Introduction
Studiet af plasmonics har tiltrukket stor interesse på grund af sine applikationer i mange forskellige områder 1-4. En af de mest undersøgte felter i plasmonics er overflade plasmonics, hvor den kollektive svingning ledningsforstyrrelser elektroner par med en ekstern elektromagnetisk bølge på en grænseflade mellem et metal og dielektrikum. Surface plasmonics er blevet undersøgt for sine potentielle anvendelser i subwavelength optik, biofotonik og mikroskopi 5,6. Den stærke forøgelse felt i ultra-lille volumen af metalliske nanopartikler på grund af lokaliseret overfladeplasmonresonans (LSPR) har tiltrukket omfattende opmærksomhed, ikke blot på grund af dens usædvanlige følsomhed over for partikelstørrelser, partikel former og de dielektriske egenskaber af omgivende medium 7 -10, men også på grund af sin evne til at sætte skub i sagens natur svage ikke-lineære optiske effekter 11. Den ekstraordinære følsomhed LSPR er værdifuldt for bio-sensing og nær-field billeddiagnostiske teknikker 12,13. På den anden side kan den større linearitet af plasmoniske strukturer anvendes i fotoniske integrerede kredsløb i applikationer såsom optisk kobling og all-optisk signalbehandling 14,15. Det er velkendt, at plasmoniske absorption er lineært proportional med excitationsintensitet ved lave intensitetsniveauer. Når excitation er stærk nok, absorptionen når mætning. Interessant nok ved højere intensiteter, absorptionen stiger igen. Disse ikke-lineære effekter kaldes mættelig absorption (SA) 15-17 og revers mættelig absorption (RSA) 18 hhv.
Det er kendt, at på grund af LSPR, spredning er særlig stærk i plasmoniske strukturer. Baseret på grundlæggende electromagnetics bør reaktion spredning versus hændelse intensitet være lineær. Men i nanopartikler, spredning og absorption er tæt forbundet via Mie-teorien, og begge kan være expressed i form af reelle og imaginære dele af den dielektriske konstant. Under den antagelse, at en enkelt GNS opfører sig som en dipol under lys belysning, kan spredningen koefficient (Q SCA) og absorptionskoefficienten (Q abs) fra en enkelt plasmoniske nanopartikel i henhold til Mie teorien udtrykkes som 19
hvor x er 2 πa / λ, a er radius af kuglen, og m 2 er ε m / ε d. Her ε m og ε d svarer til de dielektriske konstanter af metallet og de omkringliggende dielektrikum, henholdsvis. Siden form af spredningen koefficienten svarende til den i the absorptionskoefficient det derfor forventes, at observere mættet spredning i en enkelt plasmoniske nanopartikel 20.
For nylig blev nonlineær mættende spredning i en isoleret plasmoniske partikel påvist for første gang 21. Det er bemærkelsesværdigt, at spredningen intensiteten faktisk i dyb mætning, faldt en smule, når excitationsintensitet steget. Endnu mere bemærkelsesværdigt, når excitationsintensitet fortsatte stigende efter spredning blev mættet, spredningsintensiteten genopstod, der viser virkningen af omvendt mætbar scattering 20. Wavelength- og størrelse-afhængige undersøgelser har vist en stærk sammenhæng mellem LSPR og ikke-lineær spredning 21. De intensitet og bølgelængde afhængigheder af plasmoniske spredning er meget lig dem af absorption, hvilket antyder en fælles mekanisme bag disse ulineære adfærd.
I form af applikationer, er det vel known at linearitet hjælper til at forbedre optisk mikroskopi opløsning. I 2007, mættet magnetisering (SAX) mikroskopi blev foreslået, hvilket kan øge opløsning ved at udtrække den mættede signal via en tidsmæssig sinusformet modulation af excitationsstrålen 22. SAX mikroskopi er baseret på konceptet, at for en laser brændpunktet, intensiteten er stærkere i midten end i periferien. Hvis signalet (enten fluorescens eller spredning) udviser mætningsopførsel, skal mætning starte fra centrum, mens den lineære respons forbliver på periferien. Derfor, hvis der er en metode til at udvinde kun mættet del, vil det kun efterlade den centrale del og afvise den perifere del, og således effektivt øge den rumlige opløsning. I princippet er der ingen nedre grænse for opløsning SAX mikroskopi, så længe dybe mætning er nået, og der er ingen skader prøven på grund af den intense belysning.
