Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ניתוח הכנת photoacoustic של כלי רכב ניידים המכילים Nanorods הזהב

Published: May 2, 2016 doi: 10.3791/53328
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 3, 4, 1, 1
1Institute of Applied Physics, Italian National Research Council, 2Department of Experimental and Clinical Biomedical Sciences, University of Florence, Firenze, 3Department of Physics and Astronomy, University of Florence, Sesto Fiorentino, 4Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna

Abstract

nanorods זהב הם אטרקטיבי עבור מגוון של יישומים ביו, כגון אבלציה photothermal ואת הדמית photoacoustic של סרטן, הודות ספיג האופטי האינטנסיבית שלהם בחלון האינפרה-אדום קרוב, cytotoxicity הנמוך ופוטנציאל הביתה לתוך גידולים. עם זאת, ומסירתם גידולים עדיין בעיה. גישה חדשנית מורכבת של הניצול של הכמיהות של מקרופאגים גידולים הקשורים שעשויות להיות עמוסות nanorods זהב במבחנה. כאן, אנו מתארים את ההכנה ובדיקת photoacoustic של כלי רכב הסלולר המכילים nanorods זהב. nanorods זהב PEGylated הם שונים עם תרכובות אמוניום רבעונים, על מנת להשיג פרופיל קטיוני. במגע עם מקרופאגים בעכברים בצלחות פטרי רגילים, חלקיקים אלה נמצאים לעבור ספיגת מסיבית לתוך שלפוחית ​​endocytic. ואז התאים האלה מוטבעים הידרוג biopolymeric, אשר משמשים כדי לוודא את יציבות מרת photoacousticשל החלקיקים נשמר הכליל לתוך כלי רכב הסלולר. אנו בטוחים כי התוצאות הללו עשויות לספק השראה חדשה לפיתוח אסטרטגיות רומן כדי לספק חלקיקי plasmonic לגידולים.

Introduction

במהלך העשור האחרון, חלקיקים plasmonic שונים כגון nanorods זהב, nanoshells ו nanocages, קיבלו תשומת לב רבה עבור יישומים באופטיקה ביו 1, 2, 3, 4. המנוגדים nanospheres זהב רגיל, חלקיקים החדשים אלה מהדהדים האינפרה האדום הקרוב (NIR) חלון המספק לחדירה אופטית עמוקה דרך הגוף והניגודיות הגבוהה ביותר האופטית לגבי מרכיבי אנדוגני 1. תכונה זו עוררה עניין עבור יישומים חדשניים, כגון הדמיה photoacoustic (PA) ואת אבלציה photothermal של סרטן. עם זאת, כמה בעיות לרסן את החדירה הקלינית של חלקיקים אלה. לדוגמא, ההפעלה האופטית שלהם נוטה לגרום להתחממות היתר שלהם לשנות צורות הפעילות שלהן כלפי פרופילים כדוריים יותר, אשר נוהג photoinstability 5, 6, 7, 8 sup>, 9. סוגיה נוספת ששולטת הדיון המדעי היא המשלוח המערכתי שלהם לתוך גידולים. בפרט, nanorods הזהב לשלב גדל כי הם אידיאליים כדי למלא גידולים ההציג חדיר ושימור משופר וקלות נטייה עם בדיקות ספציפיות של סמנים ממאירים. לכן, בעריכתם עבור הזרקה ישירה לתוך זרם הדם נתפסת ערכה ריאלית 10, 11, 12, 13. עם זאת, המסלול הזה נותר בעייתי, עם רוב של החלקיקים ייפלו בשבי על ידי מערכת תָא בַּלעָן mononuclear 10, 11, 12. בנוסף, דאגה נוספת היא היציבות האופטית ביוכימיים של החלקיקים לאחר במחזור דרך הגוף 14. כאשר חלקיקים לאבד יציבות קולואידים שלהם המצרפי, תכונות plasmonic שלהם ואת הדינמיקה העברת חום עלולים לסבול צימוד plasmonic 15, 16, 17 ו צולב התחממות יתר 18.

לאחרונה, את הרעיון לנצל את הכמיהות של מקרופאגים גידולים הקשורים התפתח 19 חלופה חכמה, 20, 21. תאים אלה להחזיק יכולת מולדת לזהות לפעפע גידולים עם סגוליות גבוהות. לכן, נקודת מבט אחד יכול להיות לבודד תאים אלה מחולה, לטעון אותם עם nanorods זהב במבחנה ואז מזריקים אותם בחזרה לתוך המטופל, מתוך כוונה להשתמש בהם ככלי רכב הסלולר אחראי על משלוח. יתרון נוסף יהיה להשיג שליטה רבה יותר על היציבות האופטית ביוכימיים של החלקיקים, כי הממשק הביולוגי שלהם יהיה בנוי במבחנה. ובכל זאת, ההופעות של רכבים הסלולר אלה כסוכנים בניגוד אופטיים צריכים ניתוח ביקורתי.

בעבודה זו, אנו מתארים את ההכנה ונושאים קריטיים של Cellulכלי רכב ar המכיל nanorods זהב עבור הדמיה של סרטן הרשות. Nanorods זהב PEGylated הם שונה עם תרכובות אמוניום רבעוני 22, על מנת להשיג פרופיל קטיוני כי צפוי לקדם את האינטראקציה שלהם עם ממברנות plasmatic 23, 24. חלקיקים אלו עוברים ספיגים יעילים נוקבים מרוב סוגי הסלולר, בתקווה בלי להתערב הרבה עם התפקודים הביולוגיים שלהם. מקרופאגים Murine עמוסים עד כמה שרק 200, 000 nanorods זהב קטיוני לכל תא, אשר הופכים ותחומה בין שלפוחית ​​endocytic חזק. תצורה זו צריכה להתעורר דאגה, בגלל האיום של צימוד plasmonic ו-התחממות יתר צלב בתוך שלפוחית ​​אלה. לכן, מקרופאגים מוטבעים הידרוג biopolymeric המחקים רקמות ביולוגיות, על מנת לוודא כי מרבית יציבות גיור PA של החלקיקים נשמרים בהעברה ממדיום הצמיחה אל שלפוחית ​​endocytic. אפקקריטריונים למדידת e הם הסתדרו על מנת למדוד את היציבות של מרת רשות בתנאים של ריבית מיידית הדמית רשות. סף חיטוב מוגדר בתחילת מאוד של חוסר יציבות אופטי לאחר הרכבת של 50 פעימות לייזר עם שיעור החזרה טיפוסי של 10 הרץ.

אנו בטוחים כי תוצאות אלו עשויות לספק תנופה לפיתוח אסטרטגיות רומן כדי לספק חלקיקי plasmonic לגידולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל ריכוזי nanorods זהב מבוטאים במונחים של molarities Au הנומינלי. לשם השוואה עם יצירות אחרות, לב 1 M Au בערך מקביל ל -20 מיקרומטר nanorods זהב, במקרה שלנו.

1. הכנת קטיוני זהב Nanorods

הערה: השיטה מתחילה עם הסינתזה של ברומיד cetrimonium (CTAB) nanorods זהב -capped ידי הפחתתם autocatalytic של HAuCl 4 עם חומצה אסקורבית, על פי הפרוטוקול שהנהיג Nikoobakht ואח 25 והותאם על פי Ratto ואח 26... ואז nanorods זהב אלה שונו על מנת לקבל יותר התאמה ביולוגית וזיקה ממברנות plasmatic, על ידי שילוב של פוליאתילן גליקול קווצות 10, 11, 27, 28 ו תרכובות אמוניום רבעוני 22.

  1. לטהר 24 מ"ל nanorods זהב הכתיר CTAB בכל concentration של 450 מיקרומטר Au ידי שני מחזורים של צנטריפוגה (12,000 XG, 30 דק ') ו decantation. ודא כי היחס בין נפח מת נפח ראשוני הוא סביב 1/200 או נמוך יותר עבור כל הצעדים צנטריפוגה בפרוטוקול זה. השתמש 500 מיקרומטר מימית CTAB כפתרון כביסה ולבסוף להעביר את חלקיקי למאגר 6 מ"ל 100 מ"מ אצטט ב- pH 5 המכיל 500 מיקרומטר CTAB ו 0.005% (v / v) polysorbate 20.
  2. הוסף 30 μl 10 מ"מ מימית אלפא-methoxy-אומגה mercapto-פולי (אתילן גליקול) (MW ~ 5,000) ולהשאיר להגיב במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. הוסף 30 μl 100 מ"מ (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N ברומיד -trimethylammonium ב sulfoxide דימתיל ולהשאיר במנוחה למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר מכן, להוסיף 18 מ"ל 0.005% (v / v) polysorbate 20 במים ולטהר חלקיקים אלה על ידי ארבעה מחזורים של צנטריפוגה (12,000 XG, 30 דק ') ו decantation. השתמש 0.005% (v / v) polysorbate 20 במים כפתרון כביסה ולבסוף להעביר חלקיקים לתוך 2.4 מ"ל סטרילי PBS ב- pH7.4. הריכוז הנומינלי הסופי של זהב הוא 4.5 מ"מ.

