Introduction
Die Kernhülle (NE) trennt das Kernplasma aus dem Zytoplasma. Es besteht aus einem inneren und äußeren Kernmembran (INM und ONM, respectively), die an Kernporen verbinden zusammen. Das Lumen von beiden Membranen abgegrenzt wird als perinukleären Raum (PNS). Die ONM ist eine Erweiterung des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der INM haftet an der Lamina, um ein Maschenwerk des Typs V-Atom Intermediärfilamente von A- und B-Typ dargestellt Lamine 1,2. Linker der Nucleoskeleton und Zytoskelett (LINC) -Komplexe sind makromolekularer Komplexe, die die gesamte Kernhülle überspannen kann, um das Innere des Kerns physikalisch verbinden Zytoskelettfilamenten und molekularen Motoren (1A). Sie bestehen aus Wechselwirkungen zwischen evolutionär konservierte Motive, die zwei Familien von integralen Transmembranproteine des NE charakterisieren: Sun (SAD1 / Unc84) Proteine und Nesprine (Nuclear Envelope Spek). Bei Säugetieren Sun1 und Sun2 are Transmembranproteine des INM, deren N-terminale nukleoplasmatischen Region interagiert direkt mit A- und B-Typ Lamine 3-5. Auf der anderen Seite des INM, im PNS, Hafen Sun Proteine einen evolutionären konserviert Strecke von ~ 150 C-terminalen Aminosäuren genannt SUN-Domäne. SUN Domänen interagieren direkt mit dem evolutionären konserviert KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne Homologie) -Domäne, die molekulare Signatur der Nesprine. KASH Domänen bestehen aus einer Strecke von ca. 30 C-terminalen Aminosäuren, die in die PNS, gefolgt von einer Transmembran-Domäne 6 ragt. Mindestens vier verschiedene Nesprin Gene (Nesprin1-4) kodieren KASH haltige Proteine, die an der NE 7 lokalisieren. Die zytoplasmatischen Regionen Nesprine, deren Größen variieren von ~ 50 kDa (Nesprin4) zu einer erstaunlichen 1.000 kDa (Nesprin1 giant) enthalten mehrere Spektrin wiederholt sowie spezifische Motive, damit ihre Wechselwirkung mit Zytoskelett-Komponenten, wie beispielsweise Actin, plectin und molekularen Motoren 8- 13.
<p class = "jove_content"> Studium in Wirbeltieren und wirbellosen Tieren haben gezeigt, dass Lamin / Sun / Nesprin / molekulare Motoren stellen eine evolutionär konservierte "Achse" Steuerung Kern Migration und Verankerung. Einige Knock-out (KO) Maus-Modellen der LINC komplexe Bauteile wurden beschrieben und waren maßgeblich an der Schaffung eines Rahmens, um die Rolle von Sun und Nesprin Proteine an der NE während der Entwicklung von Säugetieren 9,14,15 zu verstehen. Allerdings sind diese Modelle weisen mehrere signifikante Nachteile auf, insbesondere: 1) Schwierigkeiten bei der Interpretation Phänotypen aufgrund der nicht autonomen Effekte, 2) Schwierigkeiten bei der Unterscheidung der phänotypischen Beitrag von Zell KASH haltigen vs. KASH losen Nesprin Isoformen 16, 3) die funktionelle Redundanz von Sonne und Nesprin Proteine an der NE in zahlreichen Zelltypen erfordert komplexe Zuchtprogramme, alle SUN-KASH Wechselwirkungen bei Mäusen 17 und 4) die perinatale Sterblichkeit von Mäusen mangelhaft für die KASH-Domäne sowohl inaktivierenNesprins1 und 2 schließt die Analyse der Erwachsenen Phänotypen 18.Dieses Protokoll beschreibt ein neues Mausmodell entwickelt, um alle SUN-KASH Wechselwirkungen in vivo stören, in einer Zelle autonom und entwicklungsregulierter Weise umgehen somit viele der oben beschriebenen Nachteile. Diese Cre / lox-basierten Mäusemodell beruht auf zwei wichtige Konzepte: 1) die KASH Domäne von irgendeinem bekannten Nesprin Protein ausreicht, um EGFP auf die NE in Zellkultursystemen Ziel und 2) Sonnendomänen interagieren promiscuously mit KASH Bereichen, wodurch eine Überexpression von beliebige KASH Domäne werden alle endogenen SUN Domänen zu sättigen und zu inaktivieren LINC-Komplexe in einer dominant-negative Art und Weise 17 (1B). Dieses Protokoll beschreibt Gewebe Ernte- und Verarbeitungsschritte verwendet werden, um die Störung aller SUN-KASH Wechselwirkungen im Kleinhirn-Purkinje-Zellen bestätigen.
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Protocol
Ethics Statement: Verfahren, die Tierversuchspersonen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Washington University in St. Louis genehmigt.
1. Mauszucht und Genotypisierung
- Breed Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mäusen, die mit Tg (PCP2-Cre) Mäuse Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20 zu erzeugen. Anmerkung: Während der Rest dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung der Tg (PCP2-Cre) Mauslinie zu EGFP-KASH2 Ausdruck Purkinje Zellen innerhalb des Kleinhirns zu beschränken, kann ein ähnliches Verfahren mit einer anderen Tg (Cre) Maus verfolgt werden ( Abbildung 2a).
- Führen Genotypisierung um Welpen beherbergen beide EGFP und Cre-Transgene, wie zuvor beschrieben 19 zu identifizieren.
2. Vorbereitung der Materialien für die Präparation und Gewebeentnahme
- Bereiten Sie 100 ml 30% Saccharose in PBS (30 g Saccharose / 100 ml 1x PBS) und bei -20 ° C. Der Tag der Gewebe hie Ernte, Tauwetter und Last ~ 30-35 ml Saccharose-Lösung in einen 35-ml-Spritze für transkardialer Infusionen.
- Vorbereitung 40 ml von 4% PFA in PBS (10 ml 16% igem Paraformaldehyd und 30 ml PBS). Last ~ 30-35 ml 4% PFA in eine 35 ml-Spritze zur transkardialer Perfusionen.
- Füllen Sie einen 10 cm-Gewebekulturplatte mit 10 ml PBS für Gewebedissektion.
- Bereiten Sie eine Ketamin / Xylazin-Cocktail, bestehend aus 16 mg / ml Ketamin und 3 mg / ml Xylazin.
- Eine Lösung aus 70% Ethanol für die Präparation.
3. Dissection und Gewebeentnahme
- Unter Verwendung einer 1 ml Spritze injizieren 500 ul des Ketamin / Xylazin Cocktail pro 25 Gramm Körpergewicht, und warten Sie ca. 15 min. Alternativ verwenden Sie einen anderen institutionell genehmigten Sedierung Methode, die für das biologische System von Interesse geeignet ist.
- Nach Sedierung, sanft Prise die Hinterpfote, den Mangel an Schmerzreaktion zu bestätigen, stecken alle Pfoten auf einem Styropor-Fach mit der Rückenseite desMaus nach unten.
- Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol und einen Einschnitt von den Unterbauch an die Spitze des Brustkorbs, um Zugang zum Herzen zu gewinnen.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof des Herzens und legen Sie die Spritze mit der 30% igen Zuckerlösung in den linken Ventrikel des Herzens.
- Perfusion der Lösung bei einer Rate von ~ 2-5 ml pro min. Wenn leer, entfernen Sie die Spritze und wiederholen Sie mit der 4% PFA-Lösung.
- Unpin die Maus vom Styroporbehälter und zu enthaupten, um das Gehirn zu gelangen.
- Entfernen Sie die Haut um den Kopf des Tieres mit einer Pinzette und Schere. Poke ein Loch in den hinteren Teil des Schädels mit einer Nadel und entfernen Sie vorsichtig den Schädel mit Schere und Pinzette.
- Sobald das Gehirn ist eindeutig erreichbar, verwenden Pinzette, um das Kleinhirn zu entfernen und legen Sie sie in PBS. Halbieren das Kleinhirn in der Sagittalebene mit einem Skalpell und übertragen, die 30% Saccharose-Lösung über Nacht bei 4 ° C. Hinweis: Um prepsind Paraffinschnitten, beheben das Kleinhirn über Nacht bei 4 ° C in 4% PFA vor Gewebeeinbettung und Schnitte.
4. Gewebeverarbeitung und Schnitte
- Bereiten einer Aufschlämmung aus Trockeneis und 2-Methylbutan. Dass die Temperatur des Bades während 5 min sich ausgleichen lassen.
- Füllen Sie eine cryomold mit OCT-Verbindung und legen Sie eine Hälfte des zweigeteilten Kleinhirn in die Form.
- Mit Hilfe eines Binokular und einer Pinzette Position das Kleinhirn, so dass der zweigeteilten Oberfläche (in der Nähe der Mittellinie des Kleinhirns) nach oben zeigt.
- Übertragen Sie die cryomold auf die Trocken Eisbrei für 5 Minuten, bis der OCT-Verbindung hat eine solide weißen Matrix um die Gewebeprobe gebildet. Anmerkung: Die gefrorene Probe kann nun bei -20 ° C, wenn erforderlich, gespeichert.
- Etikett vorbehandelt Polylysin Folien zum Sammeln von Gewebeschnitten und bereiten den Kryostaten gemß den Anweisungen des Herstellers, um 15 um Abschnitte des cere sammelnbellum. Um die Abschnitte zu sammeln, vorsichtig an den Oktober Abschnitt mit dem Poly-Lysin-beschichtete Seite der Folie. Um die Ausrichtung des Abschnitts zu erhalten, müssen Sie die Folie während dieses Schritts nicht drehen.
- Shop Gewebeschnitte bei -20 ° C, bis mit der Färbung und Imaging fortfahren.
5. Die Färbung und Imaging von Kleinhirn Sections
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor der Gewebefärbung:
~ 50 ml PBS
~ 5-10 ml von 4% PFA in PBS
~ 10-20 ml 0,5% Triton X-100, 10% Eselserum in PBS - Thaw Kleinhirnschnitten. Wichtig ist, zu minimieren, ihre Exposition gegenüber einer beliebigen Quelle von kontinuierlichen und intensiven Licht, um Verblassen der EGFP verhindern.
- Verwendung einer hydrophoben Barriere Stift, ein Rechteck um den Gewebeschnitten.
- Post-fix die Abschnitte mit 4% PFA für 5 min. Verwenden Sie ausreichend Flüssigkeit, um den gesamten Bereich von der hydrophobe Barriere (in der Regel ~ 500 ul) abgegrenzt decken. Mit Hilfe eines Vakuum oder Pipette wiederbewegen das Fixiermittel besonders achten, dass die Gewebeschnitte stören.
- Mit einer Pipette vorsichtig anzuwenden PBS auf der Folie, ohne die Gewebeschnitte zu stören. Nach 5 min verwenden das Vakuum oder Pipette vorsichtig die Flüssigkeit. Wiederholen Sie die PBS spülen insgesamt dreimal.
- Verwendung einer Pipette vorsichtig Die geeignete Verdünnung von primären Antikörpern (3 ul Calbindin und / oder Nesprin2 Antikörper pro 900 Mikroliter Lösung) in 0,5% Triton X-100, 10% Eselserum in PBS gelten. Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln.
Anmerkung: EGFP-KASH2 wird durch direkte Fluoreszenz-Mikroskopie auf Gefrierschnitten sichtbar und es ist nicht notwendig, um eine Anti-EGFP-Antikörper zu verwenden. Wenn Paraffinschnitte wurden hergestellt, Imaging von EGFP-KASH2 erfordert jedoch Immunodetektion mit einem Anti-EGFP-Antikörper. - Entfernen Sie die Antikörperlösung und spülen Sie mit PBS dreimal.
- Vorbereitung 1: 1000 Verdünnungen von Alexa-Fluor sekundären Antikörper in 0,5% Triton X-100,10% Eselserum in PBS und lagern in der Dunkelheit.
- Entfernen Sie vorsichtig die endgültige PBS spülen und wenden Sie die Sekundärantikörperverdünnung für eine Stunde im Dunkeln.
- Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung, spülen und waschen Sie den Abschnitt dreimal. Falls erforderlich, tragen Sie eine Kernfärbung, wie DAPI (~ 300 nM), während der ersten PBS-Anwendung.
- Vollständig zu entfernen, die PBS-Lösung, um von der Gewebe und Ort ~ 5-7 & mgr; l Montagetechnik auf dem Gewebeschnitt. Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des Gewebeschnitts und beiseite stellen für ~ 15-30 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit eingestellt.
- Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit den entsprechenden Filtern ausgestattet, um EGFP und alle anderen für die Sekundärantikörper in den Schritten 5.8 / 5.9 verwendet geeigneten Wellenlängen zu visualisieren. In Kleinhirnscheiben, mit einem 20x-Objektiv an EGFP-KASH2 Kern Felgen anzuzeigen.