Det er blevet vist, at resolution af fluorescens billeddannelse kan blive væsentligt forbedret ved at udnytte den SAX teknik. Men fluorescens lider af fotoblegning virkning. Kombinere opdagelsen af spredning ulinearitet og begrebet SAX, kan superopløsning mikroskopi baseret på spredning realiseres 21. Sammenlignet med konventionelle super-opløsning microscopies, spredningen-baserede teknik giver en ny ikke-blegning kontrast metoden. I dette papir, er en trin-for-trin beskrivelse givet at skitsere de procedurer, der kræves for at opnå og udtrække nonlinearity af plasmoniske spredning. Metoder til identifikation af spredning ulineariteter indført ved at ændre den indfaldende intensitet er beskrevet. Flere detaljer vil blive givet at udrede, hvordan disse ulineariteter påvirker billeder af enkelte nanopartikler og hvordan rumlig opløsning kan forbedres tilsvarende af SAX teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. GNS Sample Preparation
- Før fremstilling af prøven, soniker 1 ml GNS kolloid opløsning i mindst 15 minutter ved ca. 40 kHz for at forhindre partikelaggregation, som kan forårsage LSPR peak at flytte.
- Drop 100-200 pi GNS kolloid på et dias glas med kommerciel magnesiumaluminiumsilicat (MAS) belægning for at løse GNSS.
- Efter mindst 1 min, fjerne de ekstra kolloid ved skylning med destilleret vand. Ventetiden afhænger af den krævede fordeling densiteten af GNSS. Typisk 1-3 min resulterer i en passende tæthed, der gør det muligt at partiklerne let kan identificeres, da de fleste af dem er isoleret fra hinanden. Betydelig sammenlægning kan opstå, hvis ventetiden er for lang.
- Tør prøven ved skylning med nitrogen gas.
- (Valgfrit) Hvis du vil kortlægge GNSS på glasset med høj opløsning, skal du udføre scanning elektronmikroskopi (SEM) på dette tidspunkt 23. Et eksempel billedet er tilvejebragt i Figure 1, der viser den karakteristiske densitet af GNSS. Brug et felt emission SEM at erhverve billedet. Når olie tilsættes på prøven (næste trin), vil det være vanskeligt at fjerne olien og observere prøven med SEM.
- Tilføj en dråbe olie med samme brydningsindeks på prøven for at dække GNSS og at fjerne den stærke refleksion fra glassubstratet.
- Placer en dækglas oven på prøven og forsegle det med neglelak.
- Vent mindst 5 minutter, indtil neglelak tørrer. Prøven er nu klar.
2. Tilpasning af Home-bygget konfokalmikroskop
- Se Figur 2 for ordningen af opsætningen. Juster hvidt lys belysning vej mikroskopstativet selv. Tænd halogen lyskilde af mikroskopet, og følg mikroskopet producentens manual for at opnå den Köhler belysning tilstand. Sikre, at de hvide halogen lysstråler er næsten parallelt på bagsiden afblænde af målet, delvist reflekteres af 50/50 stråledeler, og derefter udbrede mod laseren.
- Tænd galvano spejle til at sikre, at de forbliver i den korrekte udgangsposition, det vil sige i midten af scanningsområdet.
- Placer mindst to mål, lavet af et tyndt stykke papir med koncentriske ringe på det, langs halogen lysbanen, og tilpasse dem med halogen stråle.
- For at udføre billedbehandling, skal du vælge 532 nm laser. For at udføre spektroskopi målinger, skal du vælge den super-kontinuum laser. Under justeringen bør magt lasere være mindre end 10 uW på bagsiden blænde af målet for at undgå ikke-linearitet. Derefter kollimere den indfaldende laserstråle modsat den udgående halogen stråle ved hjælp af de to mål. Når denne proces er afsluttet, er den grove tilpasning af laserstrålen er nået.
- Juster laserstrålen gennem midten af ryggen blænde i objektivlinsen. Typisk brug en oil-immersionsobjektivet. Tilføj en dråbe olie mellem olieimmersionsobjektiv linsen og GNS prøven. Brug et fotomultiplikatorrør (PMT) som detektoren til at indsamle spredningen signaler af GNSS.
- Placer en 20-um diameter hul foran PMT at blokere ude af fokus spredning signaler. Tænd galvano spejle og PMT (via hjemme-bygget software), justere pinhole position og højde af prøven scenen for at maksimere returspredningskurver signaler af GNSS, og derefter observere en individuel GNS på en computerskærm. En prøve xy billede af GNSS med korrekt justering er vist i figur 2B.
- Lidt ændre højden af prøven tidspunkt at kontrollere koncentricitet af fokus. Hvis det ikke er koncentriske, justere strålen med de to spejle i forsiden af scanneren, indtil midten af GNS forbliver på samme position, mens højden af prøven fase ændres. Sørg for, at xz billede af PSF svarer til figur 2Cfor at sikre korrekt lyshøjden. Behandle disse to billeder med lav-pass og Gauss glatte filtre.
3. Karakterisering af Scattering Nonlinearity
- Ved lav excitationsintensitet (mindre end 10 4 W / cm2), erhverver et billede af guld nanopartikler ved at følge protokollen 2.6.