2. טוען של Murine המקרופאגים עם Nanorods זהב

  1. השתמש מונוציטים / שורת תאים macrophagic J774a.1 ו DMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברית, 1 מ"מ גלוטמין, 100 יחידות / פניצילין מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין כמדיום תרבות. פלייט 5 x 10 5 תאים בארבע צלחות פטרי של 60 מ"מ קוטר ולאפשר להם לגדול במשך 24 שעות, כדי להיות subconfluent בעת ניתוק (ראה שלב 2.2).
    1. לאורך כל הפרוטוקול, לשמור על התאים בתנאי תרבות סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, אוויר 95% ו -100% לחות יחסית). השתמש בארון זרימה למינרית וציוד מגן אישי מתאים כדי לתפעל את התאים.
  2. לאחר 24 שעות, לטעון את התאים עם nanorods זהב קטיוני ולהכינם להיות מוטבע לתוך סרטים chitosan:
    1. על מנת לאפשר את החלקיקים להיות נלקחים על ידי התאים, להוסיף aliquot של 4.5nanorods זהב מ"מ Au קטיוני ב- PBS לתוך כל צלחת פטרי, כדי להשיג ריכוז סופי של 100 מיקרומטר Au. השאר את צלחות פטרי ב דגירה במשך 24 שעות.
    2. לאחר מכן, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר בתנאים הטובים שלהם ואת ההעלאה. תאים צריכים להפגין המורפולוגיה שלהם נורמלית מספר שלפוחית ​​תאיים כהה. לנתק את התאים על ידי מגרד, למזג אותם משתי צלחות פטרי, על מנת להשיג כמות מתאימה של תאים עבור השלבים הבאים (לפחות 2 x 10 6 תאים), צנטריפוגות אותם (120 XG, 6 דק ') לחסל את כל עודף של nanorods זהב קטיוני. גלולת הסלולר צריכה להיראות כמעט שחורה.
    3. להשעות גלולה ב 2 מ"ל PBS ולספור את התאים על ידי שימוש בתא "שודד גופות. צנטריפוגה ההשעיה המכיל 2 x 10 6 תאים (120 XG, 6 דק ') ולתקן גלולה שלהם ב 2 מ"ל 3.6% (w / v) הפורמלין PBS במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, לשטוף גלולה זו שלוש פעמים על ידי centrifugatיון (120 XG, 6 דק ') על מנת להסיר את המקבע. השתמש PBS כפתרון כביסה.

3. Embedment של המקרופאגים לתוך סרטי Chitosan

הערה: את התכונות המוזרות של chitosan 26, 27, 28, 29 מנוצלים להפקת רוחות רפאים ביומימטי המכיל מקרופאגים מוכתמים nanorods זהב קטיוני. עם כל הכבוד הידרוג'ל אחרים כגון agarose, chitosan מאפשר סרטים חזקים הרבה יותר רזה, שהוא קריטי עבור הרשות מיקרוסקופיה 6. הייצור של רוחות רפאים אלה מתבצע על פי פרוטוקולים קודמים 29, 30, 31 עם כמה שינויים כקבועים שמקיף 30.

  1. הכן acidified (pH 4.5, מתקבל על ידי תוספת של חומצה אצטית) ו-% 3 צמיגה (w / v) chitosan משקל מולקולרי נמוך פתרון (ממוצע MW 120 KDA), ביסודיות לערבב אותותן לזה homogenize במשך 24 שעות ב 40 מעלות צלזיוס.
  2. לאחר מכן, לערבב מקרופאגים בעכברים המכיל nanorods זהב קטיוני (2 x 10 6 תאים) עם 500 μl של פתרון chitosan.
  3. כדי להשיג ~ 50 מיקרומטר רוחות רפאים עבה, יוצקים 250 מ"ג של התערובת לתוך תבניות קלקר 1.91 ס"מ 2 ולהשאיר אותם תחת זרם חנקן למשך 24 שעות. לאחר מכן, לטפל דגימות אלה עם 500 μl 1 M NaOH, על מנת לגרום cross-linking, ולשטוף אותם עם 10 מ"ל מים ultrapure.

4. מבחן של היציבות של מרת photoacoustic

הערה: יציבות גיור הרשות נחקרה באמצעות ניסויי רשות עם התקנת תוצרת הבית מתוארת נ"צ 6.

