Summary
이 프로토콜은 마우스 폐 조직 내에서 전이를 나타내는 특정 종양 세포의 mRNA를 검출하도록 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)을 사용하는 방법을 설명한다.
Abstract
전이성 질환 먼 기관에 차 암 사이트에서 악성 종양 세포의 확산된다 암 관련 사망의 1 차 원인이다. 전이성 확산의 일반적인 사이트는 폐, 림프절, 뇌, 뼈 (2)를 포함한다. 전이를 구동 메커니즘은 암 연구의 강렬한 영역입니다. 전이 먼 사이트는 암 연구를위한 수단이다에 따라서, 효과적인 분석은 전이성 부담을 측정합니다. 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가는 일반적으로 다음 해부 폐 조직의 육안 관찰에 의해 정성 행한다. 전이를 평가하는 정량적 방법은 현재 생체 외 및 사용자 정의 된 매개 변수를 필요로 생체 내 이미징 기반 기술에 제한됩니다. 이들 기술의 대부분은 오히려 세포 수준 3-6보다 전체 유기체 수준이다. 다 광자 현미경을 이용하여 새로운 이미징 방법 METAS을 평가할 수 있지만세포 수준에서 7 TASIS이 매우 우아한 절차는 보급의 메커니즘보다는 전이성 부담의 정량적 평가를 평가에 더 적합하다. 여기에 정량적으로 전이를 평가하는 간단한 체외 방법이 제공된다. 정량 실시간 PCR을 사용하는 것은 (QRT-PCR), 특정 종양 세포의 mRNA는, 마우스 폐 조직 내에서 검출 될 수있다.
Introduction
QRT-PCR 분석은 종양 전이를 평가하는 방법으로서 제안되어있다. 이 방법은 전이를 평가 관련되지만, 생체 내 이미징 장치 또는 형광 할 입체경 특정 장비에 액세스 할 수없는 사용자를위한 대안으로 제시된다. 일반적으로 사용되는 방법의 논의는 QRT-PCR 분석은 별개로 또는 전이를 평가하는 방법에 동반하여 사용할 수있는 방법에 대한 데모 뒤에 제공된다. 이 절차는 전이성 부담의 정량 분석을 제공하는 잠재력을 가지고있다.
실체 현미경하에 폐의 시각화뿐만 아니라 헤 마톡 실린 및 에오신 다음 직렬 절편을 포함하여 총 분석의 표준 방법은 폐 조직의 (H & E) 염색, 정량화하지만 2-5 계산을위한 사용자 정의 된 매개 변수에 크게 의존하고있다. 실체 현미경을 사용하여 전체 폐를 평가할 때, 단지 큰 표면 전이는 VISI은BLE 및 분석은 전이성 병변을 구성하는 것을 결정하기 위해 폐 해부학 적 구조의 합리적인 지식을 가지고 조사를 필요로한다. 이러한 GFP 적절한 여기 / 방출 최대 (GFP 예 : 근처 510분의 470 ㎚)와 빛 큐브를 포함하는 입체 현미경의 사용과 같은 마커로 종양 세포의 형광 라벨은이 과정에서 지원,하지만 표면의 종양 결절은 탐지 가능 . 또한, GFP와 같은 매개 변수 아래에 표시되는 혈액의 오염에서 형광이 가능 전이성 병변의 거짓 식별 될 수 있습니다.
폐 전이를 시각화하기 위해 H & E 염색 한 다음 폐의 단면은 미세 전이와 면역 세포의 침윤을 포함한 다른 마이크로 프로세스를 평가하는 유용한 방법이지만 종종 파라핀 삽입, 절편 및 염색 절차는 전체 폐 조직의 사용을 필요로한다. 따라서, 다운 스트림 절차는이 운전 방식 다음과 같은 이상 없습니다디. 정량화하지만,이 과정은 분석이 폐의 전체 3 차원 구조를 차지하도록 동물 당 염색 폐 구간의 다수를 평가하는 조사원을 필요로한다. 결과적으로, 시험이 유형의 에러를 카운트로 이어질 수 있고, 시간 소모적이며, 분석은 연구자의 판단에 크게 의존한다.