- Åbn billedet i ImageJ (eller enhver anden billedanalyse software). Tegn en linje på tværs en af GNSS i billedet (se figur 2B), og bruge Analysis -> Plot profil af ImageJ værktøjer til at hente spredning intensitet profil. Monter profilen af den valgte PSF med en Gaussisk funktion:
hvor y er PMT udlæsning værdi, y 0 er baggrundsværdien (hvis nogen), A er peak amplitude, W er bredden, x er den rumlige koordinere og Xc er centrum koordie af Gauss funktion. Den FWHM af den tilsvarende PSF er (½ln2) w. Baseret på den numeriske apertur (NA) af målet, kan den teoretiske FWHM af konfokal PSF estimeres til at være ca. 0.43l / NA, hvor l er excitationsbølgelængden. Sammenlign disse to tal at kontrollere opretningen af det billeddannende system. - Øg excitationsintensitet ved manuelt at ændre den neutrale tæthed (ND) filter i figur 2A, og registrere returspredningskurver billeder på hvert intensitetsniveau. Tag værdien af spredning signalet fra midten af hver GNS ved forskellige excitations- intensiteter, og plot kurven for spredning signaler versus excitation intensiteter. Kontrol af lineariteten af de første få punkter, som bør udvise en lineær sammenhæng, når excitationsintensitet er tilstrækkeligt lav. Tegn en linje baseret på lineær montering af de første par punkter. Hvis spredningen intensiteter af de efterfølgende punkter falde under denne lineære trend, saturation er opstået.
- Efter at have bemærket mætbar spredning, gradvist mindske intensiteten under tærskelværdien mætning og billedet det samme GNSS igen for at sikre reversibiliteten af den ikke-lineære adfærd.
4. Måling af en spredning spektrum af et fælles Guld nanosfære
- For at måle backscattering spektret fra en enkelt GNS bruge super-kontinuum laser som laser kilde. Den indledende laserens bølgelængde i området fra 450 nm til 1750 nm. For at fjerne den overskydende infrarøde magt, der kan forårsage skade på prøven og de optiske komponenter, skal du placere en eller to spejle lige efter den super-kontinuum laser til at reflektere det synlige lys, og bruge stråle dumper at indsamle de overskydende infrarødt lys.
- Følg procedurerne alignment i afsnit 2 til at lede super-kontinuum laser i laser scanning konfokal mikroskop. Brug en bredbåndsforbindelse 50/50 BS at sikre spektral dækning i hele synlige område.
- Anskaf enbillede af GNSS på glas. Find en enkelt GNS i billedet, og indstille fokus af det indfaldende bredbånd lys på partiklen.
- Brug en spejlvende spejl foran PMT at lede backscattering signalet mod spektrometer, som er udstyret med en ladningskoblet enhed, og derefter tage et spektrum af de udvalgte enkelte GNS. Pas på, at spektret her er en blanding af GNS spredning og baggrunden på grund af refleksioner fra andre overflader.
- Skift tilbage til PMT detektoren, og tage et andet billede for at bekræfte, at partiklen position ikke har ændret sig. Derefter flytte fokus til et punkt, hvor der ikke partiklen er til stede. Skift tilbage til spektrometer, og tage en flere frekvenser, som repræsenterer baggrunden.
- Træk baggrunden spektret fra trin 4.5 fra spektret fra trin 4.4 for at opnå en klar tilbagespredning spektrum af en enkelt GNS.
5. Tilpasning af SAX Microscope
- Se figur 3for ordningen af SAX mikroskop, hvor en ideel sinusformet tidsmæssig modulation fås fra rytmen frekvens mellem to akustisk-optiske modulatorer (AOMs). Først justere strålen størrelsen af laser til at opfylde kravet om de efterfølgende AOMs. Opdele 532 nm laserlys i to stråler ved hjælp af en 50/50 stråledeler.
- Guide de to stråler gennem de to AOMs, med én stråle passerer gennem hver AOM. De modulerende frekvenser af de to AOMs skal være forskellige. For eksempel kan man være på 40.000 MHz og den anden på 40,010 MHz, hvilket giver en forskel frekvens på 10 kHz. Denne forskel frekvens vil være den grundlæggende graduering frekvens f m for sax signaler.
- Tag den første ordens diffrakterede stråler fra begge AOMs, og kombinere de to stråler ved at bruge en anden 50/50 stråledeler. Indstil spejlene efter AOMs at kollimere de to stråler.
- Tilføj en fotodetektor, der er forbundet til et oscilloskop til at overvåge den tidsmæssige modulation. Opdele en lille del af laseren med en objektglas, og sende den til fotodetektoren, som vist i figur 3. Med korrekt modulation og stråle overlappende, observere sinusformet intensitetsmodulation på de vigtigste frekvens f m, svarende til den af kurveformen vist i figur 4.
Bemærk: Baggrunden for modulation skal være så lavt som muligt for at opnå den maksimale modulation dybde. Derudover bruger Fourier analyse funktion af oscilloskopet til at kontrollere, at den harmoniske forvrængning af gradueringen er faldende. For at opnå succes SAX implementering, sikre en perfekt sinusformet excitation intensitet modulation med minimeret indledende ikke-linearitet. - Afbryd den elektriske output af fotodetektor fra oscilloskopet og oprette forbindelse til henvisningen indgangen på en lock-in forstærker.