  1. להשעות סרט chitosan המכיל את מקרופאגים במים DI, למשל על ידי שימוש בעל פלסטיק שקוע בתוך צלחת פטרי, כדי לשמור על מרחק של ~ 5 מ"מ מתחתית הצלחת. שם צלחת זה על במת XY מיקרומטרעל מנת לשלוט על המיקום המדגם.
  2. פוקוס קרן לייזר עם ~ 5 NSEC הדופק משך בתהודה עם הלהקה plasmonic האורך של nanorods זהב (למשל, מ מתנד פרמטרי אופטי שאוב על ידי הרמוני השלישי של Nd ממותגת Q: YAG לייזר עם טווח אורכי גל של 400 - 2,500 משך ננומטר והדופק של 5 NSEC) בניצב לפני השטח הסרט עם קוטר הנקודה ~ 300 מיקרומטר.
    1. הוסף מחליש מול היציאה לייזר כדי לכוון את השטף לייזר להשתמש במפצל קרן להתמקד חלק את קרן הלייזר מד האנרגיה תנודות השטף (למשל, pyroelectric גלאי) ולעקוב אחר. שמירה על השטף אופטי מתחת ~ 1 mJ / 2 ס"מ לכל הדופק במהלך יישור. השתמש משקפי בטיחות לייזר מתאים בכל עת הלייזר פועל.
  3. טובלים מתמר אולטרסאונד (תדר בתחום של 1 - 20 מגה-הרץ) לתוך צלחת פטרי ~ 2 מ"מ מעל פני השטח הסרט ולהתאים את עמדתה באמצעות תרגומים מיקרומטרושלבי סיבוב על מנת למקסם את אות רשות נפלטים מהסרט.
  4. לקבוע שטף בדיקה F LO שאינו ניזק המדגם 6:
    1. מקרינים נקודה אקראית של מדגם בכל השטף סביב 1 mJ / 2 ס"מ לכל הדופק ל -500 פעימות לפחות. עבור כל דופק, לרכוש את אות רשות התואמים מתוך מתמר אולטרסאונד שטף ליזר ממונה האנרגיה עם אוסצילוסקופ. תן שם שטף הממוצע כמו במשפט F LO.
    2. חשב את עוצמת האות הרש"פ שיא-לשיא המשרעת שלה כפונקציה של מספר דופק. כדי משקל נגד תנודות עוצמת הלייזר, לנרמל את המשרעת של כל אות הרשות ליחס של השטף משלה לדין F LO. לנתח את המגמה של עוצמת הרשות מנורמלת כפונקציה של מספר דופק ולוודא את יציבותו לאורך זמן.
    3. במקרה של חוסר יציבות, חזור על שלבים 4.4.1 עד 4.4.3 עם ערך נמוך יותר של F LO ניסוי F LO הגבוה ב ~ 10%, עד אובדן היציבות מתעורר. הגדר את החללית השטף F LO כערך השני בגובהו של ניסוי F LO המבטיח יציבות.
  5. מדוד שטף סף חיטוב:
    1. בחר אחר נקודה אקראית של המדגם לחקור באינטנסיביות רשות ממוצע (א לי LO) מעל 500 פעימות ב F LO.
    2. הגדרת שטף נומינלי גדול מ F LO ולספק 50 פולסים. שם השטף הממוצע שלהם כמו EXC F.
    3. נסה לעורר בעצמת רשות ממוצע (B I LO) מעל 500 פעימות ב F LO שוב. חשב את R יחס = אני LO ב / I LO א. ערך של R מתחת אחדות מעיד על שינוי בלתי הפיך של התכונות האופטיות של המדגם.
    4. השתמש הבמה XY מיקרומטר להעביר את הסרט ולשנות את point של המדגם באקראי. חזור על שלבים 4.5.1 עד 4.5.4 עם ערכים שונים של F EXC, כדי לקחת כמה ערכים של R להלן, סביב ומעל האחדות. 15 נקודות הנן סבירות.
    5. R מגרש כפונקציה של EXC F ולזהות את F שטף סף עיצוב מחדש th כמו ערך שכאשר R מתחיל נבדלים זה מעבר אי ודאות סטטיסטית. 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנה, את ההיתכנות של כלי רכב הסלולר המכילים nanorods זהב עבור ההדמיה של סרטן הרשות מוצגת יחד עם תוצאות טיפוסיות של הפרוטוקול.

תמונות TEM באיור 1 להראות את המראה הרגיל של החלקיקים לאחר שלב 1 והרכבים הסלולריים שלהם לאחר שלב 2. ההכנה של החלקיקים של תאי הדמית TEM מתוארת במקומות אחרים 17. nanorods זהב קטיוני לעבור הצטברות מסיבית מקרופאגים, המקיימת מורפולוגיה הנורמלית שלהם. חלקיקים הם מצאו להיות כלוא בתוך שלפוחית ​​endocytic החזקה.

איור 2 א מציג תמונה התמסורת האופטית של מקרופאגים המכיל nanorods זהב קטיוני התפזרו פאנטום chitosan אחרי שלב 3. כפי שהוכח על ידי מיקרוסקופ זה, הכללת הידרוג'ל chitosan עושה לאffect המורפולוגיה הסלולר. תאים הם גם התפזרו ברחבי המדגם. פקדים של סרטי chitosan המכילים nanorods זהב ללא תאים הם הומוגניים. איור 2b מראה כי להקת plasmonic האופיינית nanorods זהב נשמרת כאשר החלקיקים נתפסים על ידי מקרופאגים, עולים בקנה אחד עם המחקרים הקודמים שלנו 14, 32. לכן, תופעות כגון צימוד plasmonic על פרדת שלפוחית ​​endocytic לבין ספיגת הפרש של חלקיקים בעלי גודל וצורה שונים כי לדור בכפיפה אחת בתוך קולואיד polydisperse 28, 33 לא משחקות תפקיד משמעותי הפרוטוקולים הללו. איור 2b גם מוכיח את הכדאיות של chitosan בתור פנטום אופטי.

איור 3 מציג את מגמת R כפונקציה של EXC F נמדדת לפי שלב 4 ונתן מושג על הנתונים ועל הניתוח הנדרשים עבור determination של F th כמו לכל שלב 4.5.5. F ה נמצאה (11 ± 1) mJ / 2 ס"מ בדוגמה זו. מדידות רשות על מדגם זה נתנו אותות עם יחס אות לרעש (SNR) יותר מ -20 כאשר בממוצע לכל 500 פעימות ב כמה mJ / 2 סנטימטר, המספק דיוק גבוה לחקירת ליציבות מרת רשות מכלי הרכב הסלולר.

איור 1
באיור 1. אפיון nanorods ומקרופגים זהב קטיוני a: (650 × 500) ננומטר 2 TEM תמונה של nanorods זהב כמו-מסונתז; B, C ו- D:. בהתאמה (13 × 8.6) מיקרומטר 2, (2.3 × 1.7) מיקרומטר 2 ו (870 × 650) ננומטר 2 תמונות TEM של מקרופאגים שטופלו nanorods זהב קטיוני. הופעתו שלהחלקיקים ד לוח מושפע נטייתן בתא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. אפיון סרט Chitosan a:. תמונת תמסורת אופטית של מקרופאגים המכילים nanorods זהב קטיוני התפזר פנטום chitosan ב:. ספקטרה הכחדה האופטית של רוחות רפאי chitosan המכילים nanorods זהב ללא תאים (קו שחור מוצק, מדגם ביקורת) מקרופאגים המכילים זהב nanorods (שבור קו אדום). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

<img alt = "איור 3" src = "/ files / ftp_upload / 53,328 / 53328fig3highres.jpg" width = "350" />
איור 3. סלולארי רכב photostability. יחס R של העוצמות של I LO נלקחו אחרי ולפני הקרנה בכל F EXC לעומת F EXC. ברי שגיאת מקורם תנודות אות F LO. סף החיטוב מופק נתונים אלה R נופל מתחת אחדות. השורה המוצקה אדום משמשת כמדריך לעין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הרעיון למקד מקרופאגים גידולים הקשורים מתגלה כמושג רב עוצמה כדי להילחם בסרטן 34, 35, 36. כאן, במקום הרס שלהם, תאים אלה מגויסים כרכב הסלולר להביא nanorods זהב לתוך הגידול, על ידי ניצול של כמיהות שלהם. תפיסה זו מחייבת תכנון מתחשב של החלקיקים, השתלבותם התאים והאפיון שלהם. מצאנו כי בצילום של מקרופאגים בעכברים עמוסים nanorods זהב קטיוני אינו סובל מן ההסגר של חלקיקים בתוך שלפוחית ​​endocytic, מה שמרמז כי צימוד plasmonic שלהם חוצה התחממות היתר אינו קריטיים. אנו משערים כי גדילי PEG לבין השכיחות של צורות כי הם מחוץ תהודה, כגון nanospheres זהב, למנוע את החלקיקים להגיע במגע הדוק מדי, שזה בערך בקטרים ​​שלהם 17 (כ -10 ננומטר) ואורך דיפוזיה אחד תרמית (סביב 30 ננומטרב 5 NSEC) עבור צימוד plasmonic ו-התחממות יתר צלב, בהתאמה.

הפרוטוקול הוא חדשני ביחס לשיטות הקיימות בעיצוב של חלקיקים ושל חקירת photostability שלהם. העיצוב של nanorods בזהב לפי צעד 1 משלב את התצפית על ידי et Vigderman al. 22 כי הרביעון תרכובות אמוניום מסוגלים לנהוג ספיגת מסיבית של nanorods זהב לתוך שלפוחית ​​endocytic ואת הרעיון התא חודר סוכנים עם פרופיל קטיוני 24, 37 רשאי מוטבע להיות בתוך PEG לשלם 38 ולהישאר תפקודית, תוך השגת יציבות קולואידים ואת biocompatibility 28. אכן צעד 1 דומה לשיטת יואן ואח '. 38, עם החלפתו של פפטידים חודר לתא עם תרכובות אמוניום רבעונים קטנות וזולות יותר. עם שינויים אלה, nanorods זהב קטיוני הם רב תכליתיים ובר קיימא. השידורים הללו particles נועד כסוכנים בניגוד הדמית רשות, בדיקת רשות היא אידיאלית כדי לבדוק את תכונות הפעילות שלהן. מדידת יציבות גיור רשות על פי ההגדרה של סף חיטוב בשלב 4 היא כמוני לשחזור, שהן תכונות ייחודיות בתוך המסגרת של הספרות המדעית. חוץ מזה, נציין, כי שיטה זו אינה דורשת כיול של ציוד הרשות.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול כוללים הייצור של סרטי chitosan כדי לבדוק את כלי הרכב הסלולר מבחינת יעילותם כסוכנים בניגוד הדמית רשות. Chitosan הינו biopolymer שרשרת ליניארית הכוללת שאריות גלוקוזאמין N -acetyl גלוקוזאמין חברו יחד על ידי קשרים 1,4-glycosidic. תכונות מסוימות physiochemical של chitosan, כגון הגודל הנקבובי שלו, נקבובי תכונות מכאניות, וכן הצדדי הקרבה שלה, להפוך אותו אופציה אידיאלית עבור הייצור של הידרוג בצורת סרטים דקים או ממברנות נקבוביות 29, 39, 40. יתר על כן, את עמוד השדרה פוליסכריד של chitosan היא מבנית דומה glycosaminoglycans, המרכיב העיקרי של המטריצה ​​החוץ-תאית של רקמות החיבור, אשר קידם את השימוש בו biomimetic הנדסה פיגומים תומכת תא 41. בסך הכל, הידרוג chitosan להפגין moduli תרמי אלסטי כי הם נציג של רקמת חיבור 29, 41, 42, אשר הינו אידיאלי עבור בדיקות הרשות. יש להקפיד כדי להשיג סרטים עם בעובי הנכון (50 מיקרומטר), עכירות אופטית נמוכה והומוגניות טובה. ראוי לציין, כי המינונים נתונים בשלב 3 ממוטבים. ההשעיה הצמיגה של מקרופאגים בעכברים ב chitosan צריכה להיות מעורבת בשקידה פי לשלב 3.2. באמצעות הנחיות אלו, הסרטים האלה כבר שימשו להשוות את היציבות של המרה PA של nanorods זהב בגדלים שונים 6.

possiשינויי ble של הפרוטוקול כוללים הכנת nanorods הזהב קטיוני וכלי רכב הסלולר שלבי 1 ו 2. השיטה בשלב 1 עשויה להיות כפופה שיפורים הדרגתיים, למשל, על ידי ההחלפה של הסוכן החודר לתא או אורך PEG גדילים וכו ', על מנת למזער כל הפרעה עם הפיזיולוגיה של מקרופאגים הקשורים הגידול. השימוש הליגנדים ומתאימים עבור מקרופאגים עשוי להיות אופציה 43. פרמטרים אחרים המשפיעים על הספיגה של החלקיקים כוללים גודלם וצורתם 33 וציפוי האורגני שלהם. למשל, פגז של סיליקה עשוי לתת שילוב של הפנמה גבוהה 44, יציבות אופטית נגד צבירה 17 והרשות הפלסטינית יציבות 7, על חשבון תחכום יותר חומר זר יותר. אנו משערים כי מסלול endosomal של הפנמה עלול להיות לכך השפעה משותפת 33, 43, 44 45. בחינה ביקורתית של תאי המשלב 2 מתנהלת ואת הסדר הטוב ביותר של ניגוד אופטי, כדאיות ופעילות chemotactic במבחנה ובחי עשוי עדיין דורש להתאים את המינון של חלקיקי plasmonic מבחינת ריכוז ומשך הדגירה. למרות המורפולוגיה של התאים ואת הראיות הראשוניות בידינו מצביעה על רעילות נמוכה, החקירה בפרמטרים היא מעבר להיקף עבודה זו. מבט אחר יהיה לשחזר צעד 2 עם תאים אחרים של מערכת החיסון 46 תאים ראשוניים, אשר עשוי להיבחר על בסיס כל מקרה לגופו. ואכן, אנו משערים כי הרעיון לווסת את הספיגה של החלקיקים בעלי פוטנציאל אלקטרוקינטיות שלהם היא המגוונת ביותר.

מגבלות של הפרוטוקול כוללות את הצורך להשתמש בתאים קבועים ולא בתאים חיים, כי המרשמים בשלב 3 אינם עולים בקנה אחד עם השמירה על celכדאיות lular. הגבלות אחרות מתייחסות הצורך של SNR מספיק קביעת שטף חללי בשלב 4.4, אשר מיתרגם שילוב מספק של ספיגה ו photostability האופטיים של הסרט.

לסיכום, תארנו פרוטוקול חדשני להכין ולבצע אפיון פונקציונלי של כלי רכב הסלולר כי הם ריאליים כסוכנים בניגוד הדמית photoacoustic. מצאנו כי הנהגת זהב nanorods לתוך מקרופאגים בעכברים אינו משפיע בצילום שלהם באופן שלילי. ההתמקדות של העבודה הנוכחית שלנו היא על הפיסיולוגיה של תאים אלה, עם תשומת לב מיוחדת עבור הכדאיות שלהם ופעילות chemotactic. בעתיד, שיטה זו תיבדק כדי לחקור את הכנת כלי רכב סלולארי שונים המכילים פתרונות שונים של חומר ניגוד אופטי. חללית הרשות עשויה גם לשמש כדי לבדוק את targetability של סוכנים בניגוד אופטיים לתאים ממאירים במבחנה,ללא שימוש בכלי רכב הסלולר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי Regione טוסקנה ואת הקהילה האירופית בתוך מסגרת של BUBBLE Eranet + פרוייקטים lus ו- BI-TRE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hexadecyltrimethylammonium bromide Sigma-Aldrich H6269 To synthesize gold nanorods
Gold(III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918 To synthesize gold nanorods
Silver nitrate Sigma-Aldrich S6506 To synthesize gold nanorods
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960 To synthesize gold nanorods
Sodium borohydride Sigma-Aldrich To synthesize gold nanoseeds
MeO-PEG-SH Iris Biotech PEG1171 To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da.
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan
Sodium acetate Sigma-Aldrich S8750 To PEGylate gold nanorods
(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide Sigma-Aldrich 733305 To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855 To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide
Polysorbate 20 Sigma-Aldrich P2287 To centrifuge PEGylated gold nanorods
PBS Lonza BE17-516F To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells
J774a.1 ATCC TIB-67 Monocyte/macrophage murine cell line
DMEM Lonza BE12-707F Cell culture medium
FBS Lonza DE14-801F To be added to cell culture medium
L-glutamine Lonza BE17-605E To be added to cell culture medium
Penicillin/streptomycin Lonza DE17-602E To be added to cell culture medium
Petri dish NEST 705001 Cell culture dish
Cell scraper EuroClone ES7018 To detach cells
Formaldehyde Fluka 47630 To fix cells
Chitosan, low molecular weight Sigma-Aldrich 448869 75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da.
Sodium hydroxyde Sigma-Aldrich 306576 To insolubilize chitosan and generate the hydrogel
Polystyrene cell culture plates NEST 702011 Used as molds to fabricate chitosan hydrogels
Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser Continuum, Santa Clara, USA Surelite OPO plus Source of optical excitation for photoacoustic tests
Pyroelectric detector  Gentec, Quebec, Canada QE8SP To monitor optical fluence for photoacoustic tests
Pre amplified needle hydrophone Precision Acoustic, Dorset, UK Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range To measure photoacoustic signals