(MRI는 PET, SPECT는 예) 현재 수행하거나 실험 쥐 모델 8 생물학적 과정을 테스트하는 데 사용되는 생체 내 이미징 기술의 몇 가지. 생체 내 생물 발광 영상은 전이 (9)의 총보기를 취득하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 기술은 일반적으로 인해 종양 세포 주입 후 유선 및 자발적 전이시 폐 같은 특정의 장기에 상주하는 루시퍼 라제 반응 요소를 포함하도록 설계되는 종양 세포의 축적에 루시페라아제 리포터 활성의 존재를 평가하기 위해인가 1루시페라아제 리포터 활성의 0. 시각화는 루시페린 기판 (D-루시페린)의 존재에 의해 유도된다. 루시 페라 제는 생물 발광을 생성 oxyluciferin하는 D-루시페린의 산화 적 탈을 촉매. 정보 있지만,이 방법은 기판의 안정성 (즉, 짧은 반감기)이 실험 동물에 전달되는 방법에 따라 달라집니다 기판의 적절한 분배, 및 탐지 (9)의 낮은 감도 등 여러 가지 요인에 의해 제한됩니다. 이 기술에 주요 장점은, 비 침습적 인 살아있는 동물에서 수행 될 수 있고, 일반적으로 절개 9,10- 수확되지 않았을 수있는 다수의 기관에서 종양 세포의 전이의 검출을 초래할 수 있다는 것이다.
생체 영상 기술의 일 측면은 양성 폐 조직 파라핀 등에 매립 이차 절차 허용 흐트러 그대로 또는 여기 제시 QRT-PCR 분석한다는 것이다. 그러나, QRT-PCR은 theoretica이기 때문이다에서야 검출 더 민감한 법안은 총 평가는 폐에 존재하는 종양 세포의 낮은 숫자를 공개하지 않을 수 있습니다. 유용한 반면, 상기 이미징 기술은 치환 될 수 있거나, 현재 설명 QRT-PCR 방법으로 보충. QRT-PCR은 폐에서 종양 유래의 mRNA의 민감한 측정을 제공하는 잠재력을 가지고있다.
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Protocol
이 프로토콜은 가이드 라인과 사우스 캐롤라이나 (MUSC)과 기관 동물 관리 및 사용위원회의 의과 대학 (IACUC)의 동물 보호 기준을 따른다.
1. 폐 해부
- 유방 종양 절제술 (선택 연구 목표 및 기본 종양 분석 또는 꼬리 정맥 주입이 수행 여부에 따라).
- IACUC 대학 규정에 따라 이소 플루 란 마취의 치사량을 사용하여 마우스를 안락사. 수술 전위에 의해 euthanization을 확인합니다.
- 폼 보드, 사지 확산의 뒷면에 마우스를 배치하여 해부 핀과 핀.
- 70 % 에탄올로 마우스 스프레이.
- 집게를 사용하여, 중심에서 동물의 하부를 파악.
- 가위를 사용하여, 마우스의 복강을 관통하지 않도록주의, 피부를 통해 목으로 상승 했네요.
- 종양 조직을 나타 내기 위해 사지에 피부를 다시 잘라.
- 종양 조직과 홍보를 해부하다추가 분석을 위해 (안이 프로토콜에 자세히 설명) 등의 동결 또는 고정으로, 선호하는 방법으로 eserve.
- 폐 조직의 해부.
- 전술 한 바와 같이, 종양 조직을 수확하는 경우, 과잉의 피부 아래에 핀.
- 집게를 사용하여, 동물의 하단부를 잡고 복막 목의 기부를 향해 위쪽으로 절단 시작한다.
- 조심스럽게 흉강에 출혈 수있는 혈관을 절단되지 않도록주의하면서 흉곽의 왼쪽과 오른쪽 측면을 따라 잘라. 왼쪽과 오른쪽 흉곽의 횡격막과 상부를 절단하여 리브 뼈를 제거합니다.
- 집게를 사용하여 마우스의기도를 잡고 앞으로 잡아 당깁니다.
- 해부 가위로 기관을 절단 및 마우스에서 폐를 제거합니다.
참고 : 핵심은 폐에 부착 남아있을 수 있습니다. 이 경우, 신중하게 다섯 로브를 수집주의하면서 폐에서 멀리 마음을 해부하다 (그림 1 참조 - 여분의 혈액을 제거하는 PBS로 부드럽게 씻는다.
- 폐 조직의 총 평가.
- 옵션 1 : 생체 내 이미징.
- 루시 페라 이미징 ~ 10 분 전에 이미지로, 동물에게 복강 내 (IP) 주사 루시페린의 150 ㎎ / ㎏ 용량을 제공합니다. 마취 된 동물 또는 절개 (그림 2) 5 후 제거시 생체 내에서 이미지 폐.
- 옵션 2 : 총 평가.
- 종양 결절을 시각화 스테레오 현미경으로 폐를 검사합니다. 주 : 세포 표지 GFP 경우 GFP를 검출 (510분의 470 nm의 근처 예) 적절한 여기 / 발광 최대치와 광 큐브를 함유 형광 가능한 실체 처리에 앞서 형광 대해 입체적 폐를 조사하는데 사용될 수있다.
- 폐 즉시 분석 할 경우, 'RNA 분리'부분을 진행합니다. 그렇지 않으면, 액체 비누를 사용하여 동결 조직 스냅ID 질소 나 드라이 아이스. -80 ° C에서 보관하십시오.
- 옵션 1 : 생체 내 이미징.
2. RNA 분리
참고 : 대표 분석을 위해, RNA는 RNA 분리 키트 (자료 목록을 참조)를 사용하여 분리 하였다. 현재의 분석은 하나의 특정 제조 업체의 제품을 사용하는 동안, 분리 키트의 다양한 여러 유명 업체에서 사용할 수 있습니다. 또한, 비 기반 키트 원심 분리 방법이 또한 옵션이다. cDNA를 또한 표준 곡선 분석을위한 세포주 또는 플라스미드로, 양성 대조군 샘플로부터 RNA를 제조한다. 또한, 프라이머 프로브 세트에 대한 특정 양의 제어가 구입하실 수 있습니다 (자료 목록 참조).
- 이전에 냉동 조직을 사용하는 경우, 드라이 아이스에 냉동 조직을 수집합니다.
- 같은 다음 방법 중 하나를 사용하여 조직을 균질화 : 박격포와 유 봉 액체 질소에 조직을 동결 한 후 드라이 아이스를 통해 손에 의해 수행 연삭; 조직 균질 또는 기계적 분리 장치제조업체의 제안에 따라; 초음파, 또는 다른 선호하는 방법.
참고 : 대표 분석을 위해, 균질화 선호하는 방법은 초음파이다.- 도 3에 제시된 분석의 비율로 용해 (RNA 분리 키트로 제공) 버퍼 및 2- 메르 캅토 에탄올을 제조 20 ㎕의 2- 머 캅토 에탄올 용해 버퍼마다 1 ml의 용. 재현 탁 조직 300 ㎕의 용해 완충액 30 % 진폭으로 설정 초음파기 10 초 동안 초음파 처리하고 조직의 각 30g을 위해 2- 머 캅토 에탄올이 보충.
- 분쇄 한 후 300 μL 용해 버퍼에 재현 탁 지상 조직, 박격포와 유 봉을 사용하는 경우.
- 590 μL TE 버퍼 (1 mM의 EDTA 10 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0)에 10 μL의 단백질 분해 효소 K를 추가합니다. 조직의 (즉, 매 30 mg을 위해) 각 300 μL에 600 μL의 단백질 분해 효소 K 솔루션을 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 품어.
참고 : 소화 시간이 다를 수 있습니다. - ≥1 원심 분리기 샘플10 분 3,000 g의 이물질을 제거합니다.
- 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
- RNA를 침전 상층 액의 모든 900 μL, 450 μL 에탄올 (96 % -100 %)를 추가합니다.
- 컬럼에 해물 / 에탄올 혼합 700 μl를 전송합니다.
- 1 분 ≥13,000 G에서 원심 분리기 샘플은 열에 RNA를 결합합니다.
- 액체 폐기물을 버리고 컬럼에 남아있는 상층 액을 추가하고 다시 스핀.
- 모든 해물이 칼럼을 통해 방사되면 30 초 동안 ≥13,000 g에서 원심 분리 컬럼 샘플의 상부에 세척 완충제 (1)의 350 μL를 추가한다.
- 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다.
- 내가 10 배의 DNase의 5 μL 및 샘플 당 DNase를 /의 RNase없는 물 40 μL (50 μL / 샘플의 총 부피)와 효소의 DNase의 5 단위를 혼합하여 DNase의를 준비합니다.
- DNase의 50 μL 각 열을 혼합하고 실온에서 15 분 동안 품어 추가합니다.
- 열 및 원심 분리기 샘 워시 버퍼 1의 350 μl를 추가PLES 30 초 동안 ≥13,000 G에서.
- 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다.
- 컬럼에 워시 버퍼 2의 600 μl를 추가하고 ≥13,000 g에서 30 초 스핀.
- 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다.
- ≥13,000 g에서 2 분 동안 250 워시 버퍼 2 μL와 원심 분리기를 추가합니다.
- 새 컬렉션 튜브에 열의 일부를 넣고 오래 수집 튜브를 폐기합니다.
- 컬럼의 RNase / DNase를 무료로 물을 50 ~ 100 μl를 추가하고 1 분 동안 품어.
- ≥13,000 g에서 1 분간 스핀.
- 다시 실행 RNA 수율을 높이기 위해 칼럼을 통해 수집 된 용출액을.
- 즉시 사용, 얼음에 샘플을 유지하고 정량를 진행합니다. 나중에 사용하기 위해, 드라이 아이스, 액체 질소에 동결 스냅. -80 ° C의 냉동고에서 보관이 필요할 때까지.
3. 첫 번째 가닥 합성
주 : 대표적인 분석을 위해, 역전사 효소 (RT) 반응을 수행 하였다 F(자료 목록 참조) QRT-PCR을 위해 설계 IRST 가닥 cDNA 합성 키트.
- 샘플은 이전에 수집 된 경우, 얼음에 튜브를 해동.
- 분광 광도계를 사용하여 RNA의 양을 측정한다.
- 전체 RNA의 0.5 μg의 사용, cDNA의 주식을 생성하는 역전사 효소를 사용하여 첫 번째 가닥 합성을 수행합니다.
- 멸균 된 RNase / DNase의 프리 PCR 튜브 / 플레이트에서, 반응 혼합물 (표 1)을 제조 하였다. 부드럽게 원심 분리기 섞는다. 표준 PCR 기계 (표 2) 프로그램.
- 멸균 뉴 클레아없는 물을 사용하여 원하는 볼륨 (일반적으로 50 ~ 100 μL)에 완성 된 반응을 희석.
4. 실시간 PCR
주 : 대표적인 분석을 위해, SYBR 그린을 이용 하였다. 그러나, 임의의 바람직한 방법은 사용자의 결정에 치환 될 수있다.
- 양성 대조군의 cDNA를 사용하여 각 프라이머 세트에 대한 표준 곡선을 설정합니다.
- 분석 내가 보여 위해N 그림 3은, 양성 대조군의 cDNA를 추천 제조업체를 사용하여 인간의 HER2에 대한 표준 곡선을 준비 (자료 목록 참조). 마우스 GAPDH에 대해, 표준 곡선을 생성하는 음성 대조군 폐의 cDNA를 사용한다. 5 기준을 생성하는 4 : 각 프로브에 대해, 직렬의 cDNA 1 희석.
- 표준 곡선 및 실험 샘플을 포함해야 총 샘플들의 수를 계산한다.
참고 : 분석은 여기에 설명 된 내용은 샘플 당 2-3 실험 복제를 분석 하였다. 표준 곡선 분석은 최종 정규화 양을 계산하는 샘플 당 상대적 HER2의 양 및 GAPDH를 결정하도록 적용될 수있는 단순 회귀 분석 모델을 생성하기 위해 수행 하였다. 이 분석은 또한 프라이머 효율이 손의 분석에 적합한 지 확인합니다. - 멸균 된 RNase / DNase의 무료 관에서, 마스터 믹스 (표 3)를 준비합니다.
- 마스터 믹스 amoun을 계산샘플 당 T. 하나 이상의 샘플까지 확장 할 수 있습니다. 관심있는 각각의 실험 유전자뿐만 아니라, GAPDH 등의 내부 제어를 위해 마스터 믹스를 사용한다. 200 nm의 최종 농도 GAPDH에 대한 프라이머를 사용합니다.
참고 : 인간 및 마우스 세포의 기원을 구별 할 때 내부 통제에 특히 유용하다.
주 : HER2 프라이머 농도는 최적화 제조업체에 의해 결정 하였다.
- 마스터 믹스 amoun을 계산샘플 당 T. 하나 이상의 샘플까지 확장 할 수 있습니다. 관심있는 각각의 실험 유전자뿐만 아니라, GAPDH 등의 내부 제어를 위해 마스터 믹스를 사용한다. 200 nm의 최종 농도 GAPDH에 대한 프라이머를 사용합니다.
- 각 표준 또는 실험 샘플에 해당하는 1 μL의 cDNA를을 포함하는 테스트 판을 준비합니다. 각각의 프라이머 프로브 잘 적어도 1의 cDNA 샘플 /을 할당합니다. 각각의 프라이머 프로브 잘 당 마스터 믹스 19 μl를 추가합니다.
참고 :도 3의 대표 데이터를 들어, cDNA를 시료는 각 프라이머 프로브 이중으로 분석하고, 두 개의 샘플의 평균으로 그래프. - QRT-PCR 시스템에서 실행 반응은 권장 또는 이전 PCR 프로토콜을 테스트하여. 표 4 참조 도 3 및도 4에 대표 데이터에 사용되는 PCR 프로토콜 trong>.
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Representative Results
시간을 초과가 실험 동물 내로하면 종양 세포의 초기 접종을 수행하는 데 걸리는 행하는, 생체 내 종양 분석, 조직 수확 RNA 분리 및 QRT-PCR 분석에 기본이 1-2 일 과정이다 (도 1) .
총 분석의 예는 폐 조직 내에서 종양 세포를 평가하기위한 생물 발광 이미징이다. 여기서, 유방 종양 실험은 ACT1라는 갭 정션 connexin43에 단백질을 대상으로 임상 에이전트, 폐에 루크 4T1 유방 종양 세포의 자발적인 전이를 저해 할 여부를 평가하기 위해 수행 하였다. 치료, 위약 또는 테스트 에이전트를받은 동물의 몇 주 후 루시페린 주입과 희생되었다. 해부시, 폐 루시 페라 생물 발광에 대한 가시화되었다. 대표 이미지는 약물로부터의 폐를 나타납니다처리 된 동물은 종양 세포가 ACT1 치료 (그림 2A) 후 전이의 억제를 제안, 폐에 존재하지 않는 것을 나타냅니다 루시 페라 제 활동에 대한 부정적이다. 이들 대표 화상의 주요 목적은 생물 발광 이미징 전이의 검출을위한 적절한 방법이 있음을 입증하는 것이다. 그러나, ACT1로 처리 된 동물에서 폐의 H & E 부분의 상세한 조사에, 미세 전이는 아마도 영상이 유형의 종양의 낮은 숫자를 감지 할만큼 민감하지 않을 수 있음을 시사 루시퍼 라제 영상 (그림 2B)에 의해 조명되지 않았 음을 확인 하였다 세포가 폐 내에 내장. 이상적으로, QRT-PCR을위한 동반자 분석은 이러한 결과를 확인하기 위해 수행된다.
여기서 제시 QRT-PCR 분석은 HER2 + JIMT-1 세포로부터 인간 폐 종양 세포를 검출하기위한 인간 HER2 특정 프로브를 사용하는원래 호스트 동물의 유방 지방 패드 (그림 3)에 이식했다. 전이는 종양 발생 후 자발적으로 발생했습니다. 절개 후, 실체 현미경을 보았을 때, 더 크게 보이는 전이는 폐에 어떠한 관찰되지 않았다. 그러나, 후속 QRT-PCR 분석에 기초하여 그것을 가시화하여 미 검출되었음을 종양 세포를 제안도 3에서 화살표로 표시된 전이 숨겨 종양 베어링 동물에서 수확 열한 폐, 두 가지가 존재하는 것으로 보인다. JIMT-1 유래의 종양 편으로부터 유도 된 cDNA를 대조군으로서 사용 하였다 종양 세포를 주입하지 않은 HER2의 발현 (도 3, (+)) 및 마우스로부터 폐에 대한 양성 대조군으로 사용되었다 (도 (3), (-)). 마우스 GAPDH에 대한 특이 적 프로브가 전체 마우스 폐 조직, 인간 종양 세포의 비율을 결정하기 위해 내부 대조군으로 사용 하였다. 양성 대조군샘플은 기준으로서 제어 폐에서 GAPDH 수준으로 정규화 하였다. 대안적인 정규화 전략은 대조 시료에 대한 일관성 정규화 레벨을 취득하는 모든 샘플에 걸쳐 폐 GAPDH의 양을 평균화하는 것이다. GFP와 같은 비 - 마우스 및 비 - 인간 유전자 대체 프로브 전에 마우스에 도입, 따라서 표지 된 종양 세포를 검출하도록 치환 될 수있다.
이차 분석은 총 폐 종양 세포 수의 존재 상대적인 정량을 제공하도록 하였다. 이러한 결과는도 4에 도시되어있다. 여기에서, 표준 곡선 분석은 세포 수 시리즈 마우스 폐 GAPDH로 정상화 상대 HER2 량을 결정하기를 제조 하였다. 이론적으로,이 연구는, 1 × 1 × 6 5 4 1 ×, 1 ×을 HER2의 상대적 양을 결정하도록
삽입 확대 도면에 의해 지시 된 바와 같이 그림 폐 해부 및 분석의 도식 표현입니다. 마우스 폐, 5 로브가 포함되어 있습니다. 해부에서 분석 QRT-PCR 절차는 일반적으로 완료 1-2 일이 소요됩니다.ge.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
전이 2. 총 분석을 그림. (A) 4T1-루크 세포를 주입하고 위약 또는 간극 결합 단백질, connexin43에를 대상으로 임상 약물이라고 ACT1 중 하나를 처리 한 동물에서 폐의 대표 생물 발광 이미지. (B).의 미세 전이의 대표 H & E 섹션 ACT1로 처리 4T1 종양 동물의 폐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 대표 QRT-PCR 분석. 막대 그래프인간 HER2, JIMT-1 인간 유방암 세포주에서 유전자의 존재 QRT-PCR 분석에서 정량화하고 수치화 한 데이터를 나타내는. 폐 인간 HER2 수준 마우스 GAPDH에 정규화된다. (+) 양성 대조군을 나타낸다. (-) 음성 대조군을 나타낸다. 결과는 로그 스케일에 그려진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
세포 수를 분석으로부터도 4 주제 QRT-PCR 분석. (A) 1 × 6 ~ 10의 세포로부터 JIMT-1 세포의 세포 수 량 관련 HER2 수준을 나타내는 그래프.에서 정량화하고 수치화 한 데이터를 나타내는 (B) 막대 그래프 인간의 HER2의 QRT-PCR 분석, JIMT-1 인간의 유방의 유전자 표시 할 수 있습니다CER 세포주. 폐 인간 HER2 수준 마우스 GAPDH에 정규화된다. (+) 양성 대조군을 나타낸다. (-) 음성 대조군을 나타낸다. 결과는 로그 스케일에 그려진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 템플릿 RNA | 0.5 μg의 |
| iScript 수퍼 믹스 | 4 μL / 샘플 |
| 클레아없는 물 | 20 μL / 샘플까지 |
표 1. 먼저 스트랜드 합성 반응 혼합물의 구성 요소 (단계 3.3.1).
| 1 단계 : 25 ° C | 5 분 |
| 2 단계 : 42 ° C | 30 분 |
| 3 단계 : 85 ° C (종료) | 5 분 |
첫 번째 가닥 합성 (단계 3.3.3) 표 2. PCR 조건.
| iTAQ 마스터 믹스 | 10 μL / 샘플 |
| 프라이머 믹스 | 1 μL / 샘플 |
| 20 μL / 샘플까지 |
표 3. 실시간 PCR 반응 혼합물 성분 (단계 4.3).
| 1 단계 | 활성화 | 95 ° C | 2 분 | 1주기 |
| 2 단계 | 변성 | 95 ° C | 5 초 | 40주기 |
| 소둔 / 확장 | 60 ° C | 30 초 | ||
| 3 단계 | 곡선을 용융 (선택 사항) | 65-95 °의 C (0.5 씩 증가) | 5 초 / 단계 </ TD> |
표 4. 실시간 PCR 조건 (4.5 단계).
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Discussion
이 프로토콜은 이종 이식 된 마우스 모델을 이용하여 폐에 유방 종양 세포 전이를 평가 QRT-PCR의 용도를 설명한다. 그것은 생물 발광 영상을 포함한 다른 기술, 사용할 수 있으며, 또한 자신의 가치와 한계에도 불구하고 전이를 검출하는 효과가 있음을 인정한다. 제시된 데이터는 QRT-PCR 총 전이 정량 폐 조직 내 종양 유래의 mRNA를 검출하는 효과적인 조치를 제공하는 것이 제안한다. 그것은 QRT-PCR 분석을 보완 또는 이들 이미징 기법 대신에 수행 될 보조 방법을 제공하는 것이 제안된다. 이 기술은 최고의 장비 또는 전이성 부담의 특정 관심사를 가진 연구 그룹에 대한 특정 유형의 제한 액세스 할 수있는 연구 환경에 적합하지만, 역학적 연구를 자세히 설명하지 될 수 있습니다.
유익한 있지만, 여기에 설명 된 QRT-PCR 분석은 한계가있다. 이는 하류의 추가 수행하는 것이 가능하지 않다면역 조직 화학 (IHC) 또는 폐 조직의 전체 RNA를 분리를 위해 사용되기 때문에 면역 형광 (IF)를 포함하여 염색 분석. 생체 내 이미징 기술과 짝 경우, 폐 조직은 분석이 보조 형을 수행하는 포스트 영상을 분리 할 수있다. 다중 분리 프렙 키트 폐 조직을 제조하는 데 사용되는 경우가 아니면,이 기술에 따라서 단백질의 mRNA를 분석 및 검출에 한정되어 불가능하다. 생성 된 단백질의 분석은 여전히 IHC / IF는에 기초하여 마우스 조직에서 발견의 염색에서 종양 조직에서 염색 된 단백질을 묘사하도록 사용자에게 허용하는 반면 모든 한 종양과 폐 조직을 포함하는 총 단백질 혼합물을 평가하는 데에 한정 IHC / IF 염색의 시각화. 전이는 폐의 일부에서 식별과 토륨의되지 않은 경우 유리할 수있다 같은 조직학과 같은 다른 분석을 위해 폐 조직의 절반을 유지하지만 결과 충돌 할 위험이, 전체 폐를 사용하는 대안전자는 다른.
수정 및 문제 해결의 여러 지점을 권장합니다. QRT-PCR 데이터의 정확성 사체 정량 적절한 표준 곡선 분석의 사용을 포함한 권장 분석 및 프로브의 최적화를 위해 선택되는 프라이머 프로브에 의존한다. 또한, 격리 된 RNA의 품질을 측정하는 것이 중요하다. 오버 소화 테와 조직의 K는 RNA의 질을 감소시킬 수있어 최적화 RNA 제제의 관심 및 방법의 특정 조직에 기초하여 추천합니다. 적절한 가사 참조 유전자를 선택하는 것이 중요하다. GAPDH는 일반적으로 사용되는 기준 유전자이지만, 각 유전자에 의한 실험 조건에 변경 될 수있는 세포의 정상적인 기능과 이와 다른 선택이 유용하다 (호스트 이러한 유전자 녹아웃 같은 동물 즉 유전 적 변형을 추가) 역할을한다. 보고 일반적인 기준 유전자는 유비쿼터스 표현을 가지고이온과 수량에 낮은 변화는 단백질 (TBP)를 결합 TATA 박스, 망막염 색소 (2)를 코딩하는 유전자이다 (RP2), 액틴과 같은 단백질 (법)과 둔한 양자 전사 인자 (욕조) 11. 또한, 정확한 분석을 보장 중요한 단계는 폐 (단계 1.2.2-1.2.6)의 정확한 해부 및 세탁을 포함 QRT-PCR 설정 (단계 4.4) 동안 격리 된 총 RNA의 정확한 정량 (3.2 단계), 정확한 피펫 팅. 반복 피펫의 사용은이 프로세스에 도움을 줄 수있다.
요약하면,이 프로토콜은 QRT-PCR은 폐 전이를 식별하는 정량 방법이 있음을 입증하는 것이다. 양 값은 모두 제한이 절차를 이용하여 식별하고 최고의 분석의 2 방법에 대응되도록 적합 할 수도있다. 그러나,이 방법은 그 연구를위한 실험 실용 정량 직진 절차 수특정 연구의 요구 또는 광범위한 장비의 부족과 IES는 전이를 조사합니다. . 이 방법의 미래 응용 프로그램은 전이의 다른 일반적인 사이트입니다 같은 림프절 또는 뇌와 폐 이상으로 표적 장기에 전이, 찾기 위해 수정을 포함한다.
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Disclosures
ESY 및 MAA는 FirstString 리서치에 고용되지 않고 회사의 금융이자를 보유하지 않습니다. FirstString 리서치는이 논문에서 제시 한 루시 페라 영상 데이터를 제공했다. GSG는 FirstString 연구의 사장 겸 CEO이다. CLG는 FirstString 연구의 직원입니다. GSG와 CLG는 FirstString 연구가 발행 한 스톡 옵션이 있습니다.
Acknowledgments
예치 연구소는 미국 암 학회 기관 연구 그랜트 (IRG-97-219-14) 국방부의 교부로부터 연구 자금으로, MUSC에서 홀 링스 암 센터 수여 (W81XWH-11-2-에서 연구 자금 지원됩니다 0229) MUSC에서, 그리고 우려 (ESY에) 재단의 수상으로.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| DNAse | Thermo Scientific | EN0521 | |
| GeneJet RNA Isolation Kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25636 | |
| PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25716 | |
| gapdh Primer Sequence | For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG |
References
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