- Som vist i figur 3, tilslutter laserstrålen i det konfokale system efter tidligere protokoller. Here, tilslut den elektriske output af PMT til lock-in forstærker som signalet input.
- Brug en blank dækglas som prøve og kontrol af lineariteten af det elektriske system ved påvisning gradvist at øge magnetiseringseffekt ,, som vist i figur 5, hvor detektoren er lineær under en udlæsning værdi på 1-V. I alle efterfølgende målinger, sørge for at begrænse udlæsningen til under denne værdi.
- Indstille produktionen af lock-in forstærker til at eksportere den absolutte størrelse af spændingen signal. Ved at ændre den harmoniske komponent indstilling på referencekanalen, opnå amplituder sax signaler, A 1, A 2, og så videre.
- Eksportere de lineære og ikke-lineære signaler fra lock-in forstærker til en datafangst-kort, der også modtager de drivende spændingssignaler af raster scanning galvano spejle. Ved hjælp af en tilpasset Labview program, synkronisere signalerne fra lock-in forstærker oggalvano spejle til at danne et billede.
- For at optimere signal-støj-forholdet i billederne, vælge passende købet pixel og integrationstider af lock-in-forstærker. For eksempel, når den vigtigste graduering frekvensen f m af excitation er 10 kHz, dvs. når den periode er 100 psek, indstille integrationen tidspunktet for lock-in forstærker for at være mindst tre gange længere end den periode. Tilføjelse tidspunktet for galvanisk spejl bevægelsen, er erhvervelsen hastighed sat til 1.500 pixels per sekund i SAX billedbehandlingstype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6 viser det målte spektrum fra en 80 nm GNS. En beregnet kurve baseret på Mie teori er givet i samme plot, der viser glimrende aftale. Den LSPR top er omkring 580 nm. I det følgende eksperiment, laser bølgelængde var 532 nm, som blev valgt som det er placeret inde i plasmoniske bandet at øge optisk spredning med plasmoniske virkning, og gøre det muligt at sprede mætning 21.
Figur 7 gaver spredning billeder af en enkelt guld nanopartikel ved forskellige excitation intensiteter, og den nederste række giver den linje profilen af hver partikel for at fremhæve ikke-linearitet. Billedstørrelsen er 600 nm × 600 nm, og pixelstørrelse er 13,8 nm. Købet hastighed var 234.000 pixels per sekund i den normale xy billedbehandlingstype. Hvert billede er et gennemsnit over fem erhvervelser at forbedre signal-støj-forholdet.
Når excitationsintensitet er lavere end1,5 × 10 6 W / cm2, spredningen er lineært afhængig af excitation intensitet, så det resulterende billede af en enkelt nanopartikel ligner PSF af excitationsstrålen, med en standard Gaussisk profil. Men når excitationsintensitet stiger til 1,7 × 10 6 W / cm2, ikke kun klart udfladning på toppen af polyesterfibrene observeret, men også udvide af FWHM, hvilket indikerer mætning. Meget interessant, ved lidt højere intensiteter, bliver den centrale intensitet lavere end den perifere, hvilket resulterer i en doughnut-formet polyesterfibre. Når så excitationsintensitet fortsætter med at stige, spredningsintensiteten øger igen, afslører omvendt mætning og resulterer i en ny top i midten af polyesterfibre.
Ved at plotte de centrale intensiteter på vævede ved forskellige excitations- intensiteter, er spredningsintensiteten afhængighed opnået, som vist ved prikkerne i figur 8. Denne kurve clearly afslører tendenserne i mætning og omvendt mætning adfærd. Som forventet, det ligner meget intensiteten afhængighed lineær absorption 15-17. Efter den typiske fremgangsmåde til analyse af ikke-lineær absorption, blev et polynomium funktion, der bruges til at passe den ulineære spredning resultat. Men forskellig fra de fleste ikke-lineære absorption studier, hvor tredje-ordens-linearitet er tilstrækkelig til at modellere resultaterne, her femte-ordens linearitet var forpligtet til bedre at passe spredningen kurve.
Som nævnt i afsnit 5, kan de harmoniske frekvens komponenter eksperimentelt ekstraheres med en lock-in forstærker, og resultaterne er angivet i figur 9A. På den anden side kan de harmoniske komponenter beregnes ud fra figur 8. Brug først et polynomium funktion, hvor I er excitationsintensitet, til at passe figur 8, så vi har de tilpasningsparametrene α, β, γ .... Vi kan derefter udtrykke excitation intensity som tidsmæssigt moduleret funktion I (t) = I 0 (1 + cos (2 πf m t)) / 2, hvor t er tiden, f m er modulationsfrekvensen, og I 0 er den maksimale excitation intensitet. Ved at substituere I (t) i S (I), og gøre en Fouriertransformation til at omdanne den resulterende S (I (t)) i frekvensdomænet, vi har følgende ligning består af flere delta funktioner (A):
Koefficienten for hvert delta-funktion (A 0, A 1, A 2, etc.) repræsenterer amplituden af SAX signal ved den tilsvarende harmoniske frekvens. Disse koefficienter, som svarer til sax signaL styrker på forskellige harmoniske, kan skrives som funktioner af tilpasningsparametre a, p, γ ...:
Beregningsresultaterne er vist i figur 9B. De eksperimentelle og beregningsmetoder plots enige nøje, især i de følgende to aspekter.
Først kurverne for 2 f m og 3 m f er ikke glat, viser dips på bestemte intensiteter langs kurverne. I begge figurer er der tre dips i de 2 f m kurver, mens to dips ses i 3 f m kurver. For det andet, skråningerne er forskellige med forskellige excitation intensiteter. Når excitationsintensitet ikke er høj, skråningerne af 1 f m, 2 f m og 3 m f er 1, 2 og 3, henholdsvis. Men efter hver dukkert, skråningerne af de tilsvarende ikke-lineære kurver bliver større.
Med dips og hældning variationer, er ukonventionelle vævede forventes, hvis den ikke-lineære komponenter er udvundet via SAX teknik, når excitationsintensitet stiger på tværs af dips. Figur 10A viser SAX billede eksempler på 1 f m, 2 f m, og 3 f m frekvenskomponenter ved forskellige excitations- intensiteter. I første række, at excitationsintensitet er 0,7 MW / cm2, hvilket er tilstrækkeligt til at inducere de ikke-lineære komponenter, men amplituden er forholdsvis svag. På dette intensitetsniveau, hældningen på 2 f m signalet er 2, og det er 3 til 3 f m signal, som vist i figur 9A. Hvis excitationsintensitet stiger til niveauet for den første dip af 2 f m signal, sax billeder af 2f m signal bliver ringformet, som vist i den anden række i fig 10A. Både 1 f m og 3 m f billeder forbliver fast, mens FWHM af 3 f m PSF er betydeligt mindre end den 1 f m signal, manifesterer bemærkelsesværdig opløsningsforbedring. Fra signalet profil på panelet yderst til højre i den samme række, i FWHM af 2 f m donut ring er ca. 110 nm. På den anden side, den tredje række af figur 10A viser, at når excitationsintensitet stiger til den første dip af 3 f m signal, bliver kun 3 f m billede ringformet, med en 65 nm ring bredde. På denne intensitet, er bemærkelsesværdig opløsningsforbedring fundet ved sammenligning af 2 f m signal til 1 f m én.
Figur 10B og 10C viser den beregnede PSFs i de 2 f m og 3 f m signaler henholdsvis på de tilsvarende intensiteter, der resulterer i doughnut former. Beregningerne er baseret på polynomiet fitting kurve i figur 9B. De beregnede kurver godt reproducere funktionerne i de eksperimentelle vævede i yderste højre paneler i figur 10A, bekræfter igen egnethed en femte-ordens polynomium for den ikke-lineære spredning.
Figur 1. SEM billede af GNSS. Ved at udføre de fremstillingsprocesser, der er beskrevet i den første del af protokollen, er tilstrækkeligt adskilt GNSS overholdes. Med mere end 100 nm mellem GNSS, deres LSPR effekter ikke er koblet til hinanden. Målestok:. 100 nm Klik her for at seen større version af dette tal.
Figur 2. (A) Opsætning af hjemme-bygget konfokalmikroskop 24. (B) xy billede med GNSS på fokus. 2 (c):. Xz billede af PSF med korrekt justering Der er to laser kilder til dette system. Den ene er en 532 nm kontinuerlig bølge laser, og den anden er en pulserende super-kontinuum laser. Ved måling af sprednings- signaler blev en 532 nm kontinuerlig bølge laser, der anvendes som kilde og en PMT detektoren (med en laser netfilter indsat). For at måle spektret blev en super-kontinuum laser vedtaget som laser kilde, og et spektrometer som detektoren. Den valgte laser sendes gennem et sæt neutralfiltre at kontrollere excitationsintensitet. En 50/50 stråledeler guider laseren i scanning mikroskop og giver halvdelen af tilbageskuende scattering signaler iPM T eller spektrometer, som er udvalgt af en flipping spejl. I scanningssystem, der er to galvanisk spejle, der danner lodret og vandret raster scanning i brændplanet af en objektiv. Den baglæns spredning indsamles af samme mål og omdannes til elektriske signaler, som detektorerne. Signalerne synkroniseret med det konfokale scanning system til dannelse af billeder. PI fase blev anvendt til at erhverve xz billedet ved at flytte GNSS aksialt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Opsætning af SAX mikroskopi. De fleste komponenter er de samme som dem, der opnås fra et konfokalt mikroskop (rød rektangel), men sinusformet modulation sattes til excitation laserstråle. Blåt rektangel viser modulator opsætning. Først blev excitation laser opdelt i to stråler og separat sendes gennem to AOMs at producere højfrekvente modulationer med lidt forskellige frekvenser. Derefter blev de to modulerede stråler kombineres for at producere sinusformet modulation på rytmen frekvens mellem de to AOMs. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Modulation af kombinerede bjælker efter AOMs målt ved oscilloskop. Y1 og Y2 angiver maksimum (52,1 MW) og minimum (1,2 mW) værdier for graduering intensitet, hhv. Y2 bør være nul for at opnå en perfekt graduering. Aktuel modulationsfrekvens var 10 kHz. Klik her for at se et stortR-version af dette tal.
Figur 5. Linearitet test af påvisning system. Ved at placere et dækglas på brændplanet blev afspejling af excitation laser fra glas / luft-grænsefladen bruges til kontrol af lineariteten af påvisning system. Signaludgangen versus excitationsintensitet viser linearitet under en udlæsning værdi på 1-V. Desuden støjniveauet er langt under 10 -4 V, så systemet giver et dynamisk område på mindst 10 4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Scattering spektrum af 80 nm GNS. Røde prikker indikerer experimEntal målinger, og sort linje repræsenterer beregning fra Mie teori. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Scattering billeder af GNS fra lineær til at vende mætning. Top række viser returspredningskurver billeder og nederste række giver signal profiler af udvalgte nanopartikel ved forskellige excitation intensiteter. Overgang fra linearitet til mætning at vende mætning er tydeligt iagttages. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. spredningsintensitetversus excitation intensitet fra enkelte GNS. Blå prikker svarer til spredning intensiteter i centrum af PSF ved forskellige excitation intensiteter, som viser meget ulineære reaktioner, herunder mætning og omvendt mætning. Røde kurve viser fit kurve baseret på femte ordens polynomium. (Billeder gengivet fra ref. 25). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9. Intensitet afhængigheder af SAX signaler efter (A) eksperiment og (B) beregning. (A) SAX signaler blev ekstraheret ved lock-in forstærker, og hvert eksperimentelt datapunkt blev i gennemsnit over fire 80 nm GNSS. Stiplede linjer angiver skråninger af SAX signaler 25. (B) Efter protokol 5, SAX signals blev beregnet på grundlag af femte-ordens polynomium i figur 8. (Billeder gengivet fra ref. 25) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10. SAX billeder ved forskellige excitations- intensiteter. (A) Eksperimentelt observeret 1 f m, 2 f m og 3 f m SAX billeder på forskellige excitation intensiteter. Pixel størrelse er 20 nm, og hvert billede størrelse er 750 nm × 750 nm. Intensitetsprofiler af donuts på 2 f m og 3 m f er afbildet i yderste højre paneler. (B) Beregnet billede profil på 2 f m billede ved 0,75 MW / cm2. (C) Beregnet billede profil på 3 f </ em> m billede ved 1,1 MW / cm2. (Billeder gengivet fra ref. 25). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I protokollen er der flere kritiske trin. Først i forbindelse med forberedelsen af prøverne, tætheden af nanopartikler bør ikke være for høj, for at undgå plasmoniske kobling mellem partikler. Hvis to eller flere partikler er meget tæt på hinanden, koblingsdelene resulterer i LSPR bølgelængde skifte til længere bølgelængder, således markant nedsættelse af ikke-linearitet. Men denne imagografiteknik faktisk kortlægger fordelingen af plasmoniske tilstande, i stedet for selve partiklerne. Derfor forventes det, at med en passende excitationsbølgelængde, kan de koblede plasmoniske tilstande også vise en stærk spredning ulinearitet og kan afbildes med forbedret opløsning. For det andet, er det meget vigtigt at producere rent sinusformet modulation inden excitationsstrålen, således motiverer brugen af slå mellem de to AOMs. Da resolution enhancement afhængig udvinde lineære dele (harmoniske frekvens komponenter) i spredningen signal modulation, hvis ikke-lineærforvrængning er til stede i excitation modulation, derefter ekstraktion vil være vanskeligere. Hertil kommer, at den nuværende ordning, er et interferometer opsætning anvendes til at fremstille det bankende modulation, så opretningen af de to stråler i interferometeret er også afgørende for at opnå så stor en modulationsgrad som muligt. For det tredje er det meget vigtigt at sikre, at signalet ikke-linearitet ikke stammer fra detektionssystemet (som omfatter detektoren, forstærker, A / D konverter, og computerens I / O). Derfor er det nødvendigt særlig opmærksomhed for at sikre, at påvisning systemet fungerer inden for det dynamiske område. Det dynamiske område er defineret som regionen detektionssystem linearitet, det vil sige fra støjniveauet detektor mætning. I den aktuelle sag, det detekterede spænding signalet er lineært under 1 V, og støjniveauet er under 10 -4 V. Derfor giver systemet et dynamisk område på mindst 10 4. For at sikre, at signalet nonlinearity stammer fraguldet nanopartikel selv, ikke fra detektionssystemet, er det nødvendigt at opretholde udlæsningen værdi inden for det dynamiske område. Den fjerde kritiske faktor er den mekaniske stabilitet af prøven. Under nonlinearity beskrivelse, er det vigtigt, at nanopartiklerne forblive i samme fokale plan. Aksial afdrift af nanopartikel eller prøven tidspunkt ville alvorligt påvirke nøjagtigheden af nonlinearity vurdering. Derfor når man arbejder med nanopartikler, er det vigtigt at finde partikler, der ikke let bevæge sig rundt under lys excitation. På den anden side er det også muligt at arbejde med prøver af arten litografi. I dette tilfælde, mikroskopiske fase stabilitet er den vigtigste begrænsende faktor. Der er trin med stillingstilbagemelding kontrol, i høj grad kan forbedre stabiliteten. Alternativt idet bordbevægelse er typisk meget langsom (f.eks 1 um i 10 minutter), er det nyttigt at erhverve en xyz 3D billedstak, såsom 10 billeder med 100 nm aksial separation mellem tilstødende billeder, ved hver forskellig intensitet værdi. Så i løbet af analysen fase bør det lyseste billede ud af hver stak vælges som repræsentant billede ved denne intensitet.
I princippet opløsningen af mætning-baserede teknikker, som omfatter SAX og mættet struktureret-lys mikroskopi (SSIM) 26, udviser ingen nedre grænse, så længe høj orden nonlinearity (høj harmoniske frekvens komponenter) kan opnås. Ikke desto mindre, i praksis er opløsningen begrænset af signal-til-støj-forhold (SNR), især når ekstraktion højere ordens harmoniske demodulation komponenter. Der er et par strategier, der kan forbedre SNR. For eksempel er det blevet vist, at modulationsfrekvensen alvorligt påvirker SNR 27. Det er også muligt at forbedre SNR ved at beregne intensiteten forskellen mellem ikke-mættede og mættede signaler kun at udtrække den mættede signal (manuskript under udarbejdelse).
28-30, ellerved mætning af fluorescensemission 22,26,31. Men fluorescens udviser en iboende problem med foto-blegning, især under stærkt lys belysning. Denne undersøgelse viste, at mættelig spredning af GNSS er en lovende metode til super opløsning mikroskopi, da der ikke er nogen blegning spørgsmål 21. Sammenlignet med tidligere undersøgelser af SAX mikroskopi under anvendelse af fluorescens, forbedring opløsning med mættelig spredning var meget højere i denne undersøgelse, muligvis på grund af højere ordens nonlinearity 22. Desuden bortset SAX mikroskopi, der er en anden super opløsning, der bygger på mætning: SSIM 26. SSIM udnytter rumlig modulation af frynser til at udtrække de ikke-lineære signaler, mens SAX mikroskopi udnytter tidsmæssig modulation. Med mætning ejendom af denne ikke-blegning spredning er det forventes derfor, at denne opdagelse kan kombineres med SSIM at forbedre den rumlige opløsning under wide-field sygumination.
I fremtidige applikationer vil denne plasmoniske SAX teknik være nyttigt ikke blot at løse resonans-mode fordelinger og dynamik i plasmoniske kredsløb, men også for at forbedre opløsningen af biologisk væv billeddannelse. Tilsvarende Resolution Enhancement er blevet påvist med andre plasmoniske materialer, såsom sølv (upubliceret), såvel som ikke-plasmoniske materialer, såsom silicium 32. I feltet imaging super-opløsning, SAX mikroskopi har fordele i flere henseender. Sammenlignet med stokastisk optisk mikroskopi genopbygning (storm) og foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM), SAX mikroskopi har en hurtigere hastighed på kun nogle få sekunder pr billede. Sammenlignet med stimuleret emission depletion (STED) mikroskopi, er kun en laser kræves for SAX mikroskopi, hvilket reducerer den optiske kompleksitet. Sammenlignet med SSIM, er løsningen af SAX samtidigt forbedret i både den laterale og aksiale retninger. I tillæg tilopnå en tilstrækkelig billedbehandling dybde, tilfældig spredning langs bjælken vej excitation eller indsamling er kritisk. For bred felt teknikker som STORM, PALM og SSIM er billeder taget med et kamera, som er meget modtagelige for tilfældig spredning af udsendte fluorescens fotoner i væv. For punkt scan som STED og SAX, er fluorescenssignalerne opsamlet ved et punkt detektor, så de er mere robuste over for væv spredning. , STED kræver alligevel en fase plade til at skabe en doughnut stråle profil på fokus, og information fasen kan forværredes i stråle formering i væv. Derfor bør SAX mikroskopi være den bedste blandt disse nærmere bestemmelser for dyb væv super-opløsning billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope body | Olympus, Japan | BX-51 | |
| objective lens | Olympus, Japan | UPlanSapo, 100X, NA 1.4 | |
| 80-nm gold colloid | BBI Solutions, UK | EM.GC80 | |
| supercontinuum laser | Fianium, United Kingdom | SC400-2-PP | |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, USA | BB1-E02 | |
| field emission SEM | JEOL, Japan | JSM-6330F | optional |
| spectrometer | Andor Technology, UK | Shamrock 163 | |
| charge-coupled device | Andor Technology, UK | iDus DV420A-OE | |
| acousto-optic modulators | IntraAction Corp., USA | AOM-402AF1 | |
| lock-in amplifier | Stanford Research Systems, USA | SR-830 | |
| MAS-coated slide glass | Matsunami Glass, Japan, | S9215 |
References
- Fang, N., Lee, H., Sun, C., Zhang, X. Sub-diffraction-limited optical imaging with a silver superlens. Science. 308 (5721), 534-537 (2005).
