Abstract
Guld nanostavar är attraktiva för en rad biomedicinska tillämpningar, såsom fototermiska ablation och fotoakustiska avbildning av cancer, tack vare deras intensiva optisk absorbans i det nära infraröda fönster, låg cytotoxicitet och potential till hem till tumörer. Men deras leverans till tumörer fortfarande ett problem. Ett innovativt tillvägagångssätt består av utnyttjande av tropism av tumörassocierade makrofager som kan laddas med guldnanostavar in vitro. Här beskriver vi framställningen och fotoakustiska inspektion av cellulära fordon innehållande guldnanostavar. PEGylerade guldnanostavar är modifierade med kvartära ammoniumföreningar, i syfte att uppnå en katjonisk profil. Vid kontakt med murina makrofager i vanliga petriskålar är dessa partiklar befunnits genomgå massiv upptag i endocytiska vesiklar. Då dessa celler är inbäddade i biopolymera hydrogeler, som används för att kontrollera att stabiliteten av fotoakustiska omvandlingenav partiklarna kvarhålls i deras införlivande i cellulära fordon. Vi är övertygade om att dessa resultat kan ge ny inspiration för utveckling av nya strategier för att leverera plasmoniska partiklar till tumörer.
Introduction
Under det senaste årtiondet har olika plasmoniska partiklar såsom guld nanostavar, nanoshells och nanocages, fått stor uppmärksamhet för tillämpningar inom biomedicinsk optik 1, 2, 3, 4. I strid med standardguldnanosfärer, dessa nyare partiklar resonans i det nära infraröda (NIR) fönster som ger djupaste optiska penetrering genom kroppen och högsta optiska kontrast över endogena komponenter 1. Denna funktion har väckt intresse för innovativa tillämpningar, såsom fotoakustisk (PA) avbildning och fototermiska ablation av cancer. Men flera frågor hålla den kliniska penetrationen av dessa partiklar. Till exempel, tenderar deras optiska aktivering för att inducera deras överhettning och att ändra sina funktionella former till mer sfäriska profiler, som driver en photoinstability 5, 6, 7, 8 sup>, 9. En annan fråga som dominerar den vetenskapliga debatten är deras systemleverans till tumörer. Framför allt guld nanostavar kombinera storlekar som är idealiska för att genomsyra tumörer som visar ökad permeabilitet och retention och enkel konjugering med specifika prober av maligna markörer. Därför är deras förberedelse för en direkt injektion i blodströmmen uppfattas som ett genomförbart system 10, 11, 12, 13. Men denna väg är fortfarande problematiskt med de flesta av partiklarna blir fångas upp av det mononukleära fagocyt-systemet 10, 11, 12. Dessutom är ett annat bekymmer den optiska och biokemisk stabilitet av partiklarna efter cirkulation genom kroppen 14. När partiklarna förlorar sin kolloidal stabilitet och aggregat, kan deras plasmoniska funktioner och värmeöverföringsdynamik lider av plasmoniska koppling 15, 16, 17 och tvär överhettning 18.
På senare tid har begreppet att utnyttja tropism av tumörassocierade makrofager dykt upp som ett smart alternativ 19, 20, 21. Dessa celler hålla en medfödd förmåga att upptäcka och genomsyra tumörer med hög specificitet. Därför kan ett perspektiv vara att isolera dessa celler från en patient, ladda dem med guldnanostavar in vitro och sedan injicera dem tillbaka in i patienten, med avsikt att använda dem som cellulära fordon som ansvarar för leveransen. En annan fördel skulle vara att få mer kontroll över de optiska och biokemiska stabiliteten av partiklarna, eftersom deras biologiska gränssnitt skulle byggas in vitro. Ändå prestanda dessa cellulära fordon som optiska kontrastmedel behöver en kritisk analys.
