Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בזמן אמת PCR (qRT-PCR) כדי לזהות mRNA הספציפי תאים סרטניים המייצג גרורות בתוך רקמת הריאה עכבר.
Abstract
מחלה גרורתית היא ההתפשטות של תאי גידול ממאירים מאתר הסרטן הראשוני לאיבר מרוחק, והוא הגורם העיקרי למוות הקשורים לסרטן 1. אתרים נפוצים של התפשטות גרורה כוללים ריאות, בלוטות לימפה, מוח, ועצם 2. מנגנונים המניעים את גרורות אזורים אינטנסיביים של חקר הסרטן. כתוצאה מכך, מבחני יעילים למדידת נטל גרורתי באתרים מרוחקים של גרורות הם אינסטרומנטלי לחקר הסרטן. הערכה של גרורות ריאה במודלים של גידול החלב מבוצעת בדרך כלל על ידי תצפית איכותית ברוטו של רקמת הריאה הבאה לנתיחה. שיטות כמותיות להערכת גרורות כיום מוגבלות לvivo לשעבר ובטכניקות הדמיה מבוססת vivo הדורשות פרמטרים הגדרת משתמש. רב של טכניקות אלה בכל רמת האורגניזם ולא הרמה התאית 3-6. למרות ששיטות הדמיה חדשות יותר ניצול מיקרוסקופיה רב-פוטון מסוגלות להעריך metastasis ברמה התאית 7, נהלים האלגנטיים ביותר שמתאימים יותר להערכת מנגנוני הפצה ולא הערכה כמותית של נטל גרורתי. הנה, שיטה במבחנה פשוטה להעריך כמותית גרורות מוצגת. שימוש בזמן אמת PCR (qRT-PCR), mRNA הספציפי תאים סרטניים יכול להתגלות בתוך רקמת הריאה עכבר.
Introduction
ניתוח qRT-PCR מוצע כשיטת להערכת גרורות סרטנית. שיטה זו מוצע כאלטרנטיבה עבור משתמשים שמעוניינים בהערכת גרורות אבל אין גישה לציוד ספציפי כגון ציוד ההדמיה in vivo או מסוגל stereoscope הקרינה. דיון בשיטות נפוצות הוא שהוצגו אחרי הפגנה לאיך ניתוח qRT-PCR יכול לשמש גם כנפרד או כשיטת לוויה להעריך גרורות. יש הליך זה הפוטנציאל לספק ניתוח כמותי של נטל גרורתי.
שיטות סטנדרטית של ניתוח ברוטו, כוללים הדמיה של ריאות תחת סטראו, כמו גם חתך סידורי אחרי hematoxylin ו eosin מכתים (H & E) של רקמת ריאה, הן לכימות, אך מסתמכות במידה רבה על פרמטרים הגדרת משתמש לספירת 2-5. בעת ההערכה כל ריאות באמצעות סטראו, גרורות משטח רק גדולות הם Visible וניתוח דורש חוקר להיות בעל ידע סביר של מבנה האנטומי ריאות כדי לקבוע מה מהווה נגע גרורתי. תיוג ניאון של תאים סרטניים עם סמן כגון GFP ושימוש בסטראו המכיל קוביית אור עם מקסימום עירור / הפליטה המתאימה (למשל ליד 470/510 ננומטר לGFP) מסייע בתהליך זה, אבל הגושים סרטניים משטח רק לזיהוי . בנוסף, הקרינה מזיהום דם, שהוא נראה באותם פרמטרים כמו GFP, עלולה להוביל לזיהוי שגוי של נגעים גרורתי אפשריים.
חתך של הריאה ואחרי צביעת H & E לדמיין גרורות ריאות הוא שיטה שימושית להעריך micrometastases ותהליכים מיקרוסקופיים אחרים, כולל חדירת תאי מערכת חיסון, אך לעתים קרובות דורש שימוש בכל רקמת הריאה להטבעת פרפין, חתך, ונהלים מכתים. לכן, נהלים במורד הזרם אינם אידיאליים הבאים metho זהד. למרות כימות, הליך זה דורש החוקר להעריך במספר רב של סעיפי ריאות מוכתמים לכל בעלי חיים על מנת להבטיח שהניתוח מהווה את כל מבנה 3D של הריאות. כתוצאה מכך, זה סוג של בדיקה הוא לצרוך זמן, יכול להוביל לספירת שגיאה, ומסתמך במידה רבה על ניתוח שיקול דעת חוקר.
כמה בטכניקות ההדמיה vivo (למשל MRI, PET, SPECT) משמש כיום לבצע או לבדוק תהליכים ביולוגיים במודלים של מכרסמים ניסיוניים 8. בvivo ההדמיה bioluminescent היא שיטה נפוצה המשמשת לרכישת נוף ברוטו של גרורות 9. טכניקה זו מיושמת בדרך כלל על מנת להעריך את הנוכחות של פעילות העיתונאית לוציפראז בשל ההצטברות של תאים סרטניים, שמתוכננים להכיל אלמנט תגובת לוציפראז, שמתגוררים באיברים מסוימים כמו בלוטת החלב לאחר השתלת תאים סרטניים והריאות על גרורות ספונטניות 10. יזואליזציה של פעילות העיתונאית לוציפראז מושרה על ידי הנוכחות של מצע luciferin (D-luciferin). בלוציפראז מזרז decarboxylation חמצוני של D-luciferin לoxyluciferin יצירת פליטת אור. בעוד אינפורמטיבי, שיטה זו מוגבלת על ידי מספר גורמים, כולל יציבות מצע (כלומר מחצית חיים קצרים), הפצה הולמת של מצע שתלוי איך הוא מועבר לחיות ניסוי, ורגישות נמוכה של גילוי 9. הכשרון עיקרי לטכניקה זו הוא שהיא אינה פולשני, יכולה להתבצע על בעלי חיים, ויכולה להוביל לזיהוי של גרורות תאים סרטניים באיברים רבים שאולי לא נקצר בדרך כלל בנתיחת 9,10.
היבט חיובי אחד בvivo טכניקות הדמיה הוא שרקמת הריאה היא באין מפריע ומאפשרת לנהלים משניים כמו הטבעת פרפין או כפי שהוצג כאן, ניתוח qRT-PCR. עם זאת, בגלל qRT-PCR הוא theoretically מדד רגיש יותר של זיהוי, הערכה גולמית עשוי שלא לחשוף את המספרים נמוכים של תאי גידול הנוכחיים בריאות. אמנם שימושי, ניתן להחליף את טכניקות ההדמיה שתוארו לעיל או בתוספת שיטת qRT-PCR תיארה כרגע. יש qRT-PCR הפוטנציאל לספק מידה רגישה של mRNA הנגזר גידול בתוך ריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול כדלקמן הנחיות ותקני טיפול בבעלי החיים של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה (MUSC) והטיפול בבעלי חיים המוסדי שלה וועדת שימוש (IACUC).
1. ריאות Dissection
- נתיחת גידול החלב (אופציונאלי בהתאם למטרות מחקר והאם הזרקת ניתוח גידול ראשוני או וריד זנב בוצעה).
- להרדים עכבר באמצעות מנה קטלנית של ההרדמה isoflurane לפי IACUC ורגולצית אוניברסיטה. לאשר מתת חסד, על ידי נקע בניתוח.
- על לוח הקצף, סיכה עם סיכות לנתיחה על ידי הצבת עכבר על גבה עם גפיים התפשטות.
- ריסוס עכבר עם 70% אתנול.
- בעזרת מלקחיים, לתפוס את החלק התחתון של בעלי החיים במרכז.
- שימוש במספריים, לחתוך כלפי מעלה לכיוון הצוואר דרך העור, נזהר שלא לנקב את חלל הצפק של העכבר.
- לקצץ עור באיברים לחשוף רקמת גידול.
- לנתח את רקמת גידול ויחסי ציבורeserve ידי שיטה מועדפת, כגון הקפאה או קיבעון, לניתוח נוסף (לא נידון בהרחבה בפרוטוקול זה).
- נתיחת רקמת ריאה.
- אם רקמת גידול הייתה לקצור כפי שתוארה לעיל, להצמיד כל עור עודף.
- בעזרת מלקחיים, לתפוס הצפק בקצה תחתון של בעלי החיים ולהתחיל לחתוך כלפי מעלה לכיוון בסיס הצוואר.
- בזהירות לחתוך לאורך הצדדים שמאל וימין של להיות זהיר, כדי למנוע ניתוק כל כלי דם שעלול לדמם לתוך חלל בית חזה כלוב הצלעות. הסר את עצמות צלעות על ידי חיתוך שמאלה וימינה דרך מנות סרעפת והעליונה של כלוב הצלעות.
- בעזרת מלקחיים לתפוס את קנה הנשימה של העכבר ולמשוך קדימה.
- לנתק את קנה הנשימה עם מספריים לנתיחה ולהסיר ריאות מעכבר.
הערה: הלב עשוי להישאר מחובר לריאות. במקרה זה, לנתח בזהירות לב מריאות להיות זהיר, כדי לאסוף את כל חמש האונות (ראה איור 1 - לשטוף בעדינות עם PBS להסיר דם עודף.
- הערכה גסה של רקמת ריאה.
- אפשרות 1: in vivo הדמיה.
- הדמיה לוציפראז, ~ 10 דקות לפני הדמיה, נותן חיות 150 מ"ג / קילוגרם מינון של luciferin ידי הזרקת intraperitoneal (IP). ריאות תמונת in vivo בבעלי חיים בהרדמה או על ההסרה לאחר הנתיחה (איור 2) 5.
- אפשרות 2: הערכה גולמית.
- בדוק ריאות תחת מיקרוסקופ סטריאו לדמיין גושים סרטניים. הערה: אם התאים GFP שכותרתו, מסוגל סטראו הקרינה המכיל קוביית אור עם מקסימום עירור / פליטה המתאימה (למשל ליד 470/510 ננומטר) כדי לזהות GFP ניתן להשתמש כדי לבחון ריאות stereoscopically לקרינה לפני העיבוד.
- אם ריאות הן להיות מנותחות באופן מיידי, המשך לסעיף "בידוד RNA". אחרת, הצמד רקמות הקפאה באמצעות liquחנקן id או קרח יבש. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
- אפשרות 1: in vivo הדמיה.
בידוד 2. RNA
הערה: ניתוח הנציג, RNA היה מבודד באמצעות ערכת בידוד RNA (ראה חומרי רשימה). בעוד הניתוח הנוכחי משתמש המוצר של יצרן אחד ספציפי, מגוון רחב של ערכות בידוד זמין ממספר ספקים מכובדים. בנוסף, שיטות צנטריפוגה שאינה מבוססות ערכה הן גם אופציה. צריך גם להיות מוכן cDNA ממדגם RNA השליטה חיובי, כגון קו סלולארי או פלסמיד, לניתוח עקום סטנדרטי. לחלופין, שליטה חיובית ספציפית לסט הבדיקה תחל ניתן לרכוש (ראה חומרי רשימה).
- אם באמצעות רקמה קפוא בעבר, לאסוף רקמה קפוא בקרח יבש.
- Homogenize רקמות באמצעות אחת מהשיטות כגון הבאות: מכתש ועלי טחינה שבוצעה על ידי יד על קרח יבש לאחר הקפאת רקמה בחנקן נוזלי; homogenizer רקמות או התקן ניתוק מכאנילהצעתו של היצרן; sonication, או שיטה מועדפת אחרת.
הערה: ניתוח הנציג, השיטה המועדפת להומוגניזציה היא sonication.- לניתוח שהוצג באיור 3, להכין מאגר תמוגה (בתנאי בערכת בידוד RNA) ו- 2-mercaptoethanol ביחס של 20 μl 2-mercaptoethanol לכל 1 מיליליטר של חיץ תמוגה. רקמה גלולה ב300 חיץ תמוגה μl בתוספת 2-mercaptoethanol לכל 30 גרם של רקמה וsonicate במשך 10 שניות עם sonicator נקבע על משרעת של 30%.
