences où la contribution du système immunitaire ne sont pas en cours d'analyse.
Il convient également de noter que la profondeur de intrapertumeurs itoneal présente aussi des défis techniques, comme l'imagerie par fluorescence optique ne sera généralement pas détecter des tumeurs à des profondeurs supérieures à 5 mm. En outre, la prévalence de liquide d'ascite et de la présence de cellules tumorales ascitiques fournissent des complications supplémentaires. Nous avons observé une variabilité significative souris à la souris dans la formation de liquide d'ascite, même quand ils sont injectés avec la même lignée cellulaire. Ainsi, en présence d'une ascite, cette méthode est préférable pour l'analyse de point final de la charge tumorale spécifique d'un organe, plutôt que l'imagerie de routine longitudinale de progression. Dans le cas actuel, des changements dramatiques dans la charge tumorale ont été notées entre les souris par exemple, de telle sorte que les cohortes de quatre à cinq souris sera généralement suffisante pour une analyse statistique. Dans le cas de différences moins dramatiques dans la charge tumorale, les sujets expérimentaux supplémentaires seront nécessaires pour atteindre la puissance statistique. Bien que les exemples présentés ici diffèrent de manière significative du volume de la tumeur, l'imagerie par fluorescence optique peut être utilisé pourdétecter des différences beaucoup plus petites de la charge tumorale spécifique d'organe, en particulier lorsque comparés aux poids ou mesures basées sur l'étrier-sur de petites lésions (non représentées) .Resolution et la sensibilité varie en fonction de la lignée cellulaire et le système d'imagerie. Dans le cas présent, les implants métastatiques aussi petites que 400 um de diamètre peuvent être résolus et quantifiés. D' autres méthodes , y compris la tomographie par contraste amélioré par ordinateur (CT), la résonance magnétique (IRM) et la tomographie par émission de positons (PET) ont été décrites pour l' imagerie longitudinale 14,15. Modalités y compris l' imagerie anatomique et fonctionnelle combinée sont également en cours de développement 16.
En ce qui concerne cette méthode proposée pour la quantification de la charge tumorale, il convient de noter que la détermination des seuils de fluorescence [Etape 4.3.5.] Est basée sur l'intensité de la fluorescence voit dans les images d'organes [Etape 4.3.2]. et qui est choisie par l'utilisateur afin d'inclure uniquement les régions les plus fluorescentes relative au reste de l'organe. Pour différentes valeurs de seuil ont été utilisées pour l'analyse avant de déterminer les valeurs de seuil finales utilisées dans cette étude. Une fois déterminé, ces mêmes seuils ont été utilisés pour chaque organe analysé de manière à assurer la cohérence dans la quantification de ce qui est considéré tissu métastatique par l'analyse visuelle initiale effectuée par le chercheur. La détermination de ces seuils est une étape cruciale dans la procédure et pourrait potentiellement varier d'un projet à l'autre tel que déterminé par le chercheur individuel. Dans ce cas, un grand seuil inférieur a été utilisé de manière à capturer seulement les signaux de fluorescence les plus élevées de l'intensité. En utilisant ce même seuil pour chaque organe analysé, l'analyse et les résultats comparatifs offrent des résultats quantitatifs dans le cadre de cette cohorte de souris. Bien que cette méthode est limitée dans la quantification des valeurs absolues des tumeurs de surface, il permet aux chercheurs de comparer la charge de la tumeur par rapport normalisé entre les mêmes d'unnd différents organes au sein des cohortes de souris. Il convient de noter que cette approche comprend la quantification des tumeurs qui ne sont pas visibles à l'oeil nu.
Le mécanisme métastatique unique des résultats EOC dans carcinose intrapéritonéale largement diffusées impliquant plusieurs tissus et organes, ce qui rend la chirurgie cytoréduction optimale techniquement difficile. Comme cytoréduction complète est en corrélation positive avec la survie globale, il en résulte que le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre les métastases intra-péritonéale est justifiée. L'évaluation de l'efficacité thérapeutique, cependant, dépend de la quantification précise de la charge tumorale, y compris l'évaluation des métastases spécifique d'un organe. En utilisant l' imagerie optique des cellules tumorales DP-tagged in situ corrigée pour autofluorescence d'organes, combinés avec imagerie ex vivo d'organes attention, nous avons développé une approche pour quantifier la charge tumorale spécifique d'organe intrapéritonéale. Fait intéressant, nos analyses montrentque les sites préférés de métastases dans ce modèle, tel que défini par la tumeur zone / charge de surface, sont semblables à ceux trouvés chez les femmes atteintes d'un cancer de l' ovaire (épiploon, de l' ovaire, de l' intestin, mésentère) 2,4,5. Par conséquent, cette approche devrait avoir une utilité future dans l'évaluation des traitements expérimentaux conçus pour cibler la maladie métastatique.
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Disclosures
Cet article fait partie d'un numéro spécial sur l'imagerie multimodaux pré-clinique, parrainé par Bruker Biospin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
- American Cancer Society. , Available from: http://www.cancer.org/cancer/ovariancancer/overviewguide/ovarian-cancer-overview-key-statistics (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer. Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).
- Barbolina, M. V., et al. Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).
- Lengyel, E., et al. Epithelial ovarian cancer experimental models. Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).
- Harter, P., duBois, A. The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence. Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).
- Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).
- Sweeney, T. J., et al. Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).
- Chishima, T., et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression. Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).
- Bouvet, M., et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).
- Hoffman, R. M. The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo. Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).
- Roby, K. F., et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).
- Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer. Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).
- Kim, T. J., et al. Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma. Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).
- Picchio, M., et al. Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment. Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).