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Representative Results
Dieses Protokoll zeigt die Nützlichkeit der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mausmodell EGFP-KASH2 Ausdruck cerebellar Purkinje-Zellen unter Verwendung Tg (PCP2-Cre) Mäusen zu beschränken. Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) Sekundärteilchen, die LacZ / V5 offenen Leserahmen an P6 durch die Rekombinase Cre, wodurch die Expression von EGFP-KASH2 spezifisch an Purkinje-Zellen (2A) gezielt führenden geschnitten. Wie erwartet, ist EGFP-KASH2 zur Kernhülle richtet, wie durch die um den Kern (2B) beobachtet EGFP-positiven felgenartigen Muster angegeben. Jede physiologische Phänotyp zu maximieren, ist es wichtig, durch Berechnung des Prozentsatzes der EGFP-KASH2 positive Zellen, die mit einem zellspezifischen Antikörper-Marker co-gefärbte dass EGFP-KASH2 in einer Mehrzahl von gezielten Zellen exprimiert. In diesem Beispiel wurde EGFP-Expression KASH2 in mehr als 70% der Calbindin-positive Purkinje-Zellen (2B) detektiert. In diesen bedingungengen, wir konnten keine signifikanten histologischen oder Verhaltens Phänotypen 10 Monate alten Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) Mäusen 20 zu beobachten. Es ist wichtig sicherzustellen, dass jeder morphologischen oder Verhaltensphänotyp nicht durch ektopische Expression von EGFP-KASH2 in einem unbeabsichtigten Zellentyp / Gewebe. Zu diesem Zweck wurde EGFP-KASH2 nicht in der Körnerzellschicht oder der Molekularschicht des Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Kleinhirn (2B) beobachtet.
Schließlich ist es wichtig, das Ausmaß des LINC komplexe Störung in Zellen EGFP-KASH2 bestätigen. Dies kann unter Verwendung hochwertiger Anti-Nesprin Antikörper gegen ihre Vertreibung aus dem NE von Zellen, die EGFP-KASH2 betonen, erreicht werden. Wie in Abbildung 3 gezeigt, ist die endogene Nesprin2 aus der Kernhülle der Purkinje-Zellen, die EGFP-KASH2 auszudrücken (Abbildung 3 Deckelplatte, gelbe Pfeile) verschoben, während Purkinje-Zellen, die EGFP-KASH2 reta nicht exprimierenin endogenen Nesprin2 an der Kernhülle (Abbildung 3 obere Platte, weißer Pfeil). Wie erwartet, Steuerwurfgeschwistern, die nicht Cre-Rekombinase exprimieren, zeigen Nesprin2 an der Kernhülle des gesamten Purkinje-Zellpopulation (Abbildung 3 unten weiße Pfeile). Mehrere Berichte haben nun bestätigt die Expression von EGFP-KASH2, begleitet von der Verschiebung des endogenen Nesprine in weiteren Geweben und Zelltypen, wie beispielsweise Skelettmuskelfasern und Zapfenrezeptoren 19,21.
Abbildung 1 LINC Komplexen verbinden den Kern mit dem Zytoskelett und werden durch die Überexpression von EGFP-KASH2 gestört. (A) Darstellung des LINC-Komplexe, die das Innere der Zellkern in das Zytoplasma-Zytoskelett verbinden. Beachten Sie, dass SUN Domänen interagieren wahllos mit KASH Domainsaus allen Nesprine (Nesprine 1-4). (B) Überexpression von EGFP-KASH2 verdrängt endogenen Nesprine aus der Kernhülle in die Notaufnahme, in einer beherrschenden negativen Art und Weise, so dass dem Trennen des Kerns aus dem umgebenden Zytoplasma-Zytoskelett.
Abbildung 2. Die Überexpression von EGFP-KASH2 speziell auf Kleinhirn Purkinje-Zellen ausgerichtet. (A) Zucht von Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) bis Tg (PCP2-Cre) Mäusen zu einer Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Nachkommen in denen die Rekombinase Cre ist speziell in cerebellar Purkinje-Zellen exprimiert. Nach der Expression (P6), transloziert Cre-Rekombinase in den Zellkern, wo es schneidet das LacZ ORF und induziert EGFP-KASH2 Ausdruck. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Mäusen spezifisch exprimieren EGFP-KASH2 in Kleinhirn Purkinje-Zellen identifmit Calbindin ied (rot eingefärbt). Beachten Sie, dass beide Kleinhirnkörnerzellen und Interneuronen der Molekularschicht sind negativ für EGFP-KASH2 Ausdruck. Abkürzungen: Mol: Molekülschicht, PCL: Purkinje Zellschicht und GCL: Körnerzellschicht.
Abbildung 3. Störung der endogenen LINC-Komplexe in Kleinhirn Purkinje-Zellen. Einzel Konfokalebene zeigt die Expression von EGFP-KASH2 die endogene Nesprin2 (rot gefärbt) von der Kernhülle der Purkinje-Zellen (gelbe Pfeile oben) verdrängt. Beachten Sie, dass Purkinje-Zellen ohne EGFP-KASH2 Ausdruck beizubehalten endogenen Nesprin2 an ihren Kernhülle (weißer Pfeil oben). In Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Steuerwurfgeschwistern, wird keine EGFP-Signal beobachtet und Nesprin2 ist an der Kernhülle aller Purki erkannt
Dieses Protokoll stellt die Nützlichkeitdie Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mausmodell zu EGFP-KASH2 Ausdruck zerebelläre Purkinje-Zellen unter Verwendung von Tg (PCP2-Cre) Mäusen zu beschränken. Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) Sekundärteilchen, die LacZ / V5 offenen Leserahmen an P6 durch die Rekombinase Cre, wodurch die Expression von EGFP-KASH2 spezifisch an Purkinje-Zellen (2A) gezielt führenden geschnitten. Wie erwartet, ist EGFP-KASH2 zur Kernhülle richtet, wie durch die um den Kern (2B) beobachtet EGFP-positiven felgenartigen Muster angegeben. Jede physiologische Phänotyp zu maximieren, ist es wichtig, durch Berechnung des Prozentsatzes der EGFP-KASH2 positive Zellen, die mit einem zellspezifischen Antikörper-Marker co-gefärbte dass EGFP-KASH2 in einer Mehrzahl von gezielten Zellen exprimiert. In diesem Beispiel wurde EGFP-Expression KASH2 in mehr als 70% der Calbindin-positive Purkinje-Zellen (2B) detektiert. Unter diesen Bedingungen haben wir keine signifikante histologische oder behaviora beobachtenl Phänotypen 10 Monate alten Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) Mäusen 20. Es ist wichtig sicherzustellen, dass jeder morphologischen oder Verhaltensphänotyp nicht durch ektopische Expression von EGFP-KASH2 in einem unbeabsichtigten Zellentyp / Gewebe. Zu diesem Zweck wurde EGFP-KASH2 nicht in der Körnerzellschicht oder der Molekularschicht des Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Kleinhirn (2B) beobachtet.
Schließlich ist es wichtig, das Ausmaß des LINC komplexe Störung in Zellen EGFP-KASH2 bestätigen. Dies kann unter Verwendung hochwertiger Anti-Nesprin Antikörper gegen ihre Vertreibung aus dem NE von Zellen, die EGFP-KASH2 betonen, erreicht werden. Wie in Figur 3 gezeigt, ist die endogene Nesprin2 von der Kernhülle der Purkinje-Zellen, die EGFP-KASH2 exprimieren (Figur 3 obere Platte, gelbe Pfeile) verschoben wird, während Purkinje-Zellen, die nicht exprimieren EGFP-KASH2 behalten endogenen Nesprin2 an der Kernhülle (Abbildung 3 (Abbildung 3 unten weiße Pfeile). Mehrere Berichte haben nun bestätigt die Expression von EGFP-KASH2, begleitet von der Verschiebung des endogenen Nesprine in weiteren Geweben und Zelltypen, wie beispielsweise Skelettmuskelfasern und Zapfenrezeptoren 19,21.