I detta arbete, beskriver vi framställningen och kritiska frågor om cellular fordon innehållande guld nanostavar för PA avbildning av cancer. PEGylerade guld nanostavar är modifierade med kvartära ammoniumföreningar 22, i syfte att uppnå en katjonisk profil som förväntas främja deras interaktioner med plasmamembran 23, 24. Dessa partiklar genomgår effektiv och ospecifik upptagning från de flesta cellulära slag, förhoppningsvis utan att störa mycket med sina biologiska funktioner. Murina makrofager är laddade med upp till så många som 200, 000 katjoniska guld nanostavar per cell, som blir begränsade inom snäva endocytiska vesiklar. Denna konfiguration skulle uppstå oro, på grund av hotet om plasmoniska koppling och tvär överhettning i dessa vesiklar. Därför makrofagerna inbäddade i biopolymera hydrogeler som efterliknar biologiska vävnader, för att kontrollera att de flesta av stabiliteten hos PA omvandling av partiklarna bibehålls i överföringen från tillväxtmediet till endocytiska vesiklar. effectivkriterier e mätning utarbetas för att mäta stabiliteten i PA konvertering under förhållanden av omedelbart intresse för PA avbildning. En omformning tröskel sätts på mycket starten av optisk instabilitet efter ett tåg av 50 laserpulser med den typiska repetitionsfrekvens på 10 Hz.
Vi är övertygade om att dessa resultat kan ge impulser till utveckling av nya strategier för att leverera plasmoniska partiklar till tumörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Notera: Alla koncentrationer av guldnanostavar är uttryckta i termer av nominella Au molariteter. För jämförelse med andra verk, notera att en M Au motsvarar ungefär 20 pm guldnanostavar, i vårt fall.
1. Framställning av katjonisk Gold nanostavar
Obs: Metoden börjar med syntesen av cetrimonium bromid (CTAB) -capped guldnanostavar från autokatalytisk reduktion av HAuCl 4 med askorbinsyra, enligt protokollet som införts genom et al Nikoobakht 25 och anpassas till Ratto et al 26... Då dessa guldnanostavar modifieras för att få mer biokompatibilitet och affinitet för plasmamembran, genom en kombination av polyetylenglykol strängar 10, 11, 27, 28 och kvartära ammoniumföreningar 22.
- Rena 24 ml CTAB-capped guldnanostavar vid en concentration 450 iM Au genom två cykler av centrifugering (12.000 xg, 30 min) och dekantering. Se till att förhållandet mellan dödvolymen till ursprunglig volym är cirka 1/200 eller lägre för alla centrifugeringssteg i detta protokoll. Använda 500 ^ M vattenhaltig CTAB som en tvättlösning och slutligen överföra partiklarna i 6 ml 100 mM acetatbuffert vid pH 5, innehållande 500 | iM CTAB och 0,005% (volym / volym) polysorbat 20.
- Tillsätt 30 | il 10 mM vattenhaltig alfa-metoxi-omega-merkapto-poly (etylenglykol) (MW ~ 5000) och låt reagera under 30 min vid 37 ° C.
- Tillsätt 30 | il 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N-trimetylammonium-bromid i dimetylsulfoxid och lämna i vila under 24 h vid 37 ° C.
- Nästa, tillsätt 18 ml 0,005% (volym / volym) polysorbat 20 i vatten och rena dessa partiklar genom fyra cykler av centrifugering (12.000 xg, 30 min) och dekantering. Använda 0,005% (volym / volym) polysorbat 20 i vatten såsom tvättlösning och slutligen överföra partiklarna till 2,4 ml steril PBS vid pH7,4. Den slutliga nominella koncentrationen av guld är 4,5 mm.
2. Lastning av murina makrofager med guld nanostavar
- Använda monocyt / macrophagic cellinjen J774a.1 och DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 1 mM glutamin, 100 enheter / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin som odlingsmedium. Plattan 5 x 10 5 celler i fyra petriskålar med 60 mm diameter och tillåta dem att växa under 24 h, så att den Subkonfluenta vid tidpunkten för lösgör (se steg 2.2).
- I hela protokollet, underhålla cellerna under standardodlingsbetingelser (37 ° C, 5% CO2, 95% luft och 100% relativ fuktighet). Använd ett laminärt flöde skåp och lämplig personlig skyddsutrustning för att manipulera celler.
- Efter 24 timmar, ladda cellerna med katjoniska guld nanostavar och förbereda dem för att bäddas in i kitosan filmer:
- För att medge att partiklarna som skall tas upp av cellerna, tillsätt en alikvot av 4,5mM Au katjoniska guld nanostavar i PBS till varje petriskål, så att uppnå en slutlig koncentration av 100 iM Au. Lämna petriskålarna i inkubering i 24 h.
- Nästa, observera cellerna under ett optiskt mikroskop för att bekräfta deras goda förhållanden och uppladdningen. Celler bör uppvisa sin normala morfologi och ett antal mörka intracellulära vesiklar. Lösgöra cellerna genom en skrapa, slå samman de från två Petri-skålar, i syfte att uppnå en lämplig mängd celler för följande steg (minst 2 x 10 6 celler), och centrifugera dem (120 xg, 6 min) för att eliminera varje överskott av katjoniska guldnanostavar. Den cellulära pelleten ska se nästan svart.
- Suspendera pelleten i 2 ml PBS och räkna cellerna med hjälp av en Biirker kammare. Centrifugera en suspension innehållande 2 x 10 6 celler (120 xg, 6 min) och fixa deras pelleten i 2 ml 3,6% (vikt / volym) formaldehyd i PBS under tio minuter vid rumstemperatur. Slutligen, tvätta denna pellets tre gånger centrifugatjon (120 xg, 6 min) för att avlägsna fixativet. Använd PBS som tvättlösning.
3. ingjutning av makrofager i Chitosan Films
Notera: De säregna egenskaperna hos kitosan 26, 27, 28, 29 utnyttjas för att producera biomimetiska fantomer innehållande makrofager färgades med katjoniska guldnanostavar. När det gäller andra hydrogeler såsom agaros gör chitosan filmer som är mycket starkare och tunnare, vilket är avgörande för PA mikroskopi 6. Tillverkningen av dessa fantomer utförs enligt tidigare protokoll 29, 30, 31 med vissa modifieringar som föreskrivs i de följande sätt när 30.
- Framställa en surgjord (pH 4,5, framställd genom tillsats av ättiksyra) och trögflytande 3% (vikt / volym) med låg molekylvikt kitosan (genomsnittlig molekylvikt 120 kDa) lösning, noggrant blanda den ochlåt det homogenisera under 24 h vid 40 ° C.
- Därefter blanda murina makrofager innehållande katjoniska guld nanostavar (2 x 10 6 celler) med 500 pl kitosanlösning.
- I syfte att erhålla ~ 50 | im tjocka fantomer, häll 250 mg av blandningen i 1,91 cm 2 formar polystyren och lämna dem under en kväveström i 24 h. Därefter behandla dessa prover med 500 pl 1 M NaOH, för att inducera tvärbindning, och skölj dem med 10 ml ultrarent vatten.
4. Provning av stabiliteten av Photoacoustic Conversion
Obs: Stabiliteten hos PA omvandling undersöks med hjälp av PA experiment med hemmagjorda inställning som beskrivs i ref 6.
- Avbryta ett kitosanfilm innehållande makrofagerna i DI vatten, till exempel genom användning av en plasthållare nedsänkt i en petriskål, för att hålla ett avstånd på ~ 5 mm från botten av plattan. Sätt denna platta på ett mikrometer XY skedei syfte att styra provposition.
- Fokusera en laserstråle med ~ 5 nsek pulsvaraktighet i resonans med den längsgående plasmoniska bandet av guldnanostavar (t.ex., från en optisk parametrisk oscillator som pumpas av den tredje övertonen av en Q-switchad Nd: YAG-laser med våglängdsområde av 400 - 2500 nm och pulsvaraktighet på 5 nsek) vinkelrätt mot filmytan med en ~ 300 | im punktdiameter.
- Placera en dämpare framför laserfönstret att avstämma laser fluens och använda en stråldelare för att fokusera en del av laserstrålen till en energimätare (t.ex., en pyroelektrisk detektor) och övervaka Fluence fluktuationer. Bibehålla den optiska inflytande under ~ 1 mJ / cm2 per puls under inriktningen. Använd lämpliga laserskyddsglasögon när lasern är på.
- Doppa en ultraljudsomvandlare (frekvensområdet 1-20 MHz) i petriskålen ~ 2 mm bort från filmytan och justera sin position med hjälp av mikrometer översättningaroch rotationssteg för att maximera PA-signalen som utsänds från filmen.
- Bestäm en sond fluensen F LO som inte skadar provet 6:
- Bestråla en slumpmässig punkt i provet vid en fluens runt en mJ / cm2 per puls under minst 500 pulser. För varje puls, förvärva motsvarande PA-signalen från ultraljudsgivare och laser fluens från energimätaren med ett oscilloskop. Namnge genomsnittliga inflytande som F LO rättegång.
- Beräkna intensiteten av PA-signalen som dess topp-till-topp-amplitud som en funktion av pulsnummer. I syfte att motvikt de laserintensitetsfluktuationer, normalisera amplituden för varje PA-signal till förhållandet mellan dess egen fluens till F LO trial. Analysera utvecklingen av den normaliserade PA intensitet som en funktion av pulsnummer och kontrollera dess stabilitet över tid.
- När det gäller instabilitet, upprepa steg 4.4.1 till 4.4.3 med ett lägre värde på F LO
- Mät en omformning tröskel fluens:
- Välj en annan slumpmässig punkt av provet och sondera en genomsnittlig PA intensitet (I LO a) över 500 pulser på F LO.
- Ställ en nominell fluens större än F LO och leverera 50 pulser. Namnge deras genomsnittliga inflytande som F exkl.
- Probe en genomsnittlig PA intensitet (I LO b) över 500 pulser vid F LO igen. Beräkna kvoten R = I LO b / I LO a. Ett värde på R under enighet vittnar om en irreversibel förändring av de optiska egenskaperna hos provet.
- Använd mikrometer XY steget att flytta filmen och ändra point av provet på måfå. Upprepa steg 4.5.1 till 4.5.4 med olika värden på F exkl, för att ta några värden R nedan runt och ovanför enheten. 15 poäng är rimliga.
- Plot R som en funktion av F CK och identifiera omformningen tröskel fluensen F th som värde när R börjar skilja sig från en utanför statistisk osäkerhet. 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här, är det är möjligt att cellulära fordon som innehåller guldnanostavar för PA avbildning av cancer som visas tillsammans med typiska resultat av protokollet.
TEM bilder i Figur 1 visar den vanliga utseendet av partiklarna efter steg 1 och deras cellulära fordon efter steg 2. Beredningen av partiklarna och cellerna för TEM avbildning beskrivs på annat håll 17. Katjoniska guld nanostavar genomgå en massiv ackumulering i makrofager, som bibehåller sin normala morfologi. Partiklar befinns begränsas inom snäva endocytiska vesiklar.
Figur 2a visar en optisk transmission bild av makrofager som innehåller katjoniska guld nanostavar och sprids i en kitosan fantom efter steg 3. bevisas av detta mikrofotografi, inte en att i kitosan hydrogelffect den cellulära morfologin. Celler är väl dispergerad genom hela provet. Kontroller av kitosan filmer som innehåller guld nanostavar utan celler är homogena. Figur 2b visar att den typiska plasmoniska band av guld nanostavar bibehålls när partiklarna tas upp av makrofager, i linje med vårt tidigare arbete 14, 32. Därför effekter såsom plasmoniska koppling på segregation i endocytiska vesiklar och en differential upptag av partiklar med olika storlek och form som samexisterar i en polydispers kolloid 28, 33 inte spelar en viktig roll i dessa protokoll. Figur 2b visar också möjligheten att kitosan som en optisk fantom.
Figur 3 visar utvecklingen av R som en funktion av F exkl mätt enligt steg 4 och ger en uppfattning om data och analyser som krävs för determnering F th enligt steg 4.5.5. F: te visade sig vara (11 ± 1) mJ / cm 2 i detta exempel. PA mätningar på detta prov gav signaler med signal-brusförhållande (SNR) är större än 20 som medelvärde över 500 pulser på några mJ / cm 2, vilket ger hög noggrannhet för att undersöka stabiliteten hos PA konvertering från de cellulära fordon.
Figur 1. Katjonisk guld nanostavar och makrofager karakterisering a: (650 × 500) nm 2 TEM bild av as-syntetiserade guld nanostavar, b, c och d. Respektive (13 × 8,6) im 2, (2,3 x 1,7) im 2 och (870 x 650) nm 2 TEM bilder av makrofager som behandlats med katjoniska guld nanostavar. Utseendet påpartiklarna i panelen d påverkas av deras lutning i cellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. kitosanfilm karakterisering a:. Optisk transmission bild av makrofager som innehåller katjoniska guld nanostavar och sprids i en kitosan fantom b:. Optisk utrotning spektra av kitosan fantomer innehållande guldnanostavar utan celler (heldragna svarta linjen, kontrollprov) och makrofager innehållande guld nanostavar (streckad röd linje). klicka här för att se en större version av denna siffra.
<img alt = "Bild 3" src = "/ filer / ftp_upload / 53.328 / 53328fig3highres.jpg" width = "350" />
Figur 3. Cellular fordon foto. Ratio R intensiteten hos I LO tagna efter och före bestrålning vid varje F exkl kontra F exkl. Felstaplarna härrör från signalfluktuationer på F LO. Den omforma tröskel extraheras från dessa data som R faller under enhet. Den röda heldragna linjen fungerar som en guide för ögat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Begreppet att rikta tumörassocierade makrofager framstår som ett starkt koncept för kampen mot cancer 34, 35, 36. Här, i stället för deras förstörelse, är dessa celler rekryteras som cellulära fordon för att få guldnanostavar i en tumör, genom utnyttjandet av deras tropism. Detta perspektiv kräver en genomtänkt design av partiklarna, deras integration i cellerna och deras karakterisering. Vi har funnit att fotostabilitet av murina makrofager laddade med katjoniska guldnanostavar inte lider av den inneslutning av partiklar inom endocytiska vesiklar, vilket innebär att deras plasmoniska koppling och kors överhettning är inte kritiska. Vår hypotes är att PEG strängar och förekomsten av former som är off-resonans, såsom guld nanosfärer, förhindra partiklarna att komma in alltför tät kontakt, som handlar om deras diametrar 17 (cirka 10 nm) och en termisk diffusion längd (runt 30 nmi 5 ns) för plasmoniska koppling och tvär överhettning, respektive.
Protokollet är innovativa i förhållande till befintliga metoder i utformningen av partiklarna och för undersökning av deras foto. Utformningen av guldnanostavar enligt steg 1 kombinerar observation genom et al. Vigderman 22 som kvartära ammoniumföreningar är kapabla att driva en massiv upptag av guldnanostavar i endocytiska vesiklar och tanken att cellen penetrerande medel med en katjonisk profil 24, 37 maj bäddas in i en PEG skal 38 och förblir funktionella, samtidigt som du får kolloidalt stabilitet och biokompatibilitet 28. Faktiskt steg 1 liknar metoden av et al. Yuan 38, med ersättande av cellpenetrerande peptider med mindre och billigare kvaternära ammoniumföreningar. Med dessa ändringar, katjoniska guld nanostavar är multifunktionellt och hållbart. Eftersom dessa particles är avsedda som kontrastmedel för PA avbildning, är en PA sond idealiskt för att testa sina funktionella egenskaper. Mätningen av stabiliteten hos PA omvandling av definitionen av en omforma tröskel i steg 4 är kvantitativ och reproducerbar, som är unika funktioner inom ramen för den vetenskapliga litteraturen. Dessutom noterar vi att denna metod inte kräver en kalibrering av PA-utrustning.
Kritiska steg i protokollet inkluderar tillverkningen av kitosan filmer för att inspektera de cellulära fordon med avseende på deras effektivitet som kontrastmedel för PA avbildning. Kitosan är en linjär kedja biopolymer innefattar glukosamin och N-acetyl glukosamin rester sammanfogade med 1,4-glykosidbindningar. Vissa fysikalisk-kemiska egenskaper hos chitosan, såsom dess porstorlek, porositet och mekaniska egenskaper, liksom dess mångsidighet och händighet, gör det till ett idealiskt alternativ för tillverkning av hydrogeler i form av tunna filmer eller porösa membran 29, 39, 40. Vidare är polysackariden ryggraden i kitosan strukturellt liknar glykosaminoglykaner, huvudkomponenten i den extracellulära matrisen i bindväv, som har främjat dess användning för ingenjörs biomimetisk och cellbärande ställningar 41. Sammantaget kitosan hydrogeler uppvisar termiska och elastiska moduler som är representativa för bindväv 29, 41, 42, som är idealisk för PA tester. Försiktighet bör vidtas för att uppnå filmer med rätt tjocklek (50 | im), låg optisk grumlighet och god homogenitet. Notera att de doser som ges i steg 3 har optimerats. Den viskösa suspensionen av murina makrofager i chitosan ska blandas med flit enligt steg 3,2. Med dessa anvisningar har dessa filmer redan använts för att jämföra stabiliteten i PA omvandling av guld nanostavar av olika storlek 6.
möjbara ändringar i protokollet innefattar framställningen av katjoniska guld nanostavar och cellulära fordon i steg 1 och 2. Sätt i steg 1 kan bli föremål för inkrementella förbättringar, till exempel, genom substitution av den cellpenetrerande medlet eller längden av PEG trådar etc., i syfte att minimera påverkan på fysiologi av tumörassocierade makrofager. Användningen av ligander som är specifika för makrofager kan vara ett alternativ 43. Andra parametrar som påverkar upptaget av partiklarna inkluderar deras storlek och form 33 och deras oorganisk beläggning. Till exempel kan ett skal av kiseldioxid ger en kombination av hög interna 44, optisk stabilitet mot aggregation 17 och PA stabilitet 7, på bekostnad av mer sofistikerade och mer främmande material. Vi förmodar att det endosomala reaktionsvägen av internalisering kan vara en vanlig effekt 33, 43, 44
Begränsningar i protokollet inkluderar behovet av att använda fixerade celler snarare än levande celler, eftersom föreskrifterna i steg 3 är oförenliga med bevarandet av cellular viabilitet. Andra begränsningar rör behovet av en tillräcklig SNR vid bestämningen av en sond fluens i steg 4,4, som omvandlas till en tillräcklig kombination av optisk absorbans och fotostabilitet av filmen.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit en innovativ protokoll för att förbereda och utföra en funktionell karakterisering av cellulära fordon som är genomförbara som kontrastmedel för fotoakustisk avbildning. Vi har funnit att införandet av guld nanostavar i murina makrofager påverkar inte deras foto negativt. Fokus för vårt nuvarande arbete på fysiologi av dessa celler, med en särskild uppmärksamhet för deras livskraft och kemotaktisk aktivitet. I framtiden skall denna metod testas för att undersöka framställningen av olika cellulära vehiklar innehållande olika lösningar av optiska kontrastmedel. PA Proben kan också tjäna till att testa targetability av optiska kontrastmedel till maligna celler in vitro,utan användning av cellulära fordon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har delvis stöd av Regione Toscana och Europeiska gemenskapen inom ramen för Eranet + Projekt LUS bubbla och BI-TRE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma-Aldrich | H6269 | To synthesize gold nanorods |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma-Aldrich | 520918 | To synthesize gold nanorods |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | To synthesize gold nanorods |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | To synthesize gold nanorods |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | To synthesize gold nanoseeds | |
| MeO-PEG-SH | Iris Biotech | PEG1171 | To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da. |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | To PEGylate gold nanorods |
| (11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide | Sigma-Aldrich | 733305 | To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | To centrifuge PEGylated gold nanorods |
| PBS | Lonza | BE17-516F | To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells |
| J774a.1 | ATCC | TIB-67 | Monocyte/macrophage murine cell line |
| DMEM | Lonza | BE12-707F | Cell culture medium |
| FBS | Lonza | DE14-801F | To be added to cell culture medium |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | To be added to cell culture medium |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-602E | To be added to cell culture medium |
| Petri dish | NEST | 705001 | Cell culture dish |
| Cell scraper | EuroClone | ES7018 | To detach cells |
| Formaldehyde | Fluka | 47630 | To fix cells |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma-Aldrich | 448869 | 75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da. |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 306576 | To insolubilize chitosan and generate the hydrogel |
| Polystyrene cell culture plates | NEST | 702011 | Used as molds to fabricate chitosan hydrogels |
| Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser | Continuum, Santa Clara, USA | Surelite OPO plus | Source of optical excitation for photoacoustic tests |
| Pyroelectric detector | Gentec, Quebec, Canada | QE8SP | To monitor optical fluence for photoacoustic tests |
| Pre amplified needle hydrophone | Precision Acoustic, Dorset, UK | Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range | To measure photoacoustic signals |
References
- Ratto, F., Matteini, P., Centi, S., Rossi, F., Pini, R. Gold nanorods as new nanochromophores for photothermal therapies. J. Biophotonics. (1-2), 4-41 (2011).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41, 2740-2779 (2012).
- Hahn, M. A., Singh, A. K., Sharma, P., Brown, S. C., Moudgil, B. M. Nanoparticles as Contrast Agents for in-Vivo Bioimaging: Current Status and Future Perspectives. Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 3-27 (2011).
- Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Ther. Deliv. 3 (4), 457-478 (2012).
- Manohar, S., Ungureanu, C., Van Leeuwen, T. G. Gold nanorods as molecular contrast agents in photoacoustic imaging: The promises and the caveats. Contrast Media Mol. Imaging. 6 (5), 389-400 (2011).
- Cavigli, L., et al. Size Affects the Stability of the Photoacoustic Conversion of Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (29), 16140-16146 (2014).
- Chen, L. -C., et al. Enhanced photoacoustic stability of gold nanorods by silica matrix confinement. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016010 (2010).
- Ratto, F., et al. CW laser-induced photothermal conversion and shape transformation of gold nanodogbones in hydrated chitosan films. J. Nanopart. Res. 13, 4337-4348 (2011).
- Mercatelli, R., et al. Quantitative readout of optically encoded gold nanorods using an ordinary dark-field microscope. Nanoscale. 5 (20), 9645-9650 (2013).
- Von Maltzahn, G., et al. Computationally guided photothermal tumor therapy using long-circulating gold nanorod antennas. Cancer Res. 69 (9), 3892-3900 (2009).
- Jokerst, J. V., Cole, A. J., Van De Sompel, D., Gambhir, S. S. Gold nanorods for ovarian cancer detection with photoacoustic imaging and resection guidance via Raman imaging in living mice. ACS Nano. 6 (11), 10366-10377 (2012).
- Huang, X., et al. A reexamination of active and passive tumor targeting by using rod-shaped gold nanocrystals and covalently conjugated peptide ligands. ACS Nano. 4 (10), 5887-5896 (2010).
- Alkilany, A. M., Thompson, L. B., Boulos, S. P., Sisco, P. N., Murphy, C. J. Gold nanorods: Their potential for photothermal therapeutics and drug delivery, tempered by the complexity of their biological interactions. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 190-199 (2012).
- Centi, S., et al. In vitro assessment of antibody-conjugated gold nanorods for systemic injections. J. Nanobiotechnology. 12, 55 (2014).
- Jain, P. K., Eustis, S., El-Sayed, M. A. Plasmon coupling in nanorod assemblies: Optical absorption, discrete dipole approximation simulation, and exciton-coupling model. J. Phys. Chem. B. 110 (37), 18243-18253 (2006).
- Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries. Nano Lett. 9 (4), 1651-1658 (2009).
- Mazzoni, M., Ratto, F., Fortunato, C., Centi, S., Tatini, F., Pini, R. Partial Decoupling in Aggregates of Silanized Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (34), 20018-20025 (2014).
- Lapotko, D. O., Lukianova, E., Oraevsky, A. A. Selective laser nano-thermolysis of human leukemia cells with microbubbles generated around clusters of gold nanoparticles. Lasers Surg. Med. 38 (6), 631-642 (2006).
- Choi, M. R., et al. A cellular trojan horse for delivery of therapeutic nanoparticles into tumors. Nano Letters. 7 (12), 3759-3765 (2007).
- Dreaden, E. C., Mwakwari, S. C., La Austin,, Kieffer, M. J., Oyelere, A. K., El-Sayed, M. A. Small molecule-gold nanorod conjugates selectively target and induce macrophage cytotoxicity towards breast cancer cells. Small. 8 (18), 2819-2822 (2012).
- Yang, T. D., et al. Real-time phase-contrast imaging of photothermal treatment of head and neck squamous cell carcinoma: an in vitro study of macrophages as a vector for the delivery of gold nanoshells. J. Biomed. Opt. 17 (12), 128003 (2012).
- Vigderman, L., Manna, P., Zubarev, E. R. Quantitative Replacement of Cetyl Trimethylammonium Bromide by Cationic Thiol Ligands on the Surface of Gold Nanorods and Their Extremely Large Uptake by Cancer Cells. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 51 (3), 636-641 (2012).
- Richard, J. P., et al. Cell-penetrating peptides: A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278 (1), 585-590 (2003).
- Delehanty, J. B., Boeneman, K., Bradburne, C. E., Robertson, K., Bongard, J. E., Medintz, I. L. Peptides for specific intracellular delivery and targeting of nanoparticles: implications for developing nanoparticle-mediated drug delivery. Ther. Deliv. 1, 411-433 (2010).
- Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods (NRs) using seed-mediated growth method. Chem. Mater. 15 (10), 1957-1962 (2003).
- Ratto, F., Matteini, P., Rossi, F., Pini, R. Size and shape control in the overgrowth of gold nanorods. J. Nanopart. Res. 12 (6), 2029-2036 (2009).
- Niidome, T., et al. PEG-modified gold nanorods with a stealth character for in vivo applications. J. Control. Release. 114 (3), 343-347 (2006).
- Tatini, F., et al. Size dependent biological profiles of PEGylated gold nanorods. J. Mater. Chem. B. 2, 6072-6080 (2014).
- Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., Centi, S., Dei, L., Pini, R. Chitosan films doped with gold nanorods as laser-activatable hybrid bioadhesives. Adv. Mater. 22 (38), 4313-4316 (2010).
- Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., de Angelis, M., Cavigli, L., Pini, R. Hybrid nanocomposite films for laser-activated tissue bonding. J. Biophotonics. 5 (11-12), 868-877 (2012).
- Matteini, P., Tatini, F., Cavigli, L., Ottaviano, S., Ghini, G., Pini, R. Graphene as a photothermal switch for controlled drug release. Nanoscale. 6, 7947-7953 (2014).
- Ratto, F., Witort, E., et al. Plasmonic Particles that Hit Hypoxic Cells. Adv. Funct. Mater. 25 (2), 316-323 (2015).
- Chithrani, D. B. Intracellular uptake, transport, and processing of gold nanostructures. Molec. Membrane Biol. 27 (7), 299-311 (2010).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73 (3), 1128-1141 (2013).
- Mantovani, A., Allavena, P. The interaction of anticancer therapies with tumor-associated macrophages. J. Exp. Med. 212 (4), 435-445 (2015).
- Panni, R. Z., Linehan, D. C., DeNardo, D. G. Targeting tumor-infiltrating macrophages to combat cancer. Immunotherapy. 5 (10), 1075-1087 (2013).
- Oh, E., et al. Cellular uptake and fate of PEGylated gold nanoparticles is dependent on both cell-penetration peptides and particle size. ACS Nano. 5 (8), 6434-6448 (2011).
- Yuan, H., Fales, A. M., Vo-Dinh, T. TAT peptide-functionalized gold nanostars: Enhanced intracellular delivery and efficient NIR photothermal therapy using ultralow irradiance. J. Am. Chem. Soc. 134 (28), 11358-11361 (2012).
- Ladest, S., Fales, A. M., Domard, A.
- Matteini, P., et al. Photothermally activated hybrid films for quantitative confined release of chemical species. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 52, 5956-5960 (2013).
- Khor, E., Lim, L. Y.
- Kennedy, L. C., et al. T cells enhance gold nanoparticle delivery to tumors in vivo. Nanoscale Res. Lett. 6 (1), 283 (2011).
- Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. J. Nanopart. Res. 9 (6), 1109-1124 (2007).
- Jokerst, J. V., Thangaraj, M., Kempen, P. J., Sinclair, R., Gambhir, S. S. Photoacoustic imaging of mesenchymal stem cells in living mice via silica-coated gold nanorods. ACS Nano. 6 (7), 5920-5930 (2012).
- Ding, H., et al. Gold nanorods coated with multilayer polyelectrolyte as contrast agents for multimodal imaging. J. Phys. Chem. C. 111 (34), 12552-12557 (2007).
- Esposito, G., et al. et al. In vivo laser assisted microvascular repair and end-to-end anastomosis by means of indocyanine green-infused chitosan patches: A pilot study. Lasers Surg. Med. 45 (5), 318-325 (2013).
