Abstract
Altın nanorods, tümörlere eve yakın kızıl ötesi pencere, düşük sitotoksisite ve potansiyeline yönelik yoğun optik absorbans sayesinde bu tür fototermal ablasyon ve kanser foto akustik görüntüleme gibi biyomedikal uygulamalarda, bir dizi için caziptir. Ancak, tümörlere onların teslim hala bir sorun olmaya devam etmektedir. Yenilikçi bir yaklaşım, in vitro olarak, altın nanoçubuklar ile yüklenebilir tümörle ilişkili makrofaj tropizm yararlanılmasının oluşur. Burada, hazırlık ve altın nanorods içeren hücresel araçların foto akustik muayene açıklar. PEG'lenmiş altın nanorods bir katyonik profilini elde etmek için, dördüncü derece amonyum bileşikleri ile modifiye edilir. Sıradan Petri tabaklarında sıçangil makrofaj ile temas, bu parçacıklar endositik vezikülleri içine büyük alımını uğradıkları bulunmuştur. Daha sonra, bu hücreler, doğrulamak için kullanılır biyopolimer hidrojeller, gömülü olduğu foto akustik dönüşüm stabilitesiparçacıkların hücre araç içine dahil edilmesi de muhafaza edilir. Biz bu sonuçları tümörlere plasmonik parçacıklar sunmak için yeni stratejilerin geliştirilmesi için yeni ilham sağlayabilir eminiz.
Introduction
Geçtiğimiz on yıl içinde, bu tür altın nanoçubuklar, nanoshells ve nanocages gibi çeşitli plasmonik parçacıklar, biyomedikal optik 1, 2, 3, 4 uygulamaları için önemli bir ilgi görmüştür. Standart altın nanokürecikler uymayacak, bu yeni parçacıklar vücuda derin optik penetrasyon ve endojen bileşenler üzerinde 1 yüksek optik kontrast sağlar yakın kızılötesi (NIR) penceresinde yankı. Bu özellik, foto akustik (PA) görüntüleme ve kanser fototermal ablasyonu gibi yenilikçi uygulamalar için ilgi uyandırdı. Ancak, çeşitli konularda bu parçacıkların klinik nüfuz dizginlemek. Örneğin, optik aktivasyonu, 8 aşırı ısınma indükleme ve foto-5, 6, 7 sürücüler daha küresel profilleri karşı işlevsel şekilleri değiştirme eğilimi sup>, 9. Bilimsel tartışma hakim bir başka konu tümörlerinde sistemik teslim olduğunu. Özellikle, altın nanorods gelişmiş geçirgenliği ve tutma ve malign belirteçlerinin spesifik problar ile konjugasyon kolaylığı göstermek tümörleri yayılmak için ideal boyutları birleştirir. Bu nedenle, kan akışına direkt enjeksiyon için bunların hazırlanması uygun bir şema 10, 11, 12, 13 olarak görülmektedir. Partiküllerin en mononükleer fagosit sisteminin 10, 11, 12 tarafından yakalanan olma ile Bununla birlikte, bu yol, bir problem teşkil etmektedir. Buna ek olarak, başka bir sorun gövdesi 14 boyunca dolaşım sonra parçacıkların, optik ve biyokimyasal stabilitesidir. Parçacıklar kolloidal kararlılık ve agrega kaybetmek, onların plasmonik özellikleri ve ısı transferi dinamikleri plasmonik kavrama 15 muzdarip olabilir, 16, 17 ve yukarı 18 çapraz aşırı ısınma.
Daha yakın zamanlarda, tümör ile ilişkili makrofaj tropizminin yararlanmaya kavramı akıllı alternatif 19, 20, 21 olarak ortaya çıkmıştır. Bu hücreler tespit etmek ve yüksek özgüllük ile tümörlerin yayılmak için doğuştan gelen bir yetenek tutun. Bu nedenle, bir perspektif, bir hastadan alınan bu hücreleri izole in vitro altın nanoçubuklar ile onlara yük ve daha sonra teslim sorumlu hücresel araçlar olarak kullanmak amacı ile, hastaya geri enjekte etmek olabilir. Diğer bir avantajı biyolojik arayüz in vitro inşa edilecek, çünkü parçacıkların optik ve biyokimyasal istikrar üzerinde daha fazla kontrol sahibi olacaktır. Yine, optik kontrast ajanları olarak bu hücresel araçların performansları kritik bir ihtiyaç analizi.
