Abstract
Gull nanorods er attraktive for en rekke biomedisinske applikasjoner, for eksempel fototermiske ablasjon og foto-akustiske avbildning av kreft, takket være deres intense optisk absorbans i nær-infrarøde vinduet, lav cytotoksisitet og potensial til hjem i svulstene. Men fortsatt gjenstår sine leveranser til svulster et problem. En innovativ tilnærming består av utnyttelse av tropisme av tumorassosierte makrofager som kan lastes med gull nanorods in vitro. Her beskriver vi forberedelse og foto-akustiske inspeksjon av cellulære biler inneholder gull nanorods. PEGylerte gull nanostaver er modifisert med kvaternære ammoniumforbindelser, for å oppnå en kationisk profil. Ved kontakt med murine makrofager i vanlige petriskåler, er disse partiklene funnet å gjennomgå massiv opptak i endocytiske vesikler. Da disse cellene er innleiret i biopolymeric hydrogeler, som brukes til å verifisere at stabiliteten av foto-akustiske omdannelseav partiklene holdes i deres inkludering i cellulære kjøretøyer. Vi er sikre på at disse resultatene kan gi ny inspirasjon for utvikling av nye strategier for å levere Plasmonic partikler til svulster.
Introduction
I løpet av det siste tiåret, har ulike Plasmonic partikler som gullnanostaver, nanoshells og nanocages, fått stor oppmerksomhet for applikasjoner i biomedisinsk optikk 1, 2, 3, 4. I strid med standard gull nanospheres, disse nyere partikler resonere i nær infrarød (NIR) vindu som gir dypeste optisk penetrasjon gjennom kroppen og høyest optisk kontrast løpet endogene deler 1. Denne funksjonen har vekket interesse for innovative applikasjoner, for eksempel foto-akustiske (PA) bildebehandling og fototermiske ablasjon av kreft. Imidlertid flere problemer begrense den kliniske inntrengning av disse partiklene. For eksempel, deres optisk aktivering har en tendens til å indusere deres overoppvarming og for å modifisere deres funksjonelle former mot mer sfæriske profiler, som driver en photoinstability 5, 6, 7, 8 sup>, 9. Et annet problem som dominerer den vitenskapelige debatten er deres systemisk levering i svulstene. Spesielt gull nanorods kombinere størrelser som er ideell for å gjennomsyre svulster som viser økt permeabilitet og oppbevaring og enkel konjugering med spesifikke prober av ondartede markører. Derfor er deres forberedelse for en direkte injeksjon i blodstrømmen oppfattes som en mulig ordning 10, 11, 12, 13. Imidlertid er denne rute problematisk, med de fleste av partiklene bli fanget opp av den mononukleære fagocytt-systemet 10, 11, 12. I tillegg er en annen bekymring den optiske og biokjemisk stabilitet av partiklene etter sirkulasjon gjennom legemet 14. Når partiklene mister kolloidal stabilitet og samlet, kan deres Plasmonic funksjoner og varmeoverførings dynamikk lider plasmonic koplingen 15, 16, 17 og kryss overoppheting 18.
Mer nylig har begrepet å utnytte tropisme av tumorassosierte makrofager dukket opp som et smart alternativ 19, 20, 21. Disse cellene holder en medfødt evne til å oppdage og gjennomsyre svulster med høy spesifisitet. Derfor kan man perspektiv være å isolere disse cellene fra en pasient, legger du dem med gull nanorods in vitro og deretter injisere dem tilbake til pasienten, med den hensikt å bruke dem som cellulære biler som har ansvaret for leveransen. En annen fordel ville være å få bedre kontroll over den optiske og biokjemisk stabilitet av partiklene, fordi deres biologiske grensesnitt ville være konstruert in vitro. Likevel, forestillinger av disse cellulære biler som optiske kontrastmidler trenger en kritisk analyse.