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ratto, F., Matteini, P., Centi, S., Rossi, F., Pini, R. Gold nanorods as new nanochromophores for photothermal therapies. J. Biophotonics. (1-2), 4-41 (2011).
  2. Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41, 2740-2779 (2012).
  3. Hahn, M. A., Singh, A. K., Sharma, P., Brown, S. C., Moudgil, B. M. Nanoparticles as Contrast Agents for in-Vivo Bioimaging: Current Status and Future Perspectives. Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 3-27 (2011).
  4. Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Ther. Deliv. 3 (4), 457-478 (2012).
  5. Manohar, S., Ungureanu, C., Van Leeuwen, T. G. Gold nanorods as molecular contrast agents in photoacoustic imaging: The promises and the caveats. Contrast Media Mol. Imaging. 6 (5), 389-400 (2011).
  6. Cavigli, L., et al. Size Affects the Stability of the Photoacoustic Conversion of Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (29), 16140-16146 (2014).
  7. Chen, L. -C., et al. Enhanced photoacoustic stability of gold nanorods by silica matrix confinement. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016010 (2010).
  8. Ratto, F., et al. CW laser-induced photothermal conversion and shape transformation of gold nanodogbones in hydrated chitosan films. J. Nanopart. Res. 13, 4337-4348 (2011).
  9. Mercatelli, R., et al. Quantitative readout of optically encoded gold nanorods using an ordinary dark-field microscope. Nanoscale. 5 (20), 9645-9650 (2013).
  10. Von Maltzahn, G., et al. Computationally guided photothermal tumor therapy using long-circulating gold nanorod antennas. Cancer Res. 69 (9), 3892-3900 (2009).
  11. Jokerst, J. V., Cole, A. J., Van De Sompel, D., Gambhir, S. S. Gold nanorods for ovarian cancer detection with photoacoustic imaging and resection guidance via Raman imaging in living mice. ACS Nano. 6 (11), 10366-10377 (2012).
  12. Huang, X., et al. A reexamination of active and passive tumor targeting by using rod-shaped gold nanocrystals and covalently conjugated peptide ligands. ACS Nano. 4 (10), 5887-5896 (2010).
  13. Alkilany, A. M., Thompson, L. B., Boulos, S. P., Sisco, P. N., Murphy, C. J. Gold nanorods: Their potential for photothermal therapeutics and drug delivery, tempered by the complexity of their biological interactions. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 190-199 (2012).
  14. Centi, S., et al. In vitro assessment of antibody-conjugated gold nanorods for systemic injections. J. Nanobiotechnology. 12, 55 (2014).
  15. Jain, P. K., Eustis, S., El-Sayed, M. A. Plasmon coupling in nanorod assemblies: Optical absorption, discrete dipole approximation simulation, and exciton-coupling model. J. Phys. Chem. B. 110 (37), 18243-18253 (2006).
  16. Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries. Nano Lett. 9 (4), 1651-1658 (2009).
  17. Mazzoni, M., Ratto, F., Fortunato, C., Centi, S., Tatini, F., Pini, R. Partial Decoupling in Aggregates of Silanized Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (34), 20018-20025 (2014).
  18. Lapotko, D. O., Lukianova, E., Oraevsky, A. A. Selective laser nano-thermolysis of human leukemia cells with microbubbles generated around clusters of gold nanoparticles. Lasers Surg. Med. 38 (6), 631-642 (2006).
  19. Choi, M. R., et al. A cellular trojan horse for delivery of therapeutic nanoparticles into tumors. Nano Letters. 7 (12), 3759-3765 (2007).
  20. Dreaden, E. C., Mwakwari, S. C., La Austin,, Kieffer, M. J., Oyelere, A. K., El-Sayed, M. A. Small molecule-gold nanorod conjugates selectively target and induce macrophage cytotoxicity towards breast cancer cells. Small. 8 (18), 2819-2822 (2012).
  21. Yang, T. D., et al. Real-time phase-contrast imaging of photothermal treatment of head and neck squamous cell carcinoma: an in vitro study of macrophages as a vector for the delivery of gold nanoshells. J. Biomed. Opt. 17 (12), 128003 (2012).
  22. Vigderman, L., Manna, P., Zubarev, E. R. Quantitative Replacement of Cetyl Trimethylammonium Bromide by Cationic Thiol Ligands on the Surface of Gold Nanorods and Their Extremely Large Uptake by Cancer Cells. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 51 (3), 636-641 (2012).
  23. Richard, J. P., et al. Cell-penetrating peptides: A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278 (1), 585-590 (2003).