Bu çalışmada, hazırlık ve cellul kritik sorunlar anlatılmaktadırkanser PA görüntüleme altın nanorods AR içeren araçlar. PEG'lenmiş altın nanorods plazma membranları 23, 24 ile etkileşimi teşvik etmek için beklenen bir katyonik profilini elde etmek için, dördüncü derece amonyum bileşikleri 22 ile modifiye edilmiştir. Bu parçacıklar, umarım onların biyolojik fonksiyonları ile çok engel olmadan, en hücresel türlü verimli ve belirsiz alımını tabi. Murin makrofajlar kadar sıkı endositik veziküller içinde sınırlı hale hücre başına kadar 000, 200 gibi katyonik altın nanoçubuklar e yüklenir. Bu yapılandırma nedeniyle bu veziküller içinde plasmonik bağlantı ve çapraz aşırı ısınma tehdidi, endişe ortaya olmalıdır. Bu nedenle, makrofajlar parçacıkların PA dönüşüm stabilitesi en endositik vesiküller büyüme ortamından transfer muhafaza olduğunu doğrulamak için, biyolojik dokuların taklit biyopolimer hidrojeller gömülür. effective ölçüm kriterleri PA görüntüleme için acil ilgi koşullarında PA dönüşüm istikrarı ölçmek amacıyla dışarı işlenmiştir. Şekillendirme eşiği 10 Hz tipik tekrarlama oranı 50 lazer puls dizileri sonra optik instabilite ait başlangıç ayarlanır.
Biz bu sonuçları tümörlere plasmonik parçacıklar sunmak için yeni stratejilerin geliştirilmesi için ivme sağlayabilir eminiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Altın nanoçubuklar tüm konsantrasyonlar, nominal Au molarite cinsinden ifade edilmiştir. diğer eserlerle karşılaştırma için, 1 M Au kabaca bizim durumumuzda, 20 uM altın nanoçubuklar karşılık unutmayın.
Katyonik altın nanorods hazırlanması 1.
Not:.. Metodu ratto diğ 26 uyarınca Nikoobakht ve arkadaşları 25 tarafından ortaya uyarlanmış protokole göre, askorbik asit HAuCl 4 otokatalitik azaltılması ile setrimonyum bromür (CTAB) -kapaklı altın nanoçubuklar sentezi ile başlar. Daha sonra, bu altın nanorods polietilen glikol kombinasyonu ile, plazma membran daha fazla biyo-uyumluluk ve afinite elde etmek için modifiye edilmiş olan, 10, 11, 27, 28 iplik ve dörtlü amonyum bileşikleri, 22.
- Bir concentratio 24 mi CTAB-başlıklı altın nanorods saflaştırmakİki santrifüj devir (12.000 xg, 30 dakika) ve boşaltma ile 450 uM Au n. İlk hacmine ölü hacim oranı bu protokoldeki tüm santrifüj adımları için yaklaşık 1/200 veya daha düşük olduğundan emin olun. çamaşır çözeltisi olarak 500 uM, sulu CTAB kullanımı ve son olarak, 500 uM CTAB ve% 0.005 (h / h) polisorbat 20 ihtiva eden, pH 5 ve 6 ml 100 mM asetat tampon içine partiküller aktarırlar.
- 30 ul 10 mM sulu a-metoksi-omega-merkapto-poli (etilen glikol) (MW ~ 5000) ekleyin ve 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca tepkimeye bırakın.
- Dimetil sülfoksit, N, N, N-trimetilamonyum bromür ve 37 ° C'de 24 saat süre ile geri kalanı bırakın - 30 ul 100 mM (11 Mercaptoundecyl) ekleyin.
- Daha sonra, dört adet santrifüj devir (12.000 xg, 30 dakika) ve boşaltma ile bu parçacıkları su içinde 18 mL% 0.005 (h / h) polisorbat 20 ilave edilmesi ve saflaştırılması. Yıkama solüsyonu olarak suda% 0.005 (h / h) polisorbat 20 kullanımı ve son olarak pH 2.4 ml steril PBS içine partikülleri transferi7.4. altın nihai nominal konsantrasyonu 4.5 mM'dir.
Altın nanorods ile Fare Makrofagların 2. Yükleme
- J774a.1 DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 1 mM glutamin, 100 birim / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin gibi kültür ortamı ile takviye edilmiş monosit / makrofajik hücre çizgisi kullanarak. Levha 5 x 10 5 60 mm çapında dört Petri çanağında hücreleri ve ayrılma sırasında alt konfluent edilecek şekilde bunları 24 saat boyunca büyümeye izin (adım 2.2).
- Protokol boyunca, standart kültür koşulları (37 ° C,% 5 CO2,% 95 hava ve% 100 görece nem) altında hücreleri korumak. hücreleri manipüle etmek için bir laminer akış kabini ve uygun kişisel koruyucu donanımları kullanın.
- 24 saat sonra, kitosan filmlerin içine gömülü katyonik altın nanoçubuklar hücreleri yük ve onları hazırlamak:
- partiküller hücreler tarafından alınır izin vermek üzere, 4.5 bir kısım ilaveHer bir Petri kabı içine PBS mM Au katyonik altın nanorods, 100 uM Au bir son konsantrasyon elde edecek şekilde. 24 saat inkübasyondan petri tabaklara bırakın.
- Sonra, onların iyi koşullar ve yükleme onaylamak için bir optik mikroskop altında hücreleri gözlemlemek. Hücreler, normal morfoloji ve koyu hücre içi veziküller bir dizi sergilemesi gerekir. Aşağıdaki adımlardan (en az 2 x 10 6 hücre) için bir hücre, uygun bir miktarda elde etmek için, iki Petri tabaklarına gelenler birleştirme bir kazıyıcı hücreleri ayırın ve bir ortadan kaldırmak için bunların (120 xg, 6 dakika) santrifüj katyonik altın nanoçubuklar fazlalığı. Hücresel pelet neredeyse siyah bakmak gerekir.
- 2 ml PBS içinde pelet askıya alma ve bir Bürker odasının kullanılmasıyla hücreleri sayın. Santrifüj 2 x 10 6 hücre (120 xg, 6 dakika) ve oda sıcaklığında on dakika süreyle PBS içinde formaldehid (w / v), 2 ml% 3.6 içindeki pelet tamir ihtiva eden bir süspansiyon. Son olarak, centrifugat bu pelet üç kez yıkayınİyon fiksatif çıkarmak için (120 xg, 6 dakika). yıkama çözeltisi olarak PBS kullanın.
Kitosan Films içine Makrofagların 3. yerleştirilmesinin
Not: kitosan 26, 27, 28 kendine özgü özellikleri, 29 katyonik altın nanoçubuklar ile boyanmış makrofajlar içeren biomimetic hayaletleri üretmek için istismar edilmiştir. Örneğin agaroz gibi hidrojeller ile ilgili olarak, kitosan PA mikroskopi 6 için kritik olan daha kuvvetli ve daha ince olan filmler, sağlar. Bu fantomların imalat mi protokolleri 29, 30, aşağıda belirtilen 30 belirtilen bazı değişikliklerle, 31 uygun olarak gerçekleştirilir.
- Bir asidifiye (asetik asit ilave edilerek elde edilen pH değeri 4.5) ve yapışkan% 3 Hazırlama düşük molekül ağırlıklı çitosan (w / v) (ortalama MW 120 kDa) çözeltisi, iyice karıştırın ve40 ° C'de 24 saat boyunca homojenize edilmiştir.
- Daha sonra, çitosan solüsyonu 500 ul olan katyonik altın nanorods (2 x 10 6 hücre) içeren fare makrofajları karıştırın.
- , ~ 50 mikron kalınlığında hayaletleri elde 1.91 cm2 polistiren kalıplara karışımından 250 mg dökün ve 24 saat süre ile bir azot akımı altında bırakmak için. Daha sonra, çapraz bağlama uyarmak için, 500 ul 1 M NaOH ile, bu örnekler tedavi ve ultra saf su ve 10 ml ile yıkayın.
Foto akustik Dönüşüm stabilitesi 4. Test
Not: PA dönüşüm stabilitesi ref 6'da anlatılan ev yapımı kurulum PA deneyler vasıtasıyla incelenmiştir.
- plaka tabanından ~ 5 mm mesafe tutacak şekilde, bir Petri kutusu içine daldırılmış bir plastik tutucu kullanılması ile, örneğin DI su içinde makrofajlar içeren kitosan film askıya alınması. mikrometrik XY sahneye bu tabak koyduÖrnek pozisyonunu kontrol etmek için.
- 2500 - 400 dalga boyu aralığında YAG lazer: Q-anahtarlı Nd üçüncü harmonik tarafından pompalanan bir optik parametrik osilatörden, örneğin altın nanoçubuklar (uzunlamasına plasmonik bant ile rezonans içinde ~ 5 NSEC darbe süresi ile lazer ışını Odak bir ~ 300 mikron nokta çapı film yüzeyine dik 5 nsaniye nm ve darbe süresi).
- Ayarlamak için lazer fluens lazer çıkış önünde bir zayıflatıcı yerleştirin ve akıcılık dalgalanmalarını bir enerji metre (örneğin, bir pyroelektrik dedektör) lazer ışınının bölümünü odaklanmak ve izlemek için bir ışın ayırıcı kullanabilirsiniz. Hizalama sırasında mJ / puls başına cm 2 1 ~ altında optik dozu koruyun. Lazer açık olduğunda uygun lazer güvenlik gözlük kullanın.
- film yüzeyinin kapalı Petri kabı ~ 2 mm içine ve mikrometrik çeviriler kullanarak kendi konumunu ayarlamak - bir ultrason transdüser (20 MHz 1 frekans aralığını) Dipve dönme aşamaları filmden yayılan PA sinyali maksimize etmek.
- Örnek 6 zarar vermez bir prob fluens F LO belirleyin:
- 1 mJ / en az 500 atım için puls başına cm 2 civarında bir akıcılığa numunenin rastgele nokta ışın tedavisi. Her darbe, bir osiloskop ile enerji metre ultrason dönüştürücü ve lazer akıcılığa karşılık gelen PA sinyalini kazanır. F LO deneme olarak ortalama dozu adlandırın.
- Darbe sayısının bir fonksiyonu olarak tepe-tepe genlik olarak PA sinyalin şiddetini hesaplayın. Lazer yoğunluk iniş-çıkışlarını dengelemek için amacıyla, K LO deneme kendi akıcılığa oranı için her bir PA sinyalinin genliğini normalleştirmek. nabız sayısının bir fonksiyonu olarak normalize PA yoğunluğunun eğilimi analiz ve zamanla istikrarı doğrulayın.
- Kararsızlığı durumunda tekrar F LO düşük bir değere sahip 4.4.3 4.4.1 adımları
- Bir şekillendirme eşik fluens ölçün:
- Numunenin başka bir rasgele nokta seçin ve F LO 500 atım üzerinde bir ortalama PA yoğunluğunu (I LO a) prob.
- F LO daha yüksek bir nominal dozu ayarlamak ve 50 darbe teslim. F exc olarak ortalama dozu adlandırın.
- Bir kez daha F LO 500 atım üzerinde bir ortalama PA yoğunluğunu (I LO b) prob. Oranı R = I LO b / I LO hesaplayın. birlik altında R değeri numunenin optik özelliklerinin geri dönüşü olmayan bir değişim kanıtlar verir.
- filmi taşımak için mikrometrik XY sahne kullanın ve poin değiştirmekrastgele numune t. Tekrarlayın ve çevresinde birlik üstünde, altında R birkaç değerlerini almak üzere, F exc farklı değerlerle 4.5.4 için 4.5.1 adımları. 15 puan makul.
- F exc bir fonksiyonu olarak arsa R ve R istatistiksel belirsizlik ötesinde birinden farklı başladığında değer olarak inci yeniden şekillendirilmesi eşik akıcılık F tespit. 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, kanser PA görüntüleme için altın nanorods içeren hücresel araçların fizibilite protokolü tipik sonuçları ile birlikte gösterilmiştir.
Şekil 1 'de TEM resim 2. adımda parçacıkların ve TEM görüntüleme için hücrelerin hazırlanması başka 17 anlatılan sonra, adım 1 sonra parçacıkların ve hücresel araç normal görünümünü gösterir. Katyonik altın nanorods normal morfoloji korumak makrofajlarda büyük bir birikimi, tabi. Parçacıklar sıkı endositik veziküller içinde sınırlı olduğu tespit edilmiştir.
Şekil 2a, katyonik altın nanorods içeren makrofajların bir optik iletim görüntüyü gösterir ve mikrograftaki gösterdiği gibi 3. adımdan sonra bir çitosan hayali olarak dağılmış, çitosan hidrojel dahil edilmesi değilffect hücresel morfoloji. Hücreler, numune boyunca dağıtılır. Hücreleri olmadan altın nanorods ihtiva eden kitosan filmlerin kontrol eder olan homojen. Şekil 2b, parçacıklar önceki çalışmaları 14, 32 ile uyumlu olarak, makrofajlar tarafından alınır, altın nanoçubuklar tipik plasmonik bandı muhafaza edildiğini göstermektedir. Bu nedenle, bu tür endositik veziküller içinde ayrışma ve dağılımlı bir kolloid 28 arada farklı boyut ve şekli ile parçacıkların bir diferansiyel alımı üzerinde plasmonik bağlantı olarak etkiler, 33. Bu protokollerin önemli bir rol oynamaktadır 2b de chitosanın fizibilitesini kanıtlamaktadır Şekil yok optik fantom olarak.
Şekil 3, Adım 4'e göre ölçülen F exc bir fonksiyonu olarak R eğiliminde olduğu ve unsurlar için gerekli olan verileri ve analiz bir fikir verirAdım 4.5.5 uyarınca F th e. F TH (11 ± 1) mJ / bu örnekte cm2 olduğu bulunmuştur. Hücresel araçlardan PA dönüşüm istikrar soruşturma için yüksek oranda doğruluk sağlar birkaç mJ / cm2, 500 atım üzerinde ortalama zaman bu numune üzerinde PA ölçümleri 20'den büyük gürültü oranı (SNR) sinyal ile sinyaller verdi.
Şekil 1. Katyonik altın nanorods ve makrofajlar karakterizasyonu: olarak sentezlenmiş altın nanoçubuklar arasında (650 x 500) mil 2 TEM görüntüsü, b, c ve d., Sırasıyla (13 x 8.6) 2 um (2.3 x 1.7) mikron 2 ve katyonik altın nanoçubuklar ile tedavi makrofajların (870 × 650) nm 2 TEM görüntüleri. görünümünüPanel d parçacıklar hücrede kendi eğim etkilenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Kitosan Film karakterizasyonu. Katyonik altın nanorods içeren makrofajların optik iletim görüntü ve kitosan fantom dağılmış b:. Kitosan hücreler olmadan altın nanorods içeren fantomlardan (katı siyah çizgi, kontrol numunesi) ve altın içeren makrofajların Optik söndürme spektrumları nanorods (kırmızı çizgi kırık). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
<img alt = "Şekil 3" src = "/ files / ftp_upload / 53328 / 53328fig3highres.jpg" width = "350" />
Şekil 3. Hücresel araçlar fotostabilite. Sonra ve her F exc karşı F exc de ışınlama önce alınan I LO yoğunlukları oranı R. Hata çubukları F LO sinyal dalgalanmalardan kaynaklanmaktadır. R birlik altına düştüğü şekillendirme eşiği bu veriler elde edilir. Kırmızı düz çizgi göz için bir rehber olarak hizmet vermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tümör ilişkili makrofajlar hedef kavramı kanseri 34, 35, 36 mücadelede güçlü bir kavram olarak ortaya çıkmaktadır. Burada, bunun yerine kendi imha, bu hücreler kendi tropizm sömürü ile, bir tümör içine altın nanorods getirmek için hücresel araçlar olarak alınırlar. Bu perspektif parçacıkların düşünceli tasarım, hücreler ve karakterizasyonu onların entegrasyonunu gerektirir. Katyonik altın nanoçubuklar yüklü fare makrofaj fotostabilitesi bunların plasmonik birleştirme ve çapraz ısınma kritik değildir olduğunu ima endositik keseler içinde parçacıkların hapsi, zarar vermez bulmuşlardır. Biz PEG teller ve altın nanokürecikler olarak off-rezonans olan şekiller, sıklığı, etrafında (çapları 17 (nm 10 civarında) ve bir termal difüzyon uzunluğu yaklaşık çok sıkı temas içine almak partiküllerin önlemek varsayımında 30 nMsırasıyla plasmonik bağlantı ve çapraz aşırı ısınma, 5 nsaniye) içinde.
protokol parçacıkların tasarımında ve Fotostabilitesi araştırılması mevcut yöntemlere göre yenilikçi. Aşama 1 'e göre, altın nanoçubuklar tasarımı Vigderman ve ark., Amonyum bileşikleri endositik vezikülleri içine altın nanoçubuklar büyük bir alımı ve hücre, bir katyonik profili 24 maddeler nüfuz nosyonunu sürücü yeteneğine sahip kuaterner 22 37 ile gözlem birleştiren olabilir bir PEG içinde gömülü 38 kabuk ve kolloidal istikrar ve biyouyumluluk 28 kazanıyor süre, işlevsel kalır. Nitekim 1. adım küçük ve daha ucuz kuaterner amonyum bileşikleri ile hücre delici peptidler değiştirilmesi ile, Yuan ve ark., 38 yöntemini andırıyor. Bu değişikliklerle, katyonik altın nanorods çok fonksiyonlu ve sürdürülebilir. Bu particl yanaes PA görüntüleme için kontrast ajanları olarak tasarlanmıştır, bir PA sonda fonksiyonel özelliklerini test etmek için idealdir. Adım 4'te, bir yeniden şekillendirilmesi eşik tanımının PA dönüşüm stabilitesi ölçümü bilimsel literatürde çerçevesinde benzersiz özellikleri olan, nicel ve tekrarlanabilir. Ayrıca, bu yöntemin PA ekipman kalibrasyon gerektirmez unutmayın.
protokol içindeki kritik adım kitosan filmlerin üretimini PA görüntüleme için kontrast ajanları olarak etkinlik açısından, hücresel araçlar incelemek için bulunmaktadır. Kitosan glukozamin ve N-asetil glukosamin artıkları 1,4-glikosidik bağlarla birleştirilen içeren bir doğrusal zincirli biyopolimerdir. Bu gözenek boyutu, gözeneklilik ve mekanik özellikleri, hem de çok yönlülüğü ve beceriklilik Chitosan bazı fizikokimyasal özellikleri, ince filmler veya gözenekli membranlar 2 şeklinde hidrojellerin üretimi için ideal bir seçenek haline getirmektedir9, 39, 40. Ayrıca, kitosan polisakarit omurgası glikozaminoglikanlar yapısal olarak benzer, mühendislik Biomimetic ve hücre destekleyici iskeleler 41 için kullanımı teşvik etmiştir bağ dokuların hücre dışı matrisin ana bileşeni. Genel olarak, kitosan hidrojeller PA testleri için ideal olan bağ dokusu 29, 41, 42, temsili olarak ısı ve elastik modülü gösterir. Bakım uygun kalınlıkta (50 mikron), düşük optik bulanıklık ve iyi homojenlik ile filmler elde etmek için önlemler alınmalıdır. 3. adımda verilen dozlar optimize edilmiştir unutmayın. 3.2 adıma göre çitosan murin makrofaj yapışkan süspansiyonu titizlikle karıştırılmalıdır. Bu talimatlar, bu filmlerin daha önce farklı bir boyutta 6 altın nanoçubuklar PA dönüşüm stabilitesini için kullanılmıştır.
Possiprotokol ks değişiklikler, hücre nüfuz maddenin yerine ya da PEG uzunluğu adım 1'de tanımlanan yöntem, örneğin artan iyileştirmeler tabi olabilir 1 ve 2 adımda, katyonik altın nanoçubuklar ve hücresel araç hazırlanmasını içerir vb amacıyla ip kolları, tümörle ilişkili makrofaj fizyolojisi toplanmasındaki engelin en aza indirir. Makrofajlar için spesifik olan ligandların kullanımı, bir seçenek 43 olabilir. Parçacıkların alımını etkileyen diğer parametreler boyutunu ve şeklini 33 ve bunların inorganik kaplama içerir. Örneğin, bir silis kabuk daha sofistike ve daha yabancı madde pahasına, yüksek içselleştirilmesi 44, toplama 17 ve PA istikrar 7 karşı optik istikrar bir arada verebilir. Biz içselleştirme endozomal yolu, 44 ortak etkisi 33, 43 olabilir varsayım
3. adımda reçete cel korunması ile uyumsuz olduğundan protokol sınırlamaları, sabit hücrelerin yerine, canlı hücreleri kullanma ihtiyacı bulunmaktadırlular mevcudiyetini göstermektedir. Diğer kısıtlamalar optik absorbans ve film foto-yeterli bir kombinasyonu çevirir adım 4.4 bir prob akıcılığa belirlenmesinde yeterli SNR ihtiyacı, ile ilgilidir.
Sonuç olarak, yenilikçi bir protokol hazırlamak ve foto akustik görüntüleme için kontrast ajanları olarak uygun olan, hücresel araç fonksiyonel karakterizasyonu gerçekleştirmek için tarif edilmiştir. Bu altın giriş olumsuz yönde foto-etkilemez sıçangil makrofajlara nanorods bulmuşlardır. Mevcut çalışmanın odak noktası kendi canlılığı ve kemotaktik aktivite için özel bir dikkat ile, bu hücrelerin fizyolojisi üzerinde. Gelecekte, bu yöntem, bir optik kontrast ajanlarının farklı çözümler ihtiva eden farklı hücresel araç hazırlanmasını araştırmak için test edilir. PA sonda, in vitro olarak malign hücrelerin optik kontrast ajanlarının hedeflendirilebilme test etmek için hizmet edebilirHücresel araçların kullanımı olmadan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen ERANET + Projeleri LUS BUBBLE ve BI-TRE çerçevesinde Regione Toscana ve Avrupa Topluluğu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma-Aldrich | H6269 | To synthesize gold nanorods |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma-Aldrich | 520918 | To synthesize gold nanorods |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | To synthesize gold nanorods |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | To synthesize gold nanorods |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | To synthesize gold nanoseeds | |
| MeO-PEG-SH | Iris Biotech | PEG1171 | To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da. |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | To PEGylate gold nanorods |
| (11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide | Sigma-Aldrich | 733305 | To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | To centrifuge PEGylated gold nanorods |
| PBS | Lonza | BE17-516F | To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells |
| J774a.1 | ATCC | TIB-67 | Monocyte/macrophage murine cell line |
| DMEM | Lonza | BE12-707F | Cell culture medium |
| FBS | Lonza | DE14-801F | To be added to cell culture medium |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | To be added to cell culture medium |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-602E | To be added to cell culture medium |
| Petri dish | NEST | 705001 | Cell culture dish |
| Cell scraper | EuroClone | ES7018 | To detach cells |
| Formaldehyde | Fluka | 47630 | To fix cells |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma-Aldrich | 448869 | 75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da. |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 306576 | To insolubilize chitosan and generate the hydrogel |
| Polystyrene cell culture plates | NEST | 702011 | Used as molds to fabricate chitosan hydrogels |
| Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser | Continuum, Santa Clara, USA | Surelite OPO plus | Source of optical excitation for photoacoustic tests |
| Pyroelectric detector | Gentec, Quebec, Canada | QE8SP | To monitor optical fluence for photoacoustic tests |
| Pre amplified needle hydrophone | Precision Acoustic, Dorset, UK | Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range | To measure photoacoustic signals |
References
- Ratto, F., Matteini, P., Centi, S., Rossi, F., Pini, R. Gold nanorods as new nanochromophores for photothermal therapies. J. Biophotonics. (1-2), 4-41 (2011).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41, 2740-2779 (2012).
- Hahn, M. A., Singh, A. K., Sharma, P., Brown, S. C., Moudgil, B. M. Nanoparticles as Contrast Agents for in-Vivo Bioimaging: Current Status and Future Perspectives. Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 3-27 (2011).
- Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Ther. Deliv. 3 (4), 457-478 (2012).
- Manohar, S., Ungureanu, C., Van Leeuwen, T. G. Gold nanorods as molecular contrast agents in photoacoustic imaging: The promises and the caveats. Contrast Media Mol. Imaging. 6 (5), 389-400 (2011).
- Cavigli, L., et al. Size Affects the Stability of the Photoacoustic Conversion of Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (29), 16140-16146 (2014).
- Chen, L. -C., et al. Enhanced photoacoustic stability of gold nanorods by silica matrix confinement. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016010 (2010).
- Ratto, F., et al. CW laser-induced photothermal conversion and shape transformation of gold nanodogbones in hydrated chitosan films. J. Nanopart. Res. 13, 4337-4348 (2011).
- Mercatelli, R., et al. Quantitative readout of optically encoded gold nanorods using an ordinary dark-field microscope. Nanoscale. 5 (20), 9645-9650 (2013).
- Von Maltzahn, G., et al. Computationally guided photothermal tumor therapy using long-circulating gold nanorod antennas. Cancer Res. 69 (9), 3892-3900 (2009).
- Jokerst, J. V., Cole, A. J., Van De Sompel, D., Gambhir, S. S. Gold nanorods for ovarian cancer detection with photoacoustic imaging and resection guidance via Raman imaging in living mice. ACS Nano. 6 (11), 10366-10377 (2012).
- Huang, X., et al. A reexamination of active and passive tumor targeting by using rod-shaped gold nanocrystals and covalently conjugated peptide ligands. ACS Nano. 4 (10), 5887-5896 (2010).
- Alkilany, A. M., Thompson, L. B., Boulos, S. P., Sisco, P. N., Murphy, C. J. Gold nanorods: Their potential for photothermal therapeutics and drug delivery, tempered by the complexity of their biological interactions. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 190-199 (2012).
- Centi, S., et al. In vitro assessment of antibody-conjugated gold nanorods for systemic injections. J. Nanobiotechnology. 12, 55 (2014).
- Jain, P. K., Eustis, S., El-Sayed, M. A. Plasmon coupling in nanorod assemblies: Optical absorption, discrete dipole approximation simulation, and exciton-coupling model. J. Phys. Chem. B. 110 (37), 18243-18253 (2006).
- Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries. Nano Lett. 9 (4), 1651-1658 (2009).
- Mazzoni, M., Ratto, F., Fortunato, C., Centi, S., Tatini, F., Pini, R. Partial Decoupling in Aggregates of Silanized Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (34), 20018-20025 (2014).
- Lapotko, D. O., Lukianova, E., Oraevsky, A. A. Selective laser nano-thermolysis of human leukemia cells with microbubbles generated around clusters of gold nanoparticles. Lasers Surg. Med. 38 (6), 631-642 (2006).
- Choi, M. R., et al. A cellular trojan horse for delivery of therapeutic nanoparticles into tumors. Nano Letters. 7 (12), 3759-3765 (2007).
- Dreaden, E. C., Mwakwari, S. C., La Austin,, Kieffer, M. J., Oyelere, A. K., El-Sayed, M. A. Small molecule-gold nanorod conjugates selectively target and induce macrophage cytotoxicity towards breast cancer cells. Small. 8 (18), 2819-2822 (2012).
- Yang, T. D., et al. Real-time phase-contrast imaging of photothermal treatment of head and neck squamous cell carcinoma: an in vitro study of macrophages as a vector for the delivery of gold nanoshells. J. Biomed. Opt. 17 (12), 128003 (2012).
- Vigderman, L., Manna, P., Zubarev, E. R. Quantitative Replacement of Cetyl Trimethylammonium Bromide by Cationic Thiol Ligands on the Surface of Gold Nanorods and Their Extremely Large Uptake by Cancer Cells. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 51 (3), 636-641 (2012).
- Richard, J. P., et al. Cell-penetrating peptides: A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278 (1), 585-590 (2003).
- Delehanty, J. B., Boeneman, K., Bradburne, C. E., Robertson, K., Bongard, J. E., Medintz, I. L. Peptides for specific intracellular delivery and targeting of nanoparticles: implications for developing nanoparticle-mediated drug delivery. Ther. Deliv. 1, 411-433 (2010).
- Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods (NRs) using seed-mediated growth method. Chem. Mater. 15 (10), 1957-1962 (2003).
- Ratto, F., Matteini, P., Rossi, F., Pini, R. Size and shape control in the overgrowth of gold nanorods. J. Nanopart. Res. 12 (6), 2029-2036 (2009).
- Niidome, T., et al. PEG-modified gold nanorods with a stealth character for in vivo applications. J. Control. Release. 114 (3), 343-347 (2006).
- Tatini, F., et al. Size dependent biological profiles of PEGylated gold nanorods. J. Mater. Chem. B. 2, 6072-6080 (2014).
- Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., Centi, S., Dei, L., Pini, R. Chitosan films doped with gold nanorods as laser-activatable hybrid bioadhesives. Adv. Mater. 22 (38), 4313-4316 (2010).
- Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., de Angelis, M., Cavigli, L., Pini, R. Hybrid nanocomposite films for laser-activated tissue bonding. J. Biophotonics. 5 (11-12), 868-877 (2012).
- Matteini, P., Tatini, F., Cavigli, L., Ottaviano, S., Ghini, G., Pini, R. Graphene as a photothermal switch for controlled drug release. Nanoscale. 6, 7947-7953 (2014).
- Ratto, F., Witort, E., et al. Plasmonic Particles that Hit Hypoxic Cells. Adv. Funct. Mater. 25 (2), 316-323 (2015).
- Chithrani, D. B. Intracellular uptake, transport, and processing of gold nanostructures. Molec. Membrane Biol. 27 (7), 299-311 (2010).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73 (3), 1128-1141 (2013).
- Mantovani, A., Allavena, P. The interaction of anticancer therapies with tumor-associated macrophages. J. Exp. Med. 212 (4), 435-445 (2015).
- Panni, R. Z., Linehan, D. C., DeNardo, D. G. Targeting tumor-infiltrating macrophages to combat cancer. Immunotherapy. 5 (10), 1075-1087 (2013).
- Oh, E., et al. Cellular uptake and fate of PEGylated gold nanoparticles is dependent on both cell-penetration peptides and particle size. ACS Nano. 5 (8), 6434-6448 (2011).
- Yuan, H., Fales, A. M., Vo-Dinh, T. TAT peptide-functionalized gold nanostars: Enhanced intracellular delivery and efficient NIR photothermal therapy using ultralow irradiance. J. Am. Chem. Soc. 134 (28), 11358-11361 (2012).
- Ladest, S., Fales, A. M., Domard, A.
- Matteini, P., et al. Photothermally activated hybrid films for quantitative confined release of chemical species. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 52, 5956-5960 (2013).
- Khor, E., Lim, L. Y.
- Kennedy, L. C., et al. T cells enhance gold nanoparticle delivery to tumors in vivo. Nanoscale Res. Lett. 6 (1), 283 (2011).
- Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. J. Nanopart. Res. 9 (6), 1109-1124 (2007).
- Jokerst, J. V., Thangaraj, M., Kempen, P. J., Sinclair, R., Gambhir, S. S. Photoacoustic imaging of mesenchymal stem cells in living mice via silica-coated gold nanorods. ACS Nano. 6 (7), 5920-5930 (2012).
- Ding, H., et al. Gold nanorods coated with multilayer polyelectrolyte as contrast agents for multimodal imaging. J. Phys. Chem. C. 111 (34), 12552-12557 (2007).
- Esposito, G., et al. et al. In vivo laser assisted microvascular repair and end-to-end anastomosis by means of indocyanine green-infused chitosan patches: A pilot study. Lasers Surg. Med. 45 (5), 318-325 (2013).