I dette arbeidet, beskriver vi forberedelse og kritiske spørsmål om cellular kjøretøyer som inneholder gull nanorods for PA avbildning av kreft. PEGylerte gull nanostaver er modifisert med kvartære ammoniumforbindelser 22, for å oppnå en kationisk profil som er ventet å fremme deres interaksjoner med plasmamembraner 23, 24. Disse partiklene gjennomgå effektiv og uspesifikk opptak fra de fleste cellulære slag, forhåpentligvis uten å forstyrre mye med sine biologiske funksjoner. Murine makrofager er lastet med opp til så mange som 200, 000 kationiske gull nanorods per celle, som blir trange innenfor stramme endocytiske vesikler. Denne konfigurasjonen skulle oppstå bekymring, på grunn av trusselen om plasmonic kopling og tverr overoppheting inni disse blemmer. Derfor er makrofager innleiret i biopolymeric hydrogeler som etterligner biologisk vev, for å verifisere at det meste av stabiliteten PA omdannelse av partiklene holdes i overføringen fra vekstmediet til de endocytiske vesikler. effective målekriterier er utarbeidet for å måle stabiliteten av PA omdannelse under betingelser med umiddelbar interesse for PA-avbildning. En omforming terskel er satt helt på utbruddet av optisk ustabilitet etter et tog av 50 laserpulser med den typiske repetisjonsfrekvens på 10 Hz.
Vi er sikre på at disse resultatene kan gi momentum for utvikling av nye strategier for å levere Plasmonic partikler til svulster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Alle konsentrasjoner av gull nanorods er uttrykt i form av nominelle Au molaritetene. Til sammenligning med andre verker, oppmerksom på at en M Au tilsvarer omtrent 20 mikrometer gull nanorods, i vårt tilfelle.
1. Utarbeidelse av Cationic Gold nanorods
Merk: Fremgangsmåten begynner med syntesen av cetrimonium-bromid (CTAB) -capped gullnanostaver ved autokatalytisk reduksjon av HAuCl 4 med askorbinsyre, i henhold til protokollen introdusert av Nikoobakht et al 25 og innrettet i henhold til Ratto et al 26... Da disse gull nanostaver er modifisert for å oppnå mer biokompatibilitet og affinitet til plasmamembraner, ved en kombinasjon av polyetylenglykol tråder 10, 11, 27, 28 og 22 kvaternære ammoniumforbindelser.
- Rens 24 ml CTAB-capped gull nanorods på en-konsentrasjonn av 450 pM Au ved to cykler av sentrifugering (12 000 xg, 30 min) og dekantering. Sørg for at forholdet mellom døde volum til opprinnelig volum er rundt 1/200 eller lavere for alle sentrifugeringstrinn i denne protokollen. Bruk 500 uM vandig CTAB som en vaskeoppløsning, og til slutt overfører partiklene inn i 6 ml 100 mM acetatbuffer ved pH 5 inneholdende 500 uM CTAB og 0,005% (v / v) polysorbat 20.
- Tilsett 30 ul 10 mM vandig alfa-metoksy-omega-merkapto-poly (etylenglykol) (MW ~ 5.000) og la det reagere i 30 minutter ved 37 ° C.
- Tilsett 30 ul 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N -trimethylammonium bromid i dimetylsulfoksyd og la i ro i 24 timer ved 37 ° C.
- Tilsett deretter 18 ml 0,005% (v / v) polysorbat 20 i vann og rense disse partiklene ved hjelp av fire sykluser av sentrifugering (12 000 xg, 30 min) og dekantering. Bruk 0,005% (v / v) polysorbat 20 i vann som vaskeløsning, og til slutt overfører partiklene inn i 2,4 ml steril PBS ved pH7,4. Den endelige nominelle konsentrasjonen av gull er 4,5 mM.
2. Lasting av Murine Makrofager med gull nanorods
- Bruk monocytt / macrophagic cellelinje J774a.1 og DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum, 1 mM glutamin, 100 enheter / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin som kulturmedium. Plate 5 x 10 5 celler i fire petriskåler med 60 mm diameter og tillate dem å vokse i 24 timer, slik at den Subkonfluente ved tidspunktet for løsgjøring (se trinn 2.2).
- Gjennom hele-protokollen, opprettholde cellene under dyrkningsforhold standard (37 ° C, 5% CO2, 95% luft og 100% relativ fuktighet). Bruk en laminær kabinett og egnet personlig verneutstyr for å manipulere celler.
- Etter 24 timer, legger cellene med kationiske gull nanorods og forberede dem til å være innebygd i kitosan filmer:
- For å tillate partiklene å bli tatt opp av cellene, tilsett en aliquot på 4,5mM Au kationisk gull nanostaver i PBS i hver petriskål, for derved å oppnå en sluttkonsentrasjon på 100 uM Au. La petriskåler i inkubasjon i 24 timer.
- Deretter observere cellene under et optisk mikroskop for å bekrefte deres gode forhold og opplasting. Celler bør oppvise sin normale morfologi og et antall mørke intracellulære vesikler. Løsne cellene ved en skraper, slå sammen de fra to Petri-skåler, for å oppnå en passende mengde av celler for de følgende trinn (minst 2 x 10 6 celler), og sentrifuger dem (120 xg, 6 min) for å eliminere enhver overkant av kationiske gull nanorods. Den cellulære pellet bør se nesten svart.
- Suspendere pelleten i 2 ml PBS og tell cellene ved bruk av et Burker kammer. Sentrifuger en suspensjon inneholdende 2 x 10 6-celler (120 xg, 6 min) og fastsette deres pellet i 2 ml 3,6% (vekt / volum) formaldehyd i PBS i ti minutter ved romtemperatur. Til slutt, vaske dette pellet tre ganger av centrifugation (120 xg, 6 min) for å fjerne bindemiddel. Bruk PBS som vaskeløsning.
3. nedgraving av makrofager i Chitosan Films
Merk: særegne egenskaper kitosan 26, 27, 28, blir 29 utnyttes til å produsere biomimetic fantomer som inneholder makrofager farget med kationiske gull nanorods. Med hensyn til andre hydrogeler slik som agarose, mulig kitosan filmer som er mye sterkere og tynnere, noe som er kritisk for PA mikros 6. Fabrikasjon av disse fantomer blir utført i henhold til tidligere protokoller 29, 30, 31, med noen modifikasjoner som er foreskrevet i de follo 30.
- Fremstille en surgjort (pH 4,5, fremstilt ved tilsetning av eddiksyre) og viskøs 3% (w / v) lavmolekylært chitosan (midlere molekylvekt 120 kDa) løsning, grundig blandes ogla det homogen i 24 timer ved 40 ° C.
- Deretter blander murine makrofager som inneholder kationiske gull nanorods (2 x 10 6 celler) med 500 mL av kitosan løsning.
- For å oppnå ~ 50 mikrometer tykke fantomer, hell 250 mg av blandingen til 1,91 cm 2 polystyrenformer og la dem under en nitrogenstrøm i 24 timer. Deretter behandle disse prøvene med 500 mL 1 M NaOH, for å indusere kryssbinding, og skyll dem med 10 ml ultrarent vann.
4. Test av stabiliteten i Foto-akustisk Conversion
Merk: Stabiliteten i PA konvertering er undersøkt ved hjelp av PA eksperimenter med hjemmelagde oppsett som er beskrevet i ref 6.
- Suspendere en film inneholdende kitosan makrofagene i DI-vann, for eksempel ved bruk av en plastholder nedsenket i en petriskål, slik som å holde en avstand av ~ 5 mm fra bunnen av platen. Sett denne platen på en mikrometer XY scenenfor å styre prøveposisjon.
- Fokusere en laserstråle med ~ 5 nsek pulsvarighet i resonans med den langsgående plasmonic bånd av gullnanostaver (f.eks, fra et optisk parametrisk oscillator som pumpes av den tredje harmoniske av en Q-svitsjet Nd: YAG-laser med bølgelengde området fra 400 - 2500 nm og pulsvarighet på 5 nanosekunder) vinkelrett på filmoverflaten med et ~ 300 mikrometer sted diameter.
- Plassere et dempeledd foran laser utgang for å justere laseren fluence og bruke en strålesplitter for å konsentrere en del av laserstrålen til en energimåler (for eksempel en pyroelektrisk detektor) og overvåke innflytelse svingninger. Opprettholde den optiske fluence under ~ 1 mJ / cm 2 per puls under justering. Bruk passende laser vernebriller når laseren er på.
- Dypp en ultralydtransducer (frekvensområde på 1 - 20 MHz) i petriskål ~ 2 mm ut av filmens overflate og justere sin posisjon ved hjelp av mikrometer oversettelserog rotasjonstrinn for å maksimalisere PA signalet som sendes ut fra filmen.
- Bestem en sonde fluence F LO som ikke skader prøven 6:
- Bestråle et vilkårlig punkt av prøven ved en fluens rundt en mJ / cm2 per puls i minst 500 pulser. For hver puls, erverve tilsvarende PA signal fra ultralyd svingeren og laser innflytelse fra energimåler med et oscilloskop. Navn gjennomsnittlig fluence som F LO rettssaken.
- Beregn intensiteten av PA signal som sin topp-til-topp amplitude som en funksjon av pulsantall. For å motvekt laser intensitetsvariasjoner, normalisere amplituden av hvert signal PA til forholdet mellom dens egen fluence til F LO prøve. Analyser utviklingen av den normaliserte intensiteten PA som en funksjon av puls nummer og kontrollere dets stabilitet over tid.
- I tilfelle av ustabilitet, gjenta trinn 4.4.1 til 4.4.3 med en lavere verdi av F LO
- Mål en omforming terskel fluence:
- Velger en annen vilkårlig punkt av prøven og sonden en gjennomsnittlig PA intensitet (I LO a) i løpet av 500 pulser med F LO.
- Sett en nominell fluence større enn F LO og levere 50 pulser. Navn deres gjennomsnittlige innflytelse som F eks.
- Probe en gjennomsnittlig PA intensitet (I LO b) i løpet av 500 pulser med F LO igjen. Beregn forholdet R = I LO b / I LO en. En verdi for R nedenfor enhet gir bevis for en irreversibel endring av de optiske egenskapene til prøven.
- Bruk micrometric XY scenen for å flytte filmen og endre point av prøven tilfeldig. Gjenta trinn 4.5.1 til 4.5.4 med ulike verdier av F eks, for å ta noen verdier av R under, rundt og over enhet. 15 poeng er rimelige.
- Plot R som en funksjon av F EXC og identifisere omforming terskel fluence F th som den verdi når R begynner å avvike fra en utover statistisk usikkerhet. 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her er muligheten for mobilnettet kjøretøy som inneholder gull nanorods for PA avbildning av kreft vises sammen med typiske utfall av protokollen.
TEM-bilder i figur 1 viser det vanlige utseende av partiklene etter trinn 1, og deres cellulære kjøretøy etter trinn 2. Fremstillingen av partiklene og av cellene for TEM-avbildning er beskrevet andre steder 17. Kationiske gull nanorods gjennomgå en massiv opphopning i makrofager, som opprettholder normal morfologi. Partikler er funnet å være begrenset innenfor trange endocytiske vesikler.
Figur 2a viser et optisk overføring bilde av makrofager som inneholder kationiske gull nanorods og dispergert i en kitosan fantom etter trinn 3. Som påvist av denne mikrograf, gjør inkludering i kitosan hydrogel ikke enffect mobil morfologi. Celler blir godt dispergert gjennom hele prøven. Kontroll av chitosan filmer inneholdende gull nanostaver uten celler er homogene. Figur 2b viser at den typiske plasmonic bånd av gull nanorods bibeholdes når partiklene blir tatt opp av makrofager, i samsvar med vårt tidligere arbeid 14, 32. Derfor effekter som plasmonic kopling på segregering i endocytiske vesikler, og en differensial opptak av partikler med forskjellig størrelse og form som eksistere i en polydispers kolloid 28, 33 ikke spiller en vesentlig rolle i disse protokollene. Figur 2b viser også muligheten for kitosan som en optisk fantom.
Figur 3 viser utviklingen av R som funksjon av F eks målt i henhold til trinn 4 og gir et inntrykk av data og analyser som er nødvendige for determination av F th som per trinn 4.5.5. F th ble funnet å være (11 ± 1) mJ / cm 2 i dette eksempel. PA målinger på denne prøven ga signaler med signal-til-støy-forhold (SNR) som er større enn 20 når midlet over 500 pulser ved noen mJ / cm 2, noe som gir stor nøyaktighet for å undersøke stabiliteten av PA konvertering fra de cellulære kjøretøyer.
Figur 1. Kationisk gull nanostaver og makrofager karakterisering a: (650 x 500) nm 2 TEM bilde av as-syntetiserte gull nanostaver, b, c og d:. Henholdsvis (13 x 8,6) um 2, (2,3 x 1,7) mikrometer 2 og (870 × 650) nm 2 TEM bilder av makrofager behandlet med kationiske gull nanorods. Utseendet avpartiklene i panelet d er påvirket av deres tilbøyelighet i cellen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Chitosan film karakterisering en. Optisk overføring bildet av makrofager som inneholder kationiske gull nanorods og dispergert i en kitosan fantom b.: Optisk utryddelse spektra av kitosan fantomer som inneholder gull nanorods uten celler (solid svart linje, kontrollprøve) og makrofager som inneholder gull nanorods (brutt rød linje). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
<img alt = "Figur 3" src = "/ files / ftp_upload / 53328 / 53328fig3highres.jpg" width = "350" />
Figur 3. Cellular biler fotostabilitet. Ratio R av intensiteter av I LO tatt etter og før bestråling på hver F eks versus F eks. De feilfelt stammer fra signalsvingninger på F LO. Den omforming terskelen er hentet fra disse dataene som R faller under enhet. Den røde heltrukne linjen fungerer som en guide for øyet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oppfatningen å målrette tumor-assosiert makrofager fremstår som en kraftig konsept for å bekjempe kreft 34, 35, 36. Her, i stedet for deres ødeleggelse, er disse cellene rekruttert som cellulære kjøretøy for å bringe gull nanorods inn i en svulst, ved utnyttelse av deres tropisme. Dette perspektivet krever en gjennomtenkt design av partiklene, deres integrering i cellene og deres karakterisering. Vi har funnet at fotostabiliteten av murine makrofager lastet med kationiske gull nanorods ikke lider av innesperring av partikler i endocytiske vesikler, som innebærer at deres plasmonic kobling og tverr overoppheting er ikke kritiske. Vi hypotese at PEG tråder og forekomsten av figurer som er off-resonans, for eksempel gullnanosfærer, hindre partikler komme inn for stramt kontakt, som handler om deres diameter 17 (rundt 10 nm) og en termisk diffusjon lengde (rundt 30 nmi 5 EFF) for plasmonic kobling og kryss overoppheting, henholdsvis.
Protokollen er nyskapende i forhold til eksisterende metoder i utformingen av partiklene og i etterforskningen av sin fotostabilitet. Utformingen av gull nanorods i henhold til trinn 1 kombinerer observasjon ved Vigderman et al. 22 at kvartære ammoniumforbindelser er i stand til å drive en massiv opptak av gull nanorods inn endocytiske vesikler og den oppfatningen at cellen gjennomtrengende agenter med en kationisk profil 24, 37 kan bli integrert i en PEG skall 38 og forbli funksjonelt, mens få kolloidal stabilitet og biokompatibilitet 28. Faktisk trinn 1 ligner fremgangsmåten ved Yuan et al. 38, med erstatningen av cellegjennomtrengende peptider med mindre og billigere kvaternære ammoniumforbindelser. Med disse endringene, kationiske gull nanorods er multifunksjonelle og bærekraftig. Siden disse partikler;es er ment som kontrastmidler for PA bildebehandling, er en PA sonde ideelt å teste sine funksjonelle egenskaper. Måling av stabiliteten av PA omdannelse av definisjonen av en omforming terskel i trinn 4 er kvantitativ og reproduserbar, som er unike egenskaper i rammen av den vitenskapelige litteratur. Dessuten ser vi at denne metoden ikke krever kalibrering av PA utstyr.
Kritiske trinn i protokollen omfatter fabrikasjon av kitosan filmer å inspisere de cellulære kjøretøyer i form av deres effektivitet som kontrastmidler for PA bildebehandling. Kitosan er en lineær kjede biopolymer som omfatter glukosamin og N-acetyl glukosamin rester bundet sammen av 1,4-glykosidbindinger. Enkelte fysiokjemiske egenskaper av kitosan, for eksempel dens porestørrelse, porøsitet og mekaniske egenskaper, så vel som dens allsidighet og håndterbarhet, gjør det til et ideelt alternativ for fremstilling av hydrogeler i form av tynne filmer eller porøse membraner 29, 39, 40. Videre polysakkaridet ryggraden av kitosan er strukturelt lik glykosaminoglykaner, hovedkomponenten i den ekstracellulære matriks i bindevev, noe som har fremmet dens bruk for prosjektering biomimetisk og celle-støttestillas 41. Total, kitosan hydrogeler utviser termisk og elastisitetsmoduler som er representative for bindevev 29, 41, 42, som er ideelt for PA-testene. Forsiktighet bør utvises for å oppnå filmer med riktig tykkelse (50 um), lav optisk turbiditet og god homogenitet. Legg merke til at dosene som er gitt i trinn 3 har blitt optimalisert. Den viskøse suspensjon av murine makrofager i kitosan bør blandes med flid i henhold til punkt 3.2. Med disse instruksjonene, har disse filmene allerede blitt brukt til å sammenligne stabiliteten av PA konvertering av gull nanorods av ulik størrelse 6.
imidlebare modifikasjoner av protokollen omfatter fremstillingen av de kationiske gull nanostaver og cellulære kjøretøy i trinn 1 og 2. Fremgangsmåten i trinn 1 kan være gjenstand for inkrementelle forbedringer, f.eks, ved substitusjon av cellen penetrerende middel eller lengden av PEG tråder osv, for å minimere interferens med fysiologi av tumorassosierte makrofager. Bruken av ligander som er spesifikke for makrofagene, kan være et alternativ 43. Andre parametere som påvirker opptaket av partiklene omfatter deres størrelse og form 33 og deres uorganiske belegg. For eksempel kan et skall av silika gir en kombinasjon av høy internalisering 44, optisk stabilitet mot aggregering 17 og PA stabilitet 7, på bekostning av mer sofistikerte og mer fremmed materiale. Vi formodning at den endosomale vei av internalisering kan være en vanlig effekt 33, 43, 44
Begrensninger av protokollen inkluderer behovet for å bruke faste celler i stedet for levende celler, fordi resepter i trinn 3 er uforenlig med bevaring av cellular levedyktighet. Andre begrensninger er knyttet til behovet for en tilstrekkelig SNR i bestemmelsen av en sonde fluence i trinn 4.4, som oversettes til en tilstrekkelig kombinasjon av optisk absorbans og fotostabilitet av filmen.
Avslutningsvis har vi beskrevet en innovativ protokollen til å forberede og utføre en funksjonell karakterisering av mobilnettet kjøretøy som er gjennomførbare som kontrastmidler for fotoakustisk bildebehandling. Vi har funnet at innføringen av gull nanorods i murine makrofager ikke negativt påvirke deres fotostabilitet. Fokus for vår nåværende arbeid er på fysiologi av disse cellene, med en spesiell oppmerksomhet for sin levedyktighet og kjemotaktisk aktivitet. I fremtiden skal denne metode testes for å undersøke fremstillingen av forskjellige cellulære bærere inneholdende forskjellige oppløsninger av optiske kontrastmidler. PA Sonden kan også tjene til å teste targetability av optiske kontrastmidler til maligne celler in vitro,uten bruk av cellulære kjøretøyer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av Regione Toscana og EU innenfor rammen av ERANET + Prosjekter LUS BUBBLE og BI-TRE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma-Aldrich | H6269 | To synthesize gold nanorods |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma-Aldrich | 520918 | To synthesize gold nanorods |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | To synthesize gold nanorods |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | To synthesize gold nanorods |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | To synthesize gold nanoseeds | |
| MeO-PEG-SH | Iris Biotech | PEG1171 | To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da. |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | To PEGylate gold nanorods |
| (11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide | Sigma-Aldrich | 733305 | To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | To centrifuge PEGylated gold nanorods |
| PBS | Lonza | BE17-516F | To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells |
| J774a.1 | ATCC | TIB-67 | Monocyte/macrophage murine cell line |
| DMEM | Lonza | BE12-707F | Cell culture medium |
| FBS | Lonza | DE14-801F | To be added to cell culture medium |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | To be added to cell culture medium |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-602E | To be added to cell culture medium |
| Petri dish | NEST | 705001 | Cell culture dish |
| Cell scraper | EuroClone | ES7018 | To detach cells |
| Formaldehyde | Fluka | 47630 | To fix cells |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma-Aldrich | 448869 | 75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da. |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 306576 | To insolubilize chitosan and generate the hydrogel |
| Polystyrene cell culture plates | NEST | 702011 | Used as molds to fabricate chitosan hydrogels |
| Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser | Continuum, Santa Clara, USA | Surelite OPO plus | Source of optical excitation for photoacoustic tests |
| Pyroelectric detector | Gentec, Quebec, Canada | QE8SP | To monitor optical fluence for photoacoustic tests |
| Pre amplified needle hydrophone | Precision Acoustic, Dorset, UK | Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range | To measure photoacoustic signals |
References
- Ratto, F., Matteini, P., Centi, S., Rossi, F., Pini, R. Gold nanorods as new nanochromophores for photothermal therapies. J. Biophotonics. (1-2), 4-41 (2011).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41, 2740-2779 (2012).
- Hahn, M. A., Singh, A. K., Sharma, P., Brown, S. C., Moudgil, B. M. Nanoparticles as Contrast Agents for in-Vivo Bioimaging: Current Status and Future Perspectives. Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 3-27 (2011).
- Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Ther. Deliv. 3 (4), 457-478 (2012).
- Manohar, S., Ungureanu, C., Van Leeuwen, T. G. Gold nanorods as molecular contrast agents in photoacoustic imaging: The promises and the caveats. Contrast Media Mol. Imaging. 6 (5), 389-400 (2011).
- Cavigli, L., et al. Size Affects the Stability of the Photoacoustic Conversion of Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (29), 16140-16146 (2014).
- Chen, L. -C., et al. Enhanced photoacoustic stability of gold nanorods by silica matrix confinement. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016010 (2010).
- Ratto, F., et al. CW laser-induced photothermal conversion and shape transformation of gold nanodogbones in hydrated chitosan films. J. Nanopart. Res. 13, 4337-4348 (2011).
- Mercatelli, R., et al. Quantitative readout of optically encoded gold nanorods using an ordinary dark-field microscope. Nanoscale. 5 (20), 9645-9650 (2013).
- Von Maltzahn, G., et al. Computationally guided photothermal tumor therapy using long-circulating gold nanorod antennas. Cancer Res. 69 (9), 3892-3900 (2009).
- Jokerst, J. V., Cole, A. J., Van De Sompel, D., Gambhir, S. S. Gold nanorods for ovarian cancer detection with photoacoustic imaging and resection guidance via Raman imaging in living mice. ACS Nano. 6 (11), 10366-10377 (2012).
- Huang, X., et al. A reexamination of active and passive tumor targeting by using rod-shaped gold nanocrystals and covalently conjugated peptide ligands. ACS Nano. 4 (10), 5887-5896 (2010).
- Alkilany, A. M., Thompson, L. B., Boulos, S. P., Sisco, P. N., Murphy, C. J. Gold nanorods: Their potential for photothermal therapeutics and drug delivery, tempered by the complexity of their biological interactions. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 190-199 (2012).
- Centi, S., et al. In vitro assessment of antibody-conjugated gold nanorods for systemic injections. J. Nanobiotechnology. 12, 55 (2014).
- Jain, P. K., Eustis, S., El-Sayed, M. A. Plasmon coupling in nanorod assemblies: Optical absorption, discrete dipole approximation simulation, and exciton-coupling model. J. Phys. Chem. B. 110 (37), 18243-18253 (2006).
- Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries. Nano Lett. 9 (4), 1651-1658 (2009).
- Mazzoni, M., Ratto, F., Fortunato, C., Centi, S., Tatini, F., Pini, R. Partial Decoupling in Aggregates of Silanized Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (34), 20018-20025 (2014).
- Lapotko, D. O., Lukianova, E., Oraevsky, A. A. Selective laser nano-thermolysis of human leukemia cells with microbubbles generated around clusters of gold nanoparticles. Lasers Surg. Med. 38 (6), 631-642 (2006).
- Choi, M. R., et al. A cellular trojan horse for delivery of therapeutic nanoparticles into tumors. Nano Letters. 7 (12), 3759-3765 (2007).
- Dreaden, E. C., Mwakwari, S. C., La Austin,, Kieffer, M. J., Oyelere, A. K., El-Sayed, M. A. Small molecule-gold nanorod conjugates selectively target and induce macrophage cytotoxicity towards breast cancer cells. Small. 8 (18), 2819-2822 (2012).
- Yang, T. D., et al. Real-time phase-contrast imaging of photothermal treatment of head and neck squamous cell carcinoma: an in vitro study of macrophages as a vector for the delivery of gold nanoshells. J. Biomed. Opt. 17 (12), 128003 (2012).
- Vigderman, L., Manna, P., Zubarev, E. R. Quantitative Replacement of Cetyl Trimethylammonium Bromide by Cationic Thiol Ligands on the Surface of Gold Nanorods and Their Extremely Large Uptake by Cancer Cells. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 51 (3), 636-641 (2012).
- Richard, J. P., et al. Cell-penetrating peptides: A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278 (1), 585-590 (2003).
- Delehanty, J. B., Boeneman, K., Bradburne, C. E., Robertson, K., Bongard, J. E., Medintz, I. L. Peptides for specific intracellular delivery and targeting of nanoparticles: implications for developing nanoparticle-mediated drug delivery. Ther. Deliv. 1, 411-433 (2010).
- Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods (NRs) using seed-mediated growth method. Chem. Mater. 15 (10), 1957-1962 (2003).
- Ratto, F., Matteini, P., Rossi, F., Pini, R. Size and shape control in the overgrowth of gold nanorods. J. Nanopart. Res. 12 (6), 2029-2036 (2009).
- Niidome, T., et al. PEG-modified gold nanorods with a stealth character for in vivo applications. J. Control. Release. 114 (3), 343-347 (2006).
- Tatini, F., et al. Size dependent biological profiles of PEGylated gold nanorods. J. Mater. Chem. B. 2, 6072-6080 (2014).
- Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., Centi, S., Dei, L., Pini, R. Chitosan films doped with gold nanorods as laser-activatable hybrid bioadhesives. Adv. Mater. 22 (38), 4313-4316 (2010).
- Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., de Angelis, M., Cavigli, L., Pini, R. Hybrid nanocomposite films for laser-activated tissue bonding. J. Biophotonics. 5 (11-12), 868-877 (2012).
- Matteini, P., Tatini, F., Cavigli, L., Ottaviano, S., Ghini, G., Pini, R. Graphene as a photothermal switch for controlled drug release. Nanoscale. 6, 7947-7953 (2014).
- Ratto, F., Witort, E., et al. Plasmonic Particles that Hit Hypoxic Cells. Adv. Funct. Mater. 25 (2), 316-323 (2015).
- Chithrani, D. B. Intracellular uptake, transport, and processing of gold nanostructures. Molec. Membrane Biol. 27 (7), 299-311 (2010).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73 (3), 1128-1141 (2013).
- Mantovani, A., Allavena, P. The interaction of anticancer therapies with tumor-associated macrophages. J. Exp. Med. 212 (4), 435-445 (2015).
- Panni, R. Z., Linehan, D. C., DeNardo, D. G. Targeting tumor-infiltrating macrophages to combat cancer. Immunotherapy. 5 (10), 1075-1087 (2013).
- Oh, E., et al. Cellular uptake and fate of PEGylated gold nanoparticles is dependent on both cell-penetration peptides and particle size. ACS Nano. 5 (8), 6434-6448 (2011).
- Yuan, H., Fales, A. M., Vo-Dinh, T. TAT peptide-functionalized gold nanostars: Enhanced intracellular delivery and efficient NIR photothermal therapy using ultralow irradiance. J. Am. Chem. Soc. 134 (28), 11358-11361 (2012).
- Ladest, S., Fales, A. M., Domard, A. Multi-membrane hydrogels. Nature. 452, 76-79 (2008).
- Matteini, P., et al. Photothermally activated hybrid films for quantitative confined release of chemical species. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 52, 5956-5960 (2013).
- Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
- Kennedy, L. C., et al. T cells enhance gold nanoparticle delivery to tumors in vivo. Nanoscale Res. Lett. 6 (1), 283 (2011).
- Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. J. Nanopart. Res. 9 (6), 1109-1124 (2007).
- Jokerst, J. V., Thangaraj, M., Kempen, P. J., Sinclair, R., Gambhir, S. S. Photoacoustic imaging of mesenchymal stem cells in living mice via silica-coated gold nanorods. ACS Nano. 6 (7), 5920-5930 (2012).
- Ding, H., et al. Gold nanorods coated with multilayer polyelectrolyte as contrast agents for multimodal imaging. J. Phys. Chem. C. 111 (34), 12552-12557 (2007).
- Esposito, G., et al. et al. In vivo laser assisted microvascular repair and end-to-end anastomosis by means of indocyanine green-infused chitosan patches: A pilot study. Lasers Surg. Med. 45 (5), 318-325 (2013).