- אם משתמש במכתש ועלי, רקמת קרקע גלולה במאגר תמוגה 300 μl לאחר הטחינה.
- להוסיף K proteinase 10 μl לחיץ 590 μl TE (10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA). להוסיף פתרון K 600 proteinase μl לכל 300 μl (כלומר לכל 30 מ"ג) של רקמה. דגירה של 10 דקות ב RT.
הערה: זמן עיכול עשוי להשתנות. - צנטריפוגה דגימות ≥13,000 גרם במשך 10 דקות כדי להסיר שאריות.
- העברת supernatant לצינורות חדשים.
- להוסיף 450 אתנול μl (96% -100%) לכל 900 μl של supernatant כדי לזרז RNA.
- העבר את 700 μl של תערובת lysate / אתנול לעמודה.
- צנטריפוגה דגימות ≥13,000 גרם דקות 1 כדי לאגד RNA לטור.
- בטל פסולת נוזלית ולהוסיף supernatant נותר לעמודה ספין שוב.
- ברגע שכל lysate הוא הסתובב בטור, להוסיף 350 μl של הצפת לשטוף 1 לחלק העליון של דגימות עמודה ו צנטריפוגות ב≥13,000 גרם במשך 30 שניות.
- בטל נוזל מהטור ולהחליף עליון חלק.
- הכן DNase על ידי ערבוב 5 יחידות של DNase אני אנזים עם 5 μl של 10x DNase ו -40 μl של מים חופשיים DNase / RNase לדגימה (נפח כולל של 50 μl / מדגם).
- הוסף 50 μl של DNase לערבב לכל עמודה והדגירה במשך 15 דקות ב RT.
- להוסיף 350 μl של הצפת לשטוף 1 לעמודה ו צנטריפוגות סםPles ב≥13,000 גרם במשך 30 שניות.
- בטל נוזל מהטור ולהחליף עליון חלק.
- להוסיף 600 μl של הצפת לשטוף 2 לעמודת ספין 30 שניות ב≥13,000 ז.
- בטל נוזל מהטור ולהחליף עליון חלק.
- הוסף 250 μl של הצפת לשטוף 2 ו צנטריפוגות 2 דקות ב≥13,000 ז.
- שים חלק מעמודה לתוך צינור אוסף חדש וזורקים צינור איסוף ישן.
- להוסיף 50-100 μl של מים חופשיים RNase / DNase לעמודה ודגירת דקות 1.
- ספין 1 דקות ב≥13,000 ז.
- eluate שנאסף באמצעות עמודה כדי להגדיל את תשואת RNA להפעיל מחדש.
- לשימוש מיידי, לשמור על דגימות קרח ולהמשיך לכימות. לשימוש מאוחר יותר, הצמד הקפאת קרח יבש או חנקן נוזלי. חנות במקפיא -80 ° C עד צורך.
3. ראשית סטרנד סינתזה
הערה: ניתוח הנציג, טרנסקריפטאז התגובה (RT) בוצעה Fערכת סינתזת irst סטרנד cDNA המיועדת לqRT-PCR (ראה חומרי רשימה).
- אם דגימות נאספו בעבר, להפשיר צינורות על קרח.
- למדוד כמות RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
- באמצעות 0.5-2 מיקרוגרם של רנ"א הכל, לבצע סינתזת גדיל ראשונה באמצעות טרנסקריפטאז ליצור מניית cDNA.
- ב, צינורות RNase / PCR ללא DNase / צלחות סטרילי, להכין את תערובת התגובה (טבלת 1). מערבבים בעדינות וצנטריפוגה. לתכנת מכונה סטנדרטית PCR (טבלה 2).
- לדלל תגובה מוגמרת לנפח רצוי (בדרך כלל 50-100 μl) באמצעות nuclease ללא מים סטריליים.
4. בזמן אמת PCR
הערה: ניתוח הנציג, ירוק SYBR היה בשימוש. עם זאת, כל שיטה העדיפה ניתן להחליף בהתאם לשיקול דעתו של המשתמש.
- שימוש cDNA שליטה חיובי, להגדיר עקומה סטנדרטית עבור כל קבוצת פריימר.
- לניתוח הראה שn איור 3, להכין את העקומה סטנדרטית לHER2 האנושי באמצעות היצרן מומלץ cDNA בקרה החיובי (ראה חומרי רשימה). לGAPDH עכבר, להשתמש בcDNA ריאות שליטה השלילי כדי ליצור עקומה סטנדרטית. עבור כל בדיקה, סדרתי לדלל cDNA 1: 4 כדי לייצר 5 תקנים.
- לחשב את מספר הדגימות כוללת, אשר צריך לכלול את העקומה סטנדרטית ודגימות ניסוי.
הערה: הניתוח שתואר כאן, 2-3 חזרות ניסיוניות לדגימה נותחו. ניתוח עקום סטנדרטי בוצע כדי ליצור מודל רגרסיה ליניארית פשוט שניתן ליישם על מנת לקבוע את הסכום היחסי של HER2 וGAPDH לדגימה לחשב כמות מנורמלת סופית. ניתוח זה גם יבטיח כי יעילות פריימר היא נאותה לניתוח ביד. - בRNase / צינור סטרילי, ללא DNase, להכין תערובת אב (לוח 3).
- לחשב עמון תערובת אמןלא לדגימה. בהיקף של עד למדגם אחד או יותר. השתמש בתערובת אב כל גן ניסויי של עניין, כמו גם בקרה פנימית כגון GAPDH. השתמש בצבעי יסוד לGAPDH בריכוז סופי של 200 ננומטר.
הערה: הבקרה הפנימית היא שימושית במיוחד כאשר מנסים להבחין בין מקור תא האנושי ועכבר.
הערה: ריכוז פריימר לHER2 היה מותאם ונקבע על ידי היצרן.
- לחשב עמון תערובת אמןלא לדגימה. בהיקף של עד למדגם אחד או יותר. השתמש בתערובת אב כל גן ניסויי של עניין, כמו גם בקרה פנימית כגון GAPDH. השתמש בצבעי יסוד לGAPDH בריכוז סופי של 200 ננומטר.
- הכן צלחת בדיקה המכילה cDNAs μl 1 מתאים לכל דגימה סטנדרטית או ניסיונית. להקצות מדגם cDNA לפחות 1 / גם עבור כל בדיקה פריימר. להוסיף 19 μl של תערובת אמן בכל טוב עבור כל בדיקה פריימר.
הערה: נתוני הנציג באיור 3, דגימות cDNA נותחו בשני עותקים עבור כל בדיקה פריימר וגרף כממוצע של שתי דגימות. - תגובה לרוץ בqRT-PCR מכונה באמצעות מומלצת או נבדקה פרוטוקול PCR בעבר. ראה טבלת 4 באיור 3 ואיור 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מעבר לזמן שנדרש כדי לבצע את החיסון הראשוני של תאי גידול לבעלי החיים הניסיוניים ואם ביצוע, עיקרי בניתוח גידול vivo, קציר הרקמות, בידוד RNA, וניתוח qRT-PCR הוא הליך 1-2 יום (איור 1) .
דוגמא לניתוח ברוטו היא ההדמיה bioluminescent להעריך תאים סרטניים בתוך רקמת הריאה. כאן, ניסוי tumorigenesis החלב בוצע כדי להעריך אם סוכן מחקרי שמכוון את connexin43 חלבון צומת הפער, נקרא ACT1, יפגע בגרורות ספונטניות של תאים סרטניים החלב 4T1-לוק לריאות. לאחר מספר שבועות של טיפול, בעלי חיים שקיבלו פלצבו או סוכן הבדיקה הוזרקו luciferin והקריב. על הנתיחה, ריאות היו דמיינו לפליטת אור בלוציפראז. מתמונות הנציג נראה כי ריאות מהסמיםבעלי חיים שטופלו הם שליליים לפעילות לוציפראז אשר מציינת כי אין תאים סרטניים נמצאים בריאות, המצביעים על עיכוב של גרורות לאחר טיפול ACT1 (איור 2 א). המטרה העיקרית של תמונות נציג אלה היא להוכיח כי ההדמיה bioluminescent היא שיטה מתאימה לגילוי לגרורות. עם זאת, על חקירה מפורטת של סעיפי H & E של ריאות מבעלי החיים שטופלו בACT1, micrometastases זוהו שלא מואר על ידי ההדמיה לוציפראז (איור 2), אולי מצביע על כך שסוג זה של הדמיה לא יכול להיות רגיש מספיק כדי לזהות מספרים נמוכים של גידול תאים מוטבעים בתוך הריאות. באופן אידיאלי, ניתוח נלווה עבור qRT-PCR היה להתבצע כדי לאשר את הממצאים.
ניתוח qRT-PCR שהוצג כאן משתמש ספציפי בדיקה לHER2 האנושי כדי לזהות תאים סרטניים אנושיים בתאי הריאה מJIMT-1 HER2 + שהושתלו במקור לתוך כרית שומן החלב של בעלי חיים מארח (איור 3). גרורות התרחשו באופן ספונטני אחרי התפתחות גידולים. על הנתיחה, כאשר צפו תחת סטראו, ללא גרורות גלויות גס נצפו בכל של הריאות. עם זאת, על סמך ניתוח qRT-PCR שלאחר מכן נראה כי שתיים מהריאות עשר שנקטפו מבעלי החיים גידול נושאות טיפחו גרורות, כונה על ידי החצים באיור 3, טוענים כי תאים סרטניים שלא להתגלות על ידי הדמיה נמצאים. cDNA נגזר מחתיכת הגידול נבע-JIMT-1 שימש כביקורת חיובית לביטוי HER2 (איור 3, (+)) וריאות מעכבר שלא הוזרקה תאי גידול שימש כביקורת שלילית (איור 3, (-)). בדיקה ספציפית עכבר לGAPDH שימשה כבקרה פנימית כדי לקבוע את חלקם של תאים סרטניים אנושיים לסך רקמת ריאה עכבר. הביקורת החיוביתהמדגם היה מנורמל לרמות GAPDH מריאות השליטה כנקודת התייחסות. אסטרטגית נורמליזציה חלופית תהיה בממוצע הסכום של GAPDH מעבר לכל דוגמאות הריאות לרכוש רמות נורמליזציה עקביות יותר עבור דגימות שליטה. בדיקות חלופיות לגנים שאינם עכבר ולא אנושיים, כגון ה- GFP יכולות להיות תחליף לזיהוי תאים סרטניים שכבר מסומן בהתאם, לפני כניסתה לעכבר.
ניתוח המשני היה גם ביצע לספק quantitation יחסי של הווה מספר תאי גידול הכולל בריאות. תוצאות אלו מוצגות באיור 4. כאן, ניתוח עקום סטנדרטי היה מוכן לקבוע את הכמות היחסית HER2 המנורמל לGAPDH ריאות עכבר בסדרת מספר תא. בתאוריה, זה מאפשר לחוקר לקבוע את הסכום היחסי של HER2 ב1x10 6, 5 1x10, 1x10 4, 1x10
איור 1. ייצוג סכמטי של נתיחת ריאה וניתוח. ריאות העכבר מכילה 5 אונות, כפי שעולות מציור הבלעה מוגדלת. מנתיחה לניתוח ההליך qRT-PCR בדרך כלל לוקח 1-2 ימים כדי להשלים."Target =" _ ge.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ניתוח גולמי של גרורות. () תמונות bioluminescent נציג של ריאות מבעלי החיים שהוזרקו תאי 4T1-לוק וטופלו בפלצבו או ACT1 נקרא תרופה ניסיונית שמכוון את חלבון צומת פער, connexin43. (ב). סעיף נציג H & E של micrometastasis ב ריאות של בעלי חיים עם גידול 4T1 שטופל בACT1. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. נציגי ניתוח qRT-PCR איור. גרף ברהמייצג את הנתונים ונרשמת מניתוח qRT-PCR של HER2 האנושי, הווה גן בשורת תאי סרטן השד האנושי JIMT-1. רמות HER2 אדם בריאה הן מנורמלות לGAPDH עכבר. (+) מציין ביקורת חיובית. (-) מציין ביקורת שלילית. תוצאות נרשמות על יומן בקנה מידה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. ניתוח הנציג qRT-PCR מניתוח מספר התא. () תרשים המייצג רמות HER2 ביחס לכמות מספר התא של JIMT-1 תאים מ1x10 6 עד 10 תאים. גרף בר (B) המייצג את הנתונים ונרשמת מ ניתוח qRT-PCR של HER2 האנושי, הווה גן בשד האנושי JIMT-1 יכול שורת תאי CER. רמות HER2 אדם בריאה הן מנורמלות לGAPDH עכבר. (+) מציין ביקורת חיובית. (-) מציין ביקורת שלילית. תוצאות נרשמות על יומן בקנה מידה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| RNA תבנית | 0.5-2 מיקרוגרם |
| iScript Supermix | 4 μl / מדגם |
| nuclease ללא מים | עד 20 μl / מדגם |
1. מרכיבי הטבלה הראשונה סטרנד סינתזה תערובת תגובה (שלב 3.3.1).
| שלב 1: 25 מעלות צלזיוס | 5 דקות |
| שלב 2: 42 מעלות צלזיוס | 30 דקות |
| שלב 3: 85 מעלות צלזיוס (סיום) | 5 דקות |
טבלת 2. תנאי PCR לראשית סטרנד סינתזה (צעד 3.3.3).
| iTAQ מיקס מאסטר | 10 μl / מדגם |
| מיקס פריימר | μl 1 / מדגם |
| עד 20 μl / מדגם |
רכיבי לוח 3. בזמן אמת תערובת תגובת PCR (שלב 4.3).
| שלב 1 | הַפעָלָה | 95 מעלות צלזיוס | 2 דקות | מחזור 1 |
| שלב 2 | Denaturation | 95 מעלות צלזיוס | 5 שניות | 40 מחזורים |
| חישול / הרחבה | 60 מעלות צלזיוס | 30 שניות | ||
| שלב 3 | ממסים Curve (אופציונאלי) | 65-95 מעלות צלזיוס (0.5 מרווחים) | 5 שניות / צעד </ Td> |
4. תנאי שולחן בזמן אמת PCR (שלב 4.5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שימוש בqRT-PCR להעריך גרורות תאים סרטניים החלב לריאות תוך שימוש במודל עכבר xenograft. הוא הכיר בכך שטכניקות אחרות, כוללים הדמיה bioluminescent, זמינות והם גם יעילים לאיתור גרורה למרות שיש ערכים משלהם ומגבלות. הנתונים שהוצגו עולה כי qRT-PCR מספק אמצעי אפקטיבי של גילוי mRNA הנגזר גידול ברקמת ריאה לכימות של גרורות כוללת. מוצע כי ניתוח qRT-PCR מספק שיטה משנית שיכול להשלים או לבצע במקום טכניקות הדמיה אלה. טכניקה זו עשויה להיות מתאימה ביותר עבור סביבות מחקר עם גישה מוגבלת לסוגים מסוימים של ציוד או לקבוצות מחקר עם אינטרסים ספציפיים בנטל גרורתי אך לא פרטה מחקרים מכניסטית.
בעוד אינפורמטיבי, יש ניתוח qRT-PCR המתואר כאן מגבלות. לא ניתן לבצע במורד הזרם נוסףניתוח, כולל אימונוהיסטוכימיה (IHC) או immunofluorescence מכתים (IF) כי כל רקמת הריאה משמשת לבידוד RNA. עם זאת, אם יחד עם טכניקת הדמיה in vivo רקמת הריאה עשויה להיות מבודדת הודעה הדמיה-לבצע סוג זה של ניתוח המשני. כמו כן, טכניקה זו מוגבלת לגילוי mRNA וכך ניתוח חלבון הוא לא אפשרי אלא אם כן ערכת בידוד רב-הכנה משמשת להכנת רקמת הריאה. הניתוח של חלבון וכתוצאה מכך עדיין מוגבל לצורך להעריך לערבב חלבון כולל, הכוללת את רקמת גידול וריאות של כל אחד, ואילו IHC / IF מאפשר למשתמש לסמן חלבונים מוכתמים ברקמת גידול מההכתמה נמצא ברקמת עכבר מבוסס על הדמיה של צביעת IHC / IF. חלופה לשימוש בכל הריאה, שמירה על מחצית מרקמת הריאה לניתוח אחר כגון היסטולוגיה עשויה להיות מועיל, אבל מפעיל את הסיכון של ממצאים סותרים אם גרורות מזוהות בחלק אחד של הריאות ולא thדואר אחר.
כמה נקודות של שינוי ופתרון בעיות מומלצות. דיוק נתוני qRT-PCR תלוי בבדיקת פריימר שנבחרה עבור assay ואופטימיזציה של בדיקות מומלצת כולל השימוש בניתוח עקום סטנדרטי מתאים לכימות תמליל. בנוסף, חשוב לאמוד את האיכות של RNA שבודד. על-עיכול של רקמה עם proteinase K יכול להפחית את איכות RNA ולכן אופטימיזציה מומלצת המבוססת על הרקמות הספציפיות של עניין ושיטה של הכנת RNA. בחירת גן התייחסות משק הבית מתאים היא גם חשובה. בעוד GAPDH הוא גן התייחסות נפוץ, כל גן משמש תפקוד תקין בתא שאפשר לשנות בשל תנאי ניסוי (שינוי גנטי כלומר של בעלי חיים מארח כגון נוקאאוט גן) ובכך אפשרויות חלופיות הן שימושיות. כמה גני התייחסות משותפים המדווחים ליש מפורשים בכל מקוםיון ווריאציה נמוכה בכמות הם גני המקודדים TATA-תיבת החלבון המחייבת (TBP), רטיניטיס רטיניטיס 2 , חלבון כמו אקטין (חוק), (rp2) וגורם טאבי bipartite שעתוק (ג'קוזי) 11. יתר על כן, השלבים הקריטיים שמבטיחים ניתוח מדויק כוללים נתיחה ושטיפה מדויקות של הריאות (שלב 1.2.2-1.2.6), כימות נכון של רנ"א הכל מבודד (שלב 3.2), וpipetting מדויק במהלך התקנת qRT-PCR (שלב 4.4). שימוש בpipettor חוזר יכול לסייע בתהליך זה.
לסיכום, פרוטוקול זה נועד על מנת להוכיח כי qRT-PCR הוא שיטה לכימות לזהות גרורות ריאות. שניהם ערך חיובי ומגבלות מזוהות עם השימוש בהליך זה, וייתכן שזה יהיה מתאים ביותר לזיווג עם שיטה משנית של ניתוח. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות הליך ישר קדימה של quantitation לLaborator המחקר אלהies עם צרכי מחקר ספציפיים או מחסור בציוד נרחב לחקור גרורות. . יישומים עתידיים של שיטה זו כוללים שינוי לחפש גרורות באברי מטרה מעבר לריאות, כגון בלוטה לימפה או במוח, שהם אתרים נפוצים אחרים של גרורות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ESY ומאא אינם מועסק על ידי FirstString המחקר בע"מ ולא מחזיקים שום אינטרס כלכלי בחברה. FirstString ריסרץ 'סיפק את נתוני ההדמיה לוציפראז שהוצג בכתב היד הזה. GSG הוא נשיא ומנכ"ל של מחקר FirstString. CLG הנו עובד מחקר FirstString. יש לי GSG וCLG אופציות שהונפקו על ידי מחקר FirstString.
Acknowledgments
המעבדה יה נתמכת על ידי מימון מחקר מאגודה אמריקנית לסרטן מוסדי מענק מחקר (IRG-97-219-14) הוענק למרכז הסרטן הולינגס בMUSC, על ידי מימון מחקר ממענק משרד ההגנה (W81XWH-11-2- 0229) בMUSC, ועל ידי פרסים מדאגת הקרן (לESY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| DNAse | Thermo Scientific | EN0521 | |
| GeneJet RNA Isolation Kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25636 | |
| PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25716 | |
| gapdh Primer Sequence | For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG |
References
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J.
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).
- Saxena, M., Christofori, G.
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).
- Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis. Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).