Abbildung 1 LINC Komplexen verbinden den Kern mit dem Zytoskelett und werden durch die Überexpression von EGFP-KASH2 gestört. (A) Darstellung des LINC-Komplexe, die das Innere der Zellkern in das Zytoplasma-Zytoskelett verbinden. Beachten Sie, dass SUN Domänen interagieren wahllos mit KASH Domänen von allen Nesprine (Nesprine 1-4). (B) Die Überexpression of-EGFP KASH2 verdrängt endogenen Nesprine aus der Kernhülle in die Notaufnahme, in einer beherrschenden negativen Art und Weise, so dass dem Trennen des Kerns aus dem umgebenden Zytoplasma-Zytoskelett. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Überexpression von EGFP-KASH2 speziell auf Kleinhirn Purkinje-Zellen ausgerichtet. (A) Zucht von Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) bis Tg (PCP2-Cre) Mäusen zu einer Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Nachkommen in denen die Rekombinase Cre ist speziell in cerebellar Purkinje-Zellen exprimiert. Nach der Expression (P6), transloziert Cre-Rekombinase in den Zellkern, wo es schneidet das LacZ ORF und induziert EGFP-KASH2 Ausdruck. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Mäusen spezifisch exprimieren EGFP-KASH2 in Purkinje-Zellen des Kleinhirns mit Calbindin identifiziert (rot eingefärbt). Beachten Sie, dass beide Kleinhirnkörnerzellen und Interneuronen der Molekularschicht sind negativ für EGFP-KASH2 Ausdruck. Abkürzungen: Mol: Molekülschicht, PCL: Purkinje Zellschicht und GCL:. Körnerzellschicht Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Störung der endogenen LINC-Komplexe in Kleinhirn Purkinje-Zellen. Einzel Konfokalebene zeigt die Expression von EGFP-KASH2 die endogene Nesprin2 (rot gefärbt) von der Kernhülle der Purkinje-Zellen (gelbe Pfeile oben) verdrängt. Beachten Sie, dass Purkinje-Zellen ohne EGFP-KASH2 Ausdruck beizubehalten endogenen Nesprin2 an ihren Kernhülle (White arrow top). In Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Steuerwurfgeschwistern, wird keine EGFP-Signal beobachtet und Nesprin2 ist an der Kernhülle aller Purkinje-Zellen (weiße Pfeile unten) festgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Der wichtigste Schritt, um erfolgreich zu studieren die Rolle des LINC-Komplexe in vivo unter Verwendung der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Modell ist, um eine geeignete Cre Mauslinie (n) zu identifizieren. In der Tat, wenn Cre ist in anderen Zelltypen in ähnlicher Wegen beteiligt aktiv, es kann die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Daher ist es wichtig, in der Nähe von Zellen zu untersuchen, wie hier in der molekularen und Körnerzellschicht des Cerebellums (2B) dargestellt. Ebenso ist es, um alle physiologisch relevanten Phänotypen maximieren wichtig, eine Cre-Stamm mit der weit verbreiteten Cre Expression über den interessierenden Zelltyp zu identifizieren. Es ist auch wichtig, um eine eingehende Charakterisierung der Expressionsmuster von LINC komplexe Bauteile während der Entwicklung des Systems von Interesse durchzuführen. Tatsächlich ist ein Nachteil der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mausmodell, dass es keine Informationen darüber, welche Proteine oder Sun Nesprine Varianten sind in biologischem System under Überlegung. Allerdings kann dieses Problem durch Durchführung einer strengen Charakterisierung sowohl auf Transkript und Protein-Ebene überwunden werden. In der Tat haben solche Untersuchungen bei mehreren Gelegenheiten, die während der Entwicklung des ZNS, um wichtige Erkenntnisse über die Rolle von spezifischen LINC komplexen Bauteilen geführt und Homöostase 21,22 unternommen.
Schließlich, während dieses Protokoll beruht auf der Verwendung von festen ZNS-Gewebe fokussiert können Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mäuse verwendet werden, zu isolieren und Kultur primären Zellen, um die Wirkung der Störung LINC-Komplexe in vitro zu studieren. Unter Verwendung dieses Schemas ist es möglich, die Isolierung und Reinigung von Primärkulturen von EGFP-KASH2 positive Zellen für Anwendungen wie Zeitraffervideomikroskopie. Dies umgeht geringen Transfektionseffizienzen oder lentiviralen Produktion für Primärkultur-Systeme erforderlich, wie Neuronen.
Zusammenfassend eröffnen die Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mäusen, neue und spannende Möglichkeiten, um den Spaß zu studierenRésol des LINC-Komplexen in vivo während der embryonalen und postnatalen Säuger Entwicklungsvorgänge in einer Vielzahl von Geweben und Zelltypen zu grundlegenden Zellbiologie Fragen anzugehen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Mitarbeitern der Morphologie und Imaging-Kern, der Molekulargenetik Kern (Abteilung für Augenheilkunde und Visual Sciences) und der Mausgenetik Kern an der Washington University in St. Louis School of Medicine. Die Autoren werden von der kleinen Zuschuss-Programm von der McDonnell Zentrum für Zelluläre und Molekulare Neurobiologie, der Hoffnung Zentrum für Neurologische Störungen unterstützt das National Eye Institute (# R01EY022632 zu DH), ein National Eye Institute zentralen Kern Grant (# P30EY002687) und eine zweckgebundene Zuwendung der Forschung, um Blindheit zu der Augenklinik und Visual Sciences verhindern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
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