  24. Delehanty, J. B., Boeneman, K., Bradburne, C. E., Robertson, K., Bongard, J. E., Medintz, I. L. Peptides for specific intracellular delivery and targeting of nanoparticles: implications for developing nanoparticle-mediated drug delivery. Ther. Deliv. 1, 411-433 (2010).
  25. Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods (NRs) using seed-mediated growth method. Chem. Mater. 15 (10), 1957-1962 (2003).
  26. Ratto, F., Matteini, P., Rossi, F., Pini, R. Size and shape control in the overgrowth of gold nanorods. J. Nanopart. Res. 12 (6), 2029-2036 (2009).
  27. Niidome, T., et al. PEG-modified gold nanorods with a stealth character for in vivo applications. J. Control. Release. 114 (3), 343-347 (2006).
  28. Tatini, F., et al. Size dependent biological profiles of PEGylated gold nanorods. J. Mater. Chem. B. 2, 6072-6080 (2014).
  29. Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., Centi, S., Dei, L., Pini, R. Chitosan films doped with gold nanorods as laser-activatable hybrid bioadhesives. Adv. Mater. 22 (38), 4313-4316 (2010).
  30. Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., de Angelis, M., Cavigli, L., Pini, R. Hybrid nanocomposite films for laser-activated tissue bonding. J. Biophotonics. 5 (11-12), 868-877 (2012).
  31. Matteini, P., Tatini, F., Cavigli, L., Ottaviano, S., Ghini, G., Pini, R. Graphene as a photothermal switch for controlled drug release. Nanoscale. 6, 7947-7953 (2014).
  32. Ratto, F., Witort, E., et al. Plasmonic Particles that Hit Hypoxic Cells. Adv. Funct. Mater. 25 (2), 316-323 (2015).
  33. Chithrani, D. B. Intracellular uptake, transport, and processing of gold nanostructures. Molec. Membrane Biol. 27 (7), 299-311 (2010).
  34. Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73 (3), 1128-1141 (2013).
  35. Mantovani, A., Allavena, P. The interaction of anticancer therapies with tumor-associated macrophages. J. Exp. Med. 212 (4), 435-445 (2015).
  36. Panni, R. Z., Linehan, D. C., DeNardo, D. G. Targeting tumor-infiltrating macrophages to combat cancer. Immunotherapy. 5 (10), 1075-1087 (2013).
  37. Oh, E., et al. Cellular uptake and fate of PEGylated gold nanoparticles is dependent on both cell-penetration peptides and particle size. ACS Nano. 5 (8), 6434-6448 (2011).
  38. Yuan, H., Fales, A. M., Vo-Dinh, T. TAT peptide-functionalized gold nanostars: Enhanced intracellular delivery and efficient NIR photothermal therapy using ultralow irradiance. J. Am. Chem. Soc. 134 (28), 11358-11361 (2012).
  39. Ladest, S., Fales, A. M., Domard, A. Multi-membrane hydrogels. Nature. 452, 76-79 (2008).
  40. Matteini, P., et al. Photothermally activated hybrid films for quantitative confined release of chemical species. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 52, 5956-5960 (2013).
  41. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  42. Kennedy, L. C., et al. T cells enhance gold nanoparticle delivery to tumors in vivo. Nanoscale Res. Lett. 6 (1), 283 (2011).
  43. Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. J. Nanopart. Res. 9 (6), 1109-1124 (2007).
  44. Jokerst, J. V., Thangaraj, M., Kempen, P. J., Sinclair, R., Gambhir, S. S. Photoacoustic imaging of mesenchymal stem cells in living mice via silica-coated gold nanorods. ACS Nano. 6 (7), 5920-5930 (2012).
  45. Ding, H., et al. Gold nanorods coated with multilayer polyelectrolyte as contrast agents for multimodal imaging. J. Phys. Chem. C. 111 (34), 12552-12557 (2007).
  46. Esposito, G., et al. et al. In vivo laser assisted microvascular repair and end-to-end anastomosis by means of indocyanine green-infused chitosan patches: A pilot study. Lasers Surg. Med. 45 (5), 318-325 (2013).

Tags

Bioengineering גיליון 111 חלקיקים Plasmonic nanorods זהב Chitosan כלי רכב נייד המקרופאגים מיקרוסקופיה photoacoustic photostability
ניתוח הכנת photoacoustic של כלי רכב ניידים המכילים Nanorods הזהב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cavigli, L., Tatini, F., Borri, C.,… More

Cavigli, L., Tatini, F., Borri, C., Ratto, F., Centi, S., Cini, A., Lelli, B., Matteini, P., Pini, R. Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods. J. Vis. Exp. (111), e53328, doi:10.3791/53328 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter