Introduction
Lo studio di plasmonica ha suscitato un grande interesse per le sue applicazioni in molti campi diversi 1-4. Uno dei campi più studiati in plasmonica è plasmonica di superficie, in cui l'oscillazione collettiva di elettroni di conduzione coppie con un'onda elettromagnetica esterna ad un'interfaccia tra un metallo e dielettrico. Plasmonica di superficie è stata esplorata per le sue potenziali applicazioni nella subwavelength ottica, biofotonica, e microscopia 5,6. La forte amplificazione di campo nel volume ultra-piccole di nanoparticelle metalliche a causa localizzato risonanza plasmonica superficiale (LSPR) ha attirato grande attenzione, non solo per la sua eccezionale sensibilità dimensioni delle particelle, forme di particelle, e le proprietà dielettriche del mezzo circostante 7 -10, ma anche per la sua capacità di stimolare intrinsecamente deboli effetti ottici non lineari 11. La sensibilità eccezionale di LSPR è prezioso per la bio-sensing e near-fietecniche di imaging ld 12,13. D'altra parte, la maggiore linearità delle strutture plasmoniche può essere utilizzato in circuiti integrati fotonici in applicazioni quali commutazione ottica ed elaborazione del segnale completamente ottica 14,15. E 'noto che l'assorbimento plasmonica è linearmente proporzionale all'intensità di eccitazione a bassi livelli di intensità. Quando l'eccitazione è abbastanza forte, l'assorbimento raggiunge la saturazione. Curiosamente, a intensità più elevate, l'assorbimento aumenta di nuovo. Questi effetti non lineari sono chiamati assorbimento saturabile (SA) 15-17 e inversa assorbimento saturabile (RSA) 18, rispettivamente.
È noto che a causa della LSPR, dispersione è particolarmente forte in strutture plasmoniche. Sulla base di elettromagnetismo fondamentali, la risposta di dispersione rispetto dell'intensità incidente dovrebbe essere lineare. Tuttavia, in nanoparticelle, dispersione e l'assorbimento sono strettamente collegati tramite la teoria di Mie, ed entrambi possono essere eXpressed in termini di parti reale e immaginaria della costante dielettrica. Partendo dal presupposto che un singolo GNS si comporta come un dipolo sotto illuminazione luce, il coefficiente di diffusione (Q sca) e il coefficiente di assorbimento (Q abs) da una singola nanoparticella plasmonico secondo la teoria di Mie possono essere espressi come 19
dove x è 2 πa / λ, a è il raggio della sfera, ed m è 2 m ε / ε d. Qui, ε m ed ε d corrispondono alle costanti dielettriche del metallo e dei dielettrici che circondano rispettivamente. Poiché la forma del coefficiente di dispersione è simile a quello di the coefficiente di assorbimento, si prevede pertanto di osservare dispersione saturabile in una singola nanoparticella plasmonico 20.
Recentemente, lineare dispersione saturabile in una particella plasmonica isolata è stata dimostrata per la prima volta 21. È notevole che in saturazione profonda, l'intensità di scattering infatti leggermente diminuita quando l'intensità di eccitazione aumentata. Ancora più notevole, quando l'intensità di eccitazione continuato ad aumentare dopo che la dispersione si è saturato, l'intensità di scattering risorto, che mostra l'effetto di dispersione saturabile inverso 20. Wavelength- e studi dipendenti dalle dimensioni hanno dimostrato una forte relazione tra LSPR e non lineari dispersione 21. L'intensità e lunghezza d'onda dipendenze scattering plasmonica sono molto simili a quelli di assorbimento, suggerendo un meccanismo comune alla base di tali comportamenti non lineari.
In termini di applicazioni, è ben known che non linearità aiuta a migliorare la risoluzione microscopia ottica. Nel 2007, l'eccitazione saturi è stata proposta (SAX) microscopia, che può aumentare la risoluzione estraendo il segnale saturo tramite una modulazione sinusoidale temporale del fascio di eccitazione 22. Microscopia SAX si basa sul concetto che per un punto focale del laser, l'intensità è maggiore al centro rispetto alla periferia. Se il segnale (sia fluorescenza o scattering) mostra un comportamento di saturazione, la saturazione deve iniziare dal centro, mentre la risposta lineare rimane alla periferia. Pertanto, se vi è un metodo per estrarre solo la parte saturo, lascerà solo la parte centrale respingendo la parte periferica, migliorando così efficacemente la risoluzione spaziale. In linea di principio, non vi è limite di risoluzione non inferiore in microscopia SAX, purché profonda saturazione viene raggiunta e non vi è alcun danno campione a causa della illuminazione intensa.
E 'stato dimostrato che il resolution di imaging di fluorescenza può essere significativamente migliorata utilizzando la tecnica SAX. Tuttavia, la fluorescenza soffre dell'effetto photobleaching. Combinando la scoperta di dispersione non linearità e il concetto di SAX, microscopia a super-risoluzione basata sullo scattering può essere realizzato 21. Rispetto ai tradizionali microscopie super-risoluzione, la tecnica basata scattering fornisce un metodo di contrasto non-imbianchimento romanzo. In questo lavoro, una descrizione passo-passo è dato a definire le procedure necessarie per ottenere ed estrarre la non linearità di dispersione plasmoniche. Vengono descritti metodi di identificazione non linearità di scattering introdotte modificando l'intensità incidente. Maggiori dettagli saranno forniti a svelare come queste non linearità influenzano immagini di singole nanoparticelle e come spaziale risoluzione può essere migliorata di conseguenza con la tecnica SAX.
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Protocol
1. GNS preparazione del campione
- Prima di preparare la, Sonicare 1 ml di soluzione colloidale GNS campione per almeno 15 minuti a circa 40 kHz a prevenire l'aggregazione delle particelle, che può causare il picco LSPR di spostare.
- Goccia 100-200 ml di colloidi GNS su un vetrino con commerciale silicato di alluminio magnesio (MAS) rivestimento per fissare il GNSS.
- Dopo almeno 1 min, rimuovere il colloide extra risciacquo con acqua distillata. Il tempo di attesa dipende dalla densità necessaria distribuzione del GNSS. Tipicamente, 1-3 min si ottiene una densità adatta che permette alle particelle di essere facilmente identificati poiché la maggior parte di essi sono isolati l'uno dall'altro. Aggregazione significativa si può verificare se il tempo di attesa è troppo lungo.
- Essiccare il campione da spurgo con azoto.
- (Facoltativo) Per mappare la GNSS sul vetro con alta risoluzione, eseguire microscopia elettronica a scansione (SEM), in questa fase 23. Un'immagine esempio è fornito in Figure 1, che mostra la densità caratteristica del GNSS. Utilizzare una emissione di campo SEM per acquisire l'immagine. Una volta aggiunto olio sul campione (passo successivo), sarà difficile da rimuovere l'olio e osservare il campione con SEM.
- Aggiungere una goccia di olio con lo stesso indice di rifrazione sul campione per coprire il GNSS e per eliminare il forte riflessione dal substrato di vetro.
- Posizionare un vetro di copertura sulla parte superiore del campione e sigillare con smalto.
- Attendere almeno 5 minuti fino a quando lo smalto si asciuga. Il campione è pronto ora.
2. Allineamento della casa costruita confocale microscopio
- Vedere la Figura 2 per lo schema di installazione. Allineare il bianco percorso illuminazione luce del corpo del microscopio stesso. Accendere la sorgente luminosa alogena del microscopio, e seguire il manuale del produttore del microscopio per ottenere la condizione di illuminazione Köhler. Assicurarsi che i bianchi fasci di luce alogena sono quasi parallele sul retroapertura dell'obiettivo, parzialmente riflesso dal 50/50 beamsplitter, e quindi propaga verso il laser.
- Accendere specchi galvaniche per garantire che rimangano nella posizione iniziale corretta, che è, al centro del campo di scansione.
- Posizionare almeno due bersagli, realizzati da un sottile foglio di carta con anelli concentrici su di esso, lungo il percorso della luce alogena, e allinearli con il fascio alogeno.
- Per eseguire l'imaging, selezionare il laser 532 nm. Per eseguire misure di spettroscopia, selezionare il laser super continuo. Durante l'allineamento, la potenza dei laser deve essere inferiore a 10? W in corrispondenza dell'apertura posteriore dell'obiettivo per evitare linearità. Poi, collimare il fascio laser incidente opposta al fascio alogeno uscente con l'aiuto dei due bersagli. Quando questo processo è completato, l'allineamento grossolano del fascio laser è stato raggiunto.
- Allineare il raggio laser attraverso il centro dell'apertura posteriore della lente obiettivo. In genere, utilizzare un oiObiettivo l-immersione. Aggiungere una goccia di olio tra l'olio-immersion lente dell'obiettivo e il campione GNS. Utilizzare un tubo fotomoltiplicatore (PMT) come rilevatore per raccogliere i segnali di diffusione del GNSS.
- Collocare un foro 20 micron di diametro davanti PMT per bloccare fuori fuoco dispersione segnali. Accendere specchi galvaniche e PMT (tramite software casa costruita), regolare la posizione foro stenopeico e l'altezza della fase del campione di massimizzare i segnali backscattering del GNSS, e quindi osservare un individuo GNS sullo schermo del computer. Un'immagine campione xy del GNSS con corretto allineamento è mostrata nella Figura 2B.
- Leggermente modificare l'altezza della fase del campione per verificare la concentricità del fuoco. Se non è concentrica, la regolazione del fascio con i due specchi di fronte dello scanner fino al centro del GNS rimane nella stessa posizione, mentre l'altezza della fase del campione viene modificato. Assicurarsi che l'immagine xz della PSF è analoga alla figura 2Cper assicurare l'allineamento fascio corretto. Elaborare queste due immagini con passa-basso e filtri lisce gaussiana.
3. Caratterizzazione di Scattering Nonlinearità
- A bassa intensità di eccitazione (meno di 10 4 W / cm 2), acquisire un'immagine di nanoparticelle di oro dal seguente protocollo 2.6.
- Apri l'immagine in ImageJ (o qualsiasi altro software di analisi di immagine). Tracciare una linea attraverso uno dei GNSS nell'immagine (vedere Figura 2B), e utilizzare l'analisi -> Profilo trama degli strumenti di ImageJ per recuperare il profilo di intensità di scattering. Inserire il profilo del PSF scelto da una funzione gaussiana:
dove Y è il valore di lettura PMT, y 0 è il valore di fondo (se presente), A è l'ampiezza di picco, w è la larghezza, x è la coordinata spaziale e x c è il centro coordinate della funzione gaussiana. La FWHM della PSF corrispondente è (½ln2) w. Sulla base della apertura numerica (NA) dell'obiettivo, la FWHM teorico del PSF confocale può essere stimato in circa 0.43l / NA, dove L è la lunghezza d'onda di eccitazione. Confrontare questi due numeri per controllare l'allineamento del sistema di imaging. - Aumentare l'intensità di eccitazione cambiando manualmente il filtro a densità neutra (ND) nella Figura 2A, e registrare le immagini di backscattering ad ogni livello di intensità. Prendere il valore del segnale di dispersione dal centro di ogni GNS a diverse intensità di eccitazione, e tracciare la curva di segnali rispetto intensità di eccitazione dispersione. Controllare la linearità dei primi punti, che dovrebbe esibire una relazione lineare quando l'intensità di eccitazione è sufficientemente bassa. Tracciare una linea sulla base di montaggio lineare dei primi punti. Se le intensità di scattering dei punti successivi scendono sotto questa tendenza lineare, saturation è verificato.
- Dopo aver osservato dispersione saturabile, diminuire gradualmente l'intensità di sotto della soglia di saturazione, e di nuovo la stessa immagine GNSS per assicurare la reversibilità dei comportamenti non lineari.
4. Misura di una Scattering spettro di un oro Nanosphere singolo
- Per misurare lo spettro backscattering da un singolo GNS, utilizzare il laser super-continuo come sorgente laser. La lunghezza d'onda iniziale del laser varia da 450 nm a 1.750 nm. Per rimuovere l'alimentazione infrarossi eccesso che potrebbe causare danni al campione ed i componenti ottici, posizionare uno o due specchi subito dopo il laser super-continuo per riflettere la luce visibile, e utilizzare fascio discariche per raccogliere la luce infrarossa in eccesso.
- Seguire le procedure di allineamento nella Sezione 2 per dirigere il laser super-continuo nel microscopio confocale a scansione laser. Utilizzare una banda larga 50/50 BS al fine di garantire la copertura spettrale tutta la gamma visