Abstract
nanorods oro son atractivos para una variedad de aplicaciones biomédicas, tales como la ablación fototérmica y la formación de imagen fotoacústica de cáncer, gracias a su absorbancia óptica intensa en la ventana del infrarrojo cercano, baja citotoxicidad y el potencial para el hogar en los tumores. Sin embargo, su entrega a los tumores sigue siendo un problema. Un enfoque innovador consiste en la explotación de la tropismo de macrófagos asociados al tumor que se puede cargar con nanorods de oro en vitro. A continuación, se describe la preparación y la inspección de los vehículos fotoacústica celulares que contienen nanorods oro. nanorods oro PEGilados se modifican con compuestos de amonio cuaternario, con el fin de conseguir un perfil de catiónico. Tras contacto con los macrófagos de ratón en placas de Petri ordinarias, se encuentran estas partículas a someterse a la captación masiva en vesículas de endocitosis. A continuación, estas células se incrustan en hidrogeles biopoliméricos, que se utilizan para verificar que la estabilidad de la conversión fotoacústicade las partículas se retiene en su inclusión en los vehículos celulares. Estamos seguros de que estos resultados pueden proporcionar una nueva inspiración para el desarrollo de nuevas estrategias para suministrar partículas plasmónicas a los tumores.
Introduction
Durante la última década, diversas partículas plasmónicas como nanorods oro, nanocápsulas y nano-cajas, han recibido una atención considerable para aplicaciones en óptica biomédica 1, 2, 3, 4. En desacuerdo con nanoesferas de oro estándar, estas partículas nuevas resuenan en la ventana de infrarrojo cercano (NIR), que proporciona para la penetración más profunda óptica a través del cuerpo y mayor contraste óptico sobre componentes endógenos 1. Esta característica ha despertado interés para aplicaciones innovadoras, tales como la formación de imagen fotoacústica (PA) y la ablación fototérmica de cáncer. Sin embargo, varias cuestiones restringen la penetración clínica de estas partículas. Por ejemplo, su activación óptica tiende a inducir su sobrecalentamiento y modificar sus formas funcionales hacia perfiles más esféricas, que impulsa un fotoinestabilidad 5, 6, 7, 8 sup>, 9. Otro tema que domina el debate científico es su liberación sistémica en los tumores. En particular, nanobastones oro combinan tamaños que son ideales para impregnar los tumores que muestran una mayor permeabilidad y retención y la facilidad de conjugación con sondas específicas de marcadores malignos. Por lo tanto, su preparación para una inyección directa en el torrente sanguíneo se percibe como un esquema viable 10, 11, 12, 13. Sin embargo, esta ruta sigue siendo problemática, con la mayoría de las partículas de quedar capturado por el sistema de fagocitos mononucleares 10, 11, 12. Además, otra preocupación es la estabilidad óptica y bioquímica de las partículas después de la circulación a través del cuerpo 14. Cuando las partículas pierden su estabilidad coloidal y agregada, sus características plasmónicas y la dinámica de transferencia de calor pueden sufrir de acoplamiento plasmónica 15, 16, 17 y 18 a través del sobrecalentamiento.
Más recientemente, el concepto de explotar el tropismo de macrófagos asociados al tumor ha surgido como una alternativa inteligente 19, 20, 21. Estas células tienen una capacidad innata para detectar e impregnar los tumores con alta especificidad. Por lo tanto, un punto de vista puede ser para aislar estas células de un paciente, cargarlos con nanorods de oro en vitro y luego inyectar de nuevo en el paciente, con la intención de utilizarlos como vehículos celulares responsables de la entrega. Otra ventaja sería contar con un mayor control sobre la estabilidad óptica y la bioquímica de las partículas, debido a que su interfaz biológica sería construida in vitro. Aún así, las prestaciones de estos vehículos celulares como agentes de contraste ópticos necesitan un análisis crítico.
En este trabajo se describe la preparación y temas críticos de Cellular vehículos que contienen nanorods de oro para la formación de imágenes de cáncer de PA. Nanorods oro PEGilados se modifican con compuestos de amonio cuaternario 22, a fin de lograr un perfil catiónico que se espera para promover su interacción con las membranas plasmáticas 23, 24. Estas partículas se someten a la absorción eficiente y no específica de la mayoría de tipos celulares, es de esperar sin interferir mucho con sus funciones biológicas. macrófagos murinos se cargan con hasta un máximo de 200, 000 nanobastones oro catiónicos por célula, que quedan confinadas dentro de las vesículas de endocitosis apretados. Esta configuración debe surgir la preocupación, debido a la amenaza de acoplamiento plasmónica y transversal sobrecalentamiento dentro de estas vesículas. Por lo tanto, los macrófagos se incrustan en hidrogeles biopoliméricos que imitan los tejidos biológicos, con el fin de verificar que la mayor parte de la estabilidad de la conversión de PA de las partículas se retiene en la transferencia del medio de crecimiento a las vesículas de endocitosis. effectivcriterios de medición electrónicos se elaboran con el fin de medir la estabilidad de conversión de PA en condiciones de interés inmediato para obtener imágenes de PA. Un umbral de remodelación se establece en el mismo inicio de la inestabilidad óptica después de un tren de pulsos de láser 50 con la tasa de repetición típico de 10 Hz.
Estamos seguros de que estos resultados pueden proporcionar el impulso para el desarrollo de nuevas estrategias para suministrar partículas plasmónicas a los tumores.
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Protocol
Nota: Todas las concentraciones de oro nanorods se expresan en términos de molaridad Au nominales. Para la comparación con otras obras, tenga en cuenta que 1 M Au corresponde aproximadamente a 20 M nanobastones de oro, en nuestro caso.
1. Preparación de Oro catiónico Nanorods
Nota: El método comienza con la síntesis de bromuro de cetrimonio (CTAB) -capped nanorods de oro por la reducción autocatalítica de HAuCl4 con ácido ascórbico, de acuerdo con el protocolo establecido por Nikoobakht et al 25 y adaptado según Ratto et al 26... Entonces estos nanorods de oro se modificaron con el fin de ganar más biocompatibilidad y afinidad por las membranas plasmáticas, por la combinación de polietilenglicol hebras 10, 11, 27, 28 y 22 compuestos de amonio cuaternario.
- Purificar 24 ml nanobastones oro coronadas de CTAB en una concentration de 450 M Au mediante dos ciclos de centrifugación (12.000 xg, 30 min) y decantación. Asegúrese de que la relación del volumen muerto al volumen inicial es de alrededor de 1/200 o más bajo de todos los pasos de centrifugación en este protocolo. Utilice CTAB 500 M acuosa como una solución de lavado y, finalmente, transferir las partículas en tampón de acetato de 6 ml 100 mM a pH 5 que contiene 500 mM CTAB y polisorbato 20 0,005% (v / v).
- Añadir 30 l 10 mM acuoso alfa-metoxi-omega-mercapto-poli (etileno glicol) (MW ~ 5000) y dejar reaccionar durante 30 min a 37 ° C.
- Añadir 30 l de 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N bromuro de trimetilamonio en dimetilsulfóxido y dejar en reposo durante 24 horas a 37 ° C.
- A continuación, añadir 18 ml 0,005% (v / v) de polisorbato 20 en agua y purificar estas partículas de cuatro ciclos de centrifugación (12.000 xg, 30 min) y decantación. Utilice 0,005% (v / v) de polisorbato 20 en agua como solución de lavado y, finalmente, transferir las partículas en 2,4 ml de PBS estéril a pH7.4. La concentración nominal final del oro es de 4,5 mm.
2. La carga de macrófagos murinos con oro Nanorods
- Utilice la línea celular de monocitos / macrofágica J774A.1 y DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, glutamina 1 mM, 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina como medio de cultivo. Placa de 5 x 10 5 células en cuatro placas de Petri de 60 mm de diámetro y les permiten crecer durante 24 horas, a fin de ser subconfluentes en el momento de la separación (véase el paso 2.2).
- Durante todo el protocolo, mantener las células bajo condiciones de cultivo estándar (37 ° C, 5% de CO 2, 95% de aire y 100% de humedad relativa). Utilizar una cabina de flujo laminar y equipo de protección personal adecuado para manipular las células.
- Después de 24 horas, cargar las células con nanobastones oro catiónicos y prepararlos para ser embebido en películas de quitosano:
- Con el fin de permitir que las partículas sean absorbidos por las células, añadir una alícuota de 4,5Au mM nanobastones oro catiónico en PBS a cada placa de Petri, con el fin de lograr una concentración final de 100 mM de Au. Deje las placas de Petri en la incubación durante 24 horas.
- A continuación, observar las células bajo un microscopio óptico para confirmar sus buenas condiciones y la carga. Las células deben exhibir su morfología normal y un número de vesículas intracelulares oscuros. Separar las células por un rascador, fusionar los de dos placas de Petri, con el fin de lograr una cantidad adecuada de células para los siguientes pasos (al menos 2 x 10 6 células), y centrifúguelas (120 xg, 6 min) para eliminar cualquier el exceso de oro nanorods catiónicos. El sedimento celular debería ser casi negro.
- Suspender el sedimento en 2 ml de PBS y contar las células por el uso de una cámara de Bürker. Centrifugar una suspensión que contiene 2 x 10 6 células (120 xg, 6 min) y fijar su sedimento en 2 ml 3,6% (w / v) de formaldehído en PBS durante diez minutos a temperatura ambiente. Por último, lavar esta pastilla tres veces por centrifugation (120 xg, 6 min) con el fin de eliminar el fijador. Utilice PBS como solución de lavado.
3. Integración de los macrófagos en quitosano Films
Nota: Las propiedades peculiares de quitosano 26, 27, 28, 29 son explotados para producir fantasmas biomiméticos que contienen macrófagos teñidos con oro nanorods catiónicos. Con respecto a otros hidrogeles tales como agarosa, quitosán permite películas que son mucho más fuertes y más delgada, lo cual es crítico para la PA 6 microscopía. La fabricación de estos fantasmas se lleva a cabo de acuerdo con protocolos anteriores 29, 30, 31, con algunas modificaciones como se prescribe en las siguientes 30.
- Preparar un acidificada (pH 4,5, que se obtiene por la adición de ácido acético) y viscoso 3% (w / v) de quitosano de bajo peso molecular (PM medio 120 kDa) solución, mezclar bien ydejar que homogeneizar durante 24 horas a 40 ° C.
- A continuación, la mezcla macrófagos murinos contienen nanorods oro catiónico (2 x 10 6 células) con 500 l de solución de quitosano.
- Con el fin de obtener ~ 50 micras de espesor fantasmas, verter 250 mg de la mezcla en 1,91 cm 2 moldes de poliestireno y dejarlos bajo una corriente de nitrógeno durante 24 hr. Después de ello, el tratamiento de estas muestras con NaOH 500 l 1 M, con el fin de inducir la reticulación, y enjuague con 10 ml de agua ultrapura.
4. Prueba de la estabilidad de fotoacústica Conversión
Nota: La estabilidad de la conversión PA se investigó por medio de experimentos de PA con la configuración de fabricación casera que se describe en la referencia 6.
- Suspender una película de quitosano que contiene los macrófagos en agua DI, por ejemplo por el uso de un soporte de plástico sumergida en una placa de Petri, a fin de mantener una distancia de ~ 5 mm desde la parte inferior de la placa. Ponga esta placa en una etapa XY micrométricocon el fin de controlar la posición de la muestra.
- Enfocar un haz láser con ~ 5 duración nseg pulso en resonancia con la banda plasmónica longitudinal de los nanorods de oro (por ejemplo, a partir de un oscilador paramétrico óptico bombeado por el tercer armónico de un Q-switched Nd: YAG con la gama de longitud de onda de 400 - 2500 nm y duración del pulso de 5 nseg) perpendicular a la superficie de la película con un diámetro de punto ~ 300 micras.
- Colocar un atenuador en frente de la salida de láser para sintonizar la fluencia del láser y el uso de un divisor de haz para enfocar parte del haz de láser a un contador de energía (por ejemplo, un detector piroeléctrico) y controlar las fluctuaciones de fluencia. Mantener la fluencia óptica por debajo de ~ 1 mJ / cm 2 por impulso durante la alineación. Utilizar gafas de seguridad del láser adecuada cada vez que el láser está encendido.
- Sumergir un transductor de ultrasonidos (rango de frecuencia de 1 - 20 MHz) en la placa de Petri ~ 2 mm fuera de la superficie de la película y ajustar su posición mediante el uso de traducciones micrométricasy las etapas de rotación para maximizar la señal emitida PA de la película.
- Determinar una fluencia sonda F LO que no dañe la muestra 6:
- Irradiar un punto de la muestra aleatoria a una fluencia alrededor de 1 mJ / cm 2 por impulso durante por lo menos 500 pulsos. Para cada pulso, adquirir la señal PA correspondiente del transductor de ultrasonidos y fluencia del láser desde el contador de energía con un osciloscopio. Nombrar la fluencia de la media, como prueba F LO.
- Calcular la intensidad de la señal de PA como su amplitud de pico a pico como una función del número de impulsos. Con el fin de contrapeso las fluctuaciones de intensidad de láser, normalizar la amplitud de cada señal de PA a la relación de su propia influencia a juicio F LO. Analizar la tendencia de la intensidad de PA normalizado como una función del número de impulsos y verificar su estabilidad en el tiempo.
- En el caso de inestabilidad, repita los pasos 4.4.1 a 4.4.3 con un menor valor de F LO
- Medir una fluencia de umbral de la remodelación:
- Elegir otro punto de la muestra aleatoria y la sonda una intensidad media PA (I LO a) a más de 500 pulsos a F LO.
- Establecer una fluencia nominal superior F LO y entregar 50 pulsos. Nombrar a su fluencia promedio como F exc.
- Sondear una intensidad media PA (I LO b) a más de 500 pulsos a F LO una vez más. Se calcula la relación R = I LO b / I LO a. Un valor de R inferior a la unidad da evidencia de un cambio irreversible de las propiedades ópticas de la muestra.
- Usar la plataforma XY micrométrico para mover la película y cambiar el point de la muestra al azar. Repita los pasos 4.5.1 a 4.5.4 con diferentes valores de F exc, a fin de tener unos valores de R por debajo, alrededor y encima de la unidad. 15 puntos son razonables.
- Parcela R como una función de F exc e identificar el umbral de remodelación de fluencia F TH como que el valor cuando R comienza a diferir de un más allá de incertidumbre estadística. 6
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Representative Results
En este caso, la viabilidad de los vehículos celulares que contienen nanorods de oro para la formación de imágenes de cáncer de PA se muestra junto con los resultados típicos del protocolo.
Las imágenes TEM de la figura 1 muestran el aspecto habitual de las partículas después de la etapa 1 y sus vehículos celulares después de la etapa 2. La preparación de las partículas y de las células para obtener imágenes de TEM se describe en otro 17. nanobastones oro catiónicos se someten a una acumulación masiva en los macrófagos, que mantienen su morfología normal. Las partículas se encuentran para ser confinado dentro de las vesículas de endocitosis apretados.
La Figura 2a muestra una imagen de transmisión óptica de los macrófagos que contienen nanorods oro catiónicos y se dispersa en un maniquí de quitosano después de la etapa 3. Como demostrado por esta micrografía, la inclusión en el hidrogel de quitosano no hace unafecto la morfología celular. Las células están bien dispersos en la muestra. Controles de películas de quitosano que contienen nanorods oro sin células son homogéneos. La figura 2b muestra que la banda plasmónica típico de nanobastones oro se mantiene cuando las partículas son absorbidas por los macrófagos, consistente con nuestros trabajos anteriores 14, 32. Por lo tanto, efectos tales como el acoplamiento plasmónica en la segregación en las vesículas de endocitosis y una captación diferencial de las partículas de diferente tamaño y forma que coexisten en un coloide polidisperso 28, 33 no juegan un papel importante en estos protocolos. Figura 2b también demuestra la viabilidad de quitosano como un fantasma óptica.
La figura 3 muestra la tendencia de R como una función de F exc medida de acuerdo con el paso 4 y da una idea de los datos y el análisis que se requieren para la determminación de M ª como en el paso 4.5.5. Se encontró F TH ser (11 ± 1) mJ / cm 2 en este ejemplo. Mediciones de PA en esta muestra dio señales con la relación señal a ruido (SNR) mayor que 20 cuando se promedia sobre 500 pulsos a pocos mJ / cm 2, que proporciona una alta precisión para la investigación de la estabilidad de la conversión de PA a partir de los vehículos celulares.
Imagen (650 × 500) nm 2 TEM de nanorods de oro tal como se sintetiza, b, c y d:: Figura 1. catiónico nanorods oro y macrófagos una caracterización. Respectivamente (13 × 8,6) micras 2, (2,3 × 1,7) micras 2 y (870 × 650) nm 2 imágenes TEM de los macrófagos tratados con oro nanorods catiónicos. La apariencia delas partículas en el panel D se ve afectada por su inclinación en la célula. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Caracterización película de quitosano a:. La imagen de transmisión óptica de los macrófagos que contienen nanorods oro catiónicos y se dispersa en un fantasma quitosano b:. Los espectros de extinción óptica de fantasmas de quitosano que contienen nanorods oro sin células (línea de color negro sólido, la muestra de control) y los macrófagos que contienen oro nanobastones (línea discontinua roja). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
<img alt = "Figura 3" src = "/ files / ftp_upload / 53328 / 53328fig3highres.jpg" width = "350" />
Figura 3. celular vehículos fotoestabilidad. Relación de R de las intensidades de I LO tomadas después y antes de la irradiación en cada F exc frente a F exc. Las barras de error se originan a partir de las fluctuaciones de señal en F LO. El umbral de la remodelación se extrae de estos datos como R cae por debajo de la unidad. La línea continua roja sirve como una guía para el ojo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La idea de orientar los macrófagos asociados a tumores se está convirtiendo en un concepto de gran alcance para combatir el cáncer 34, 35, 36. Aquí, en lugar de su destrucción, estas células son reclutados como vehículos celulares para llevar nanobastones de oro en un tumor, por la explotación de su tropismo. Esta perspectiva requiere un cuidadoso diseño de las partículas, su integración en las células y su caracterización. Hemos encontrado que la fotoestabilidad de macrófagos murinos cargados de oro nanorods catiónicos no sufre de confinamiento de partículas dentro de las vesículas de endocitosis, lo que implica que su acoplamiento plasmónica y transversal sobrecalentamiento no son críticos. Nuestra hipótesis es que las cadenas de PEG y la incidencia de las formas que son fuera de resonancia, tales como las nanoesferas de oro, evitar que las partículas de entrar en contacto demasiado apretado, que es acerca de sus diámetros 17 (alrededor de 10 nm) y una longitud de difusión térmica (alrededor 30 nmen 5 nseg) para el acoplamiento plasmónica y transversal sobrecalentamiento, respectivamente.
El protocolo es innovadora con respecto a los métodos existentes en el diseño de las partículas y de la investigación de su fotoestabilidad. El diseño de oro nanorods de acuerdo con el paso 1 combina la observación de Vigderman et al. 22 que compuestos de amonio cuaternario son capaces de conducir una captación masiva de oro nanorods en vesículas de endocitosis y la noción de que las células agentes de penetración con un perfil catiónico 24, 37 pueden ser incrustado dentro de un PEG de concha 38 y siguen siendo funcionales, al tiempo que obtienen la estabilidad coloidal y biocompatibilidad 28. De hecho paso 1 se asemeja el método por Yuan et al. 38, con la sustitución de péptidos penetrantes de células con compuestos de amonio cuaternario más pequeños y más baratos. Con estas modificaciones, nanobastones oro catiónicos son multifuncionales y sostenible. Dado que estos particlES están destinados como agentes de contraste para formación de imágenes PA, una sonda de PA es ideal para probar sus características funcionales. La medición de la estabilidad de la conversión de PA por la definición de un umbral de remodelación en el paso 4 es cuantitativa y reproducible, que son características únicas en el marco de la literatura científica. Además, observamos que este método no requiere una calibración de los equipos PA.
Los pasos críticos en el protocolo incluyen la fabricación de las películas de quitosan para inspeccionar los vehículos celulares en términos de su eficacia como agentes de contraste para formación de imágenes PA. El quitosano es un biopolímero de cadena lineal que comprende los restos de glucosamina y N-acetil glucosamina unidas por enlaces glicosídicos 1,4. Algunas de las características fisicoquímicas del quitosano, tales como su tamaño de poro, la porosidad y las propiedades mecánicas, así como su versatilidad y manejabilidad, lo convierten en una opción ideal para la fabricación de hidrogeles en forma de películas delgadas o membranas porosas 29, 39, 40. Además, la cadena principal de polisacárido de quitosano es estructuralmente similar a los glicosaminoglicanos, el componente principal de la matriz extra-celular de los tejidos conectivos, que ha promovido su uso para biomimético ingeniería y andamios de soporte celular 41. En general, los hidrogeles de quitosano presentan módulos de elasticidad térmicas y elásticas que son representativas del tejido conectivo 29, 41, 42, lo que es ideal para las pruebas de AP. Se debe tener cuidado para conseguir películas con el espesor adecuado (50 micras), baja turbidez óptica y buena homogeneidad. Tenga en cuenta que las dosis dadas en el paso 3 se han optimizado. La suspensión viscosa de macrófagos murinos en quitosano se debe mezclar con diligencia según la etapa 3.2. Con estas instrucciones, estas películas ya se han utilizado para comparar la estabilidad de la conversión de PA nanobastones de oro de diferentes tamaños 6.
Possibles modificaciones del protocolo incluyen la preparación de los nanorods oro catiónicos y vehículos celulares en los pasos 1 y 2. El método en el paso 1 puede ser objeto de mejoras incrementales, por ejemplo, mediante la sustitución del agente de penetración celular o la longitud de la PEG hebras etc., con el fin de minimizar cualquier interferencia con la fisiología de los macrófagos asociados al tumor. El uso de ligandos que son específicos para los macrófagos puede ser una opción 43. Otros parámetros que afectan a la absorción de las partículas incluyen su tamaño y la forma 33 y su revestimiento inorgánico. Por ejemplo, una cáscara de sílice puede dar una combinación de alta internalización 44, estabilidad óptica frente a la agregación y la estabilidad PA 17 7, a expensas de una mayor sofisticación y el material más ajeno. Se conjetura que la vía endosomal de internalización puede ser un efecto común 33, 43, 44
Limitaciones del protocolo incluyen la necesidad de utilizar células fijadas en lugar de células vivas, porque las recetas en el paso 3 son incompatibles con la preservación del celviabilidad lular. Otras restricciones se refieren a la necesidad de un SNR suficiente en la determinación de una fluencia de la sonda en el paso 4.4, que se traduce en una combinación suficiente de absorbancia óptica y la fotoestabilidad de la película.
En conclusión, hemos descrito un protocolo innovador para preparar y realizar una caracterización funcional de los vehículos celulares que son factibles como agentes de contraste para formación de imagen fotoacústica. Hemos encontrado que la introducción de oro nanorods en macrófagos murinos no afecta negativamente a su fotoestabilidad. El enfoque de nuestro trabajo actual se centra en la fisiología de estas células, con una atención especial para su viabilidad y la actividad quimiotáctica. En el futuro, este método se someterá a ensayo para investigar la preparación de diferentes vehículos celulares que contienen diferentes soluciones de agentes de contraste ópticos. La sonda PA también puede servir para probar la targetability de agentes de contraste ópticos de células malignas in vitro,sin el uso de vehículos celulares.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente apoyado por la Región Toscana y la Comunidad Europea en el marco de la burbuja ERA-NET + Proyectos LUS y BI-TRE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma-Aldrich | H6269 | To synthesize gold nanorods |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma-Aldrich | 520918 | To synthesize gold nanorods |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | To synthesize gold nanorods |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | To synthesize gold nanorods |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | To synthesize gold nanoseeds | |
| MeO-PEG-SH | Iris Biotech | PEG1171 | To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da. |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | To PEGylate gold nanorods |
| (11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide | Sigma-Aldrich | 733305 | To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | To centrifuge PEGylated gold nanorods |
| PBS | Lonza | BE17-516F | To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells |
| J774a.1 | ATCC | TIB-67 | Monocyte/macrophage murine cell line |
| DMEM | Lonza | BE12-707F | Cell culture medium |
| FBS | Lonza | DE14-801F | To be added to cell culture medium |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | To be added to cell culture medium |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-602E | To be added to cell culture medium |
| Petri dish | NEST | 705001 | Cell culture dish |
| Cell scraper | EuroClone | ES7018 | To detach cells |
| Formaldehyde | Fluka | 47630 | To fix cells |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma-Aldrich | 448869 | 75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da. |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 306576 | To insolubilize chitosan and generate the hydrogel |
| Polystyrene cell culture plates | NEST | 702011 | Used as molds to fabricate chitosan hydrogels |
| Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser | Continuum, Santa Clara, USA | Surelite OPO plus | Source of optical excitation for photoacoustic tests |
| Pyroelectric detector | Gentec, Quebec, Canada | QE8SP | To monitor optical fluence for photoacoustic tests |
| Pre amplified needle hydrophone | Precision Acoustic, Dorset, UK | Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range | To measure photoacoustic signals |
References
- Ratto, F., Matteini, P., Centi, S., Rossi, F., Pini, R. Gold nanorods as new nanochromophores for photothermal therapies. J. Biophotonics. (1-2), 4-41 (2011).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41, 2740-2779 (2012).
- Hahn, M. A., Singh, A. K., Sharma, P., Brown, S. C., Moudgil, B. M. Nanoparticles as Contrast Agents for in-Vivo Bioimaging: Current Status and Future Perspectives. Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 3-27 (2011).
- Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Ther. Deliv. 3 (4), 457-478 (2012).
- Manohar, S., Ungureanu, C., Van Leeuwen, T. G. Gold nanorods as molecular contrast agents in photoacoustic imaging: The promises and the caveats. Contrast Media Mol. Imaging. 6 (5), 389-400 (2011).
- Cavigli, L., et al. Size Affects the Stability of the Photoacoustic Conversion of Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (29), 16140-16146 (2014).
- Chen, L. -C., et al. Enhanced photoacoustic stability of gold nanorods by silica matrix confinement. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016010 (2010).
- Ratto, F., et al. CW laser-induced photothermal conversion and shape transformation of gold nanodogbones in hydrated chitosan films. J. Nanopart. Res. 13, 4337-4348 (2011).
- Mercatelli, R., et al. Quantitative readout of optically encoded gold nanorods using an ordinary dark-field microscope. Nanoscale. 5 (20), 9645-9650 (2013).
- Von Maltzahn, G., et al. Computationally guided photothermal tumor therapy using long-circulating gold nanorod antennas. Cancer Res. 69 (9), 3892-3900 (2009).
- Jokerst, J. V., Cole, A. J., Van De Sompel, D., Gambhir, S. S. Gold nanorods for ovarian cancer detection with photoacoustic imaging and resection guidance via Raman imaging in living mice. ACS Nano. 6 (11), 10366-10377 (2012).
- Huang, X., et al. A reexamination of active and passive tumor targeting by using rod-shaped gold nanocrystals and covalently conjugated peptide ligands. ACS Nano. 4 (10), 5887-5896 (2010).
- Alkilany, A. M., Thompson, L. B., Boulos, S. P., Sisco, P. N., Murphy, C. J. Gold nanorods: Their potential for photothermal therapeutics and drug delivery, tempered by the complexity of their biological interactions. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 190-199 (2012).
- Centi, S., et al. In vitro assessment of antibody-conjugated gold nanorods for systemic injections. J. Nanobiotechnology. 12, 55 (2014).
- Jain, P. K., Eustis, S., El-Sayed, M. A. Plasmon coupling in nanorod assemblies: Optical absorption, discrete dipole approximation simulation, and exciton-coupling model. J. Phys. Chem. B. 110 (37), 18243-18253 (2006).
- Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries. Nano Lett. 9 (4), 1651-1658 (2009).
- Mazzoni, M., Ratto, F., Fortunato, C., Centi, S., Tatini, F., Pini, R. Partial Decoupling in Aggregates of Silanized Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (34), 20018-20025 (2014).
- Lapotko, D. O., Lukianova, E., Oraevsky, A. A. Selective laser nano-thermolysis of human leukemia cells with microbubbles generated around clusters of gold nanoparticles. Lasers Surg. Med. 38 (6), 631-642 (2006).
- Choi, M. R., et al. A cellular trojan horse for delivery of therapeutic nanoparticles into tumors. Nano Letters. 7 (12), 3759-3765 (2007).
- Dreaden, E. C., Mwakwari, S. C., La Austin,, Kieffer, M. J., Oyelere, A. K., El-Sayed, M. A. Small molecule-gold nanorod conjugates selectively target and induce macrophage cytotoxicity towards breast cancer cells. Small. 8 (18), 2819-2822 (2012).
- Yang, T. D., et al. Real-time phase-contrast imaging of photothermal treatment of head and neck squamous cell carcinoma: an in vitro study of macrophages as a vector for the delivery of gold nanoshells. J. Biomed. Opt. 17 (12), 128003 (2012).
- Vigderman, L., Manna, P., Zubarev, E. R. Quantitative Replacement of Cetyl Trimethylammonium Bromide by Cationic Thiol Ligands on the Surface of Gold Nanorods and Their Extremely Large Uptake by Cancer Cells. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 51 (3), 636-641 (2012).
- Richard, J. P., et al. Cell-penetrating peptides: A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278 (1), 585-590 (2003).
- Delehanty, J. B., Boeneman, K., Bradburne, C. E., Robertson, K., Bongard, J. E., Medintz, I. L. Peptides for specific intracellular delivery and targeting of nanoparticles: implications for developing nanoparticle-mediated drug delivery. Ther. Deliv. 1, 411-433 (2010).
- Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods (NRs) using seed-mediated growth method. Chem. Mater. 15 (10), 1957-1962 (2003).
- Ratto, F., Matteini, P., Rossi, F., Pini, R. Size and shape control in the overgrowth of gold nanorods. J. Nanopart. Res. 12 (6), 2029-2036 (2009).
- Niidome, T., et al. PEG-modified gold nanorods with a stealth character for in vivo applications. J. Control. Release. 114 (3), 343-347 (2006).
- Tatini, F., et al. Size dependent biological profiles of PEGylated gold nanorods. J. Mater. Chem. B. 2, 6072-6080 (2014).
- Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., Centi, S., Dei, L., Pini, R. Chitosan films doped with gold nanorods as laser-activatable hybrid bioadhesives. Adv. Mater. 22 (38), 4313-4316 (2010).
- Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., de Angelis, M., Cavigli, L., Pini, R. Hybrid nanocomposite films for laser-activated tissue bonding. J. Biophotonics. 5 (11-12), 868-877 (2012).
- Matteini, P., Tatini, F., Cavigli, L., Ottaviano, S., Ghini, G., Pini, R. Graphene as a photothermal switch for controlled drug release. Nanoscale. 6, 7947-7953 (2014).
- Ratto, F., Witort, E., et al. Plasmonic Particles that Hit Hypoxic Cells. Adv. Funct. Mater. 25 (2), 316-323 (2015).
- Chithrani, D. B. Intracellular uptake, transport, and processing of gold nanostructures. Molec. Membrane Biol. 27 (7), 299-311 (2010).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73 (3), 1128-1141 (2013).
- Mantovani, A., Allavena, P. The interaction of anticancer therapies with tumor-associated macrophages. J. Exp. Med. 212 (4), 435-445 (2015).
- Panni, R. Z., Linehan, D. C., DeNardo, D. G. Targeting tumor-infiltrating macrophages to combat cancer. Immunotherapy. 5 (10), 1075-1087 (2013).
- Oh, E., et al. Cellular uptake and fate of PEGylated gold nanoparticles is dependent on both cell-penetration peptides and particle size. ACS Nano. 5 (8), 6434-6448 (2011).
- Yuan, H., Fales, A. M., Vo-Dinh, T. TAT peptide-functionalized gold nanostars: Enhanced intracellular delivery and efficient NIR photothermal therapy using ultralow irradiance. J. Am. Chem. Soc. 134 (28), 11358-11361 (2012).
- Ladest, S., Fales, A. M., Domard, A.
- Matteini, P., et al. Photothermally activated hybrid films for quantitative confined release of chemical species. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 52, 5956-5960 (2013).
- Khor, E., Lim, L. Y.
- Kennedy, L. C., et al. T cells enhance gold nanoparticle delivery to tumors in vivo. Nanoscale Res. Lett. 6 (1), 283 (2011).
- Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. J. Nanopart. Res. 9 (6), 1109-1124 (2007).
- Jokerst, J. V., Thangaraj, M., Kempen, P. J., Sinclair, R., Gambhir, S. S. Photoacoustic imaging of mesenchymal stem cells in living mice via silica-coated gold nanorods. ACS Nano. 6 (7), 5920-5930 (2012).
- Ding, H., et al. Gold nanorods coated with multilayer polyelectrolyte as contrast agents for multimodal imaging. J. Phys. Chem. C. 111 (34), 12552-12557 (2007).
- Esposito, G., et al. et al. In vivo laser assisted microvascular repair and end-to-end anastomosis by means of indocyanine green-infused chitosan patches: A pilot study. Lasers Surg. Med. 45 (5), 318-325 (2013).