- Lee, B., Kim, S., Kim, H., Lim, Y. The use of plasmonics in light beaming and focusing. 34 (2), 47-87 (2010).
- Lal, S., Link, S., Halas, N. J. Nano-optics from sensing to waveguiding. Nature Photon. 1 (11), 641-648 (2007).
- Kawata, S., Inouye, Y., Verma, P. Plasmonics for near-field nano-imaging and superlensing. Nature Photon. 3 (7), 388-394 (2009).
- Homola, J., Yee, S. S., Gauglitz, G. Surface plasmon resonance sensors: review. Sensor. Actuat. B-Chem. 54 ((1-2)), 3-15 (1999).
- Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
- Hache, F., Ricard, D., Flytzanis, C. Optical nonlinearities of small metal particles - surface-mediated resonance and quantum size effects. J. Opt. Soc. Am. B. 3 (12), 1647-1655 (1986).
- Balamurugan, B., Maruyama, T. Evidence of an enhanced interband absorption in Au nanoparticles: Size-dependent electronic structure and optical properties. Applied Physics Letters. 87 (14), 143105 (2005).
- Link, S., El-Sayed, M. A. Size and temperature dependence of the plasmon absorption of colloidal gold nanoparticles. J. Phys. Chem. B. 103 (21), 4212-4217 (1999).
- Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment. J. Phys. Chem B. 107 (3), 668-677 (2003).
- Kauranen, M., Zayats, A. V. Nonlinear plasmonics. Nature Photon. 6 (11), 737-748 (2012).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Au nanoparticles target cancer. Nano Today. 2 (1), 18-29 (2007).
- Wada, O. Femtosecond all-optical devices for ultrafast communication and signal processing. New J. Phys. 6 (183), Forthcoming.
- Elim, H. I., Yang, J., Lee, J. Y., Mi, J., Ji, W. Observation of saturable and reverse-saturable absorption at longitudinal surface plasmon resonance in gold nanorods. Appl. Phys. Lett. 88 (8), 083107 (2006).
- Ros, I., Schiavuta, P., Bello, V., Mattei, G., Bozio, R. Femtosecond nonlinear absorption of gold nanoshells at surface plasmon resonance. Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (41), 13692-13698 (2010).
- De Boni, L., Wood, E. L., Toro, C., Hernandez, F. E. Optical Saturable Absorption in Gold Nanoparticles. Plasmonics. 3 (4), 171-176 (2008).
- Gurudas, U., et al. Saturable and reverse saturable absorption in silver nanodots at 532 nm using picosecond laser pulses. J. Appl. Phys. 104 (7), 073107 (2008).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and scattering of light by small particles. , John Wiley & Sons Inc. (1983).
- Chu, S. W., et al. Saturation and reverse saturation of scattering in a single plasmonic nanoparticle. ACS Photon. 1 (1), 32-37 (2014).
- Chu, S. W., et al. Measurement of a saturated emission of optical radiation from gold nanoparticles: application to an ultrahigh resolution microscope. Phys. Rev. Lett. 112 (1), 017402 (2014).
- Fujita, K., Kobayashi, M., Kawano, S., Yamanaka, M., Kawata, S. High-resolution confocal microscopy by saturated excitation of fluorescence. Phys. Rev. Lett. 99 (22), 228105 (2007).
- Smith, K. C. A., Oatley, C. W. The scanning electron microscope and its fields of application. Brit. J.Appl. Phys. 6 (11), (1955).
- Yu, J. Y., et al. A diffraction-limited scanning system providing broad spectral range for laser scanning microscopy. Rev. Sci. Instru. 80 (11), 113704 (2009).
- Lee, H., et al. Point spread function analysis with saturable and reverse saturable scattering. Opt. Express. 22 (21), 26016-26022 (2014).
- Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Yonemaru, Y., Yamanaka, M., Smith, N. I., Kawata, S., Fujita, K. Saturated Excitation Microscopy with Optimized Excitation Modulation. ChemPhysChem. 15 (4), 743-749 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Heintzmann, R., Jovin, T. M., Cremer, C. Saturated patterned excitation microscopy - a concept for optical resolution improvement. J. Opt. Soc. Am. A. 19 (8), 1599-1609 (2002).
- Tzang, O., Pevzner, A., Marvel, R. E., Haglund, R. F., Cheshnovsky, O. Super-Resolution in Label-Free Photomodulated Reflectivity. Nano Lett. 15 (2), 1362-1367 (2015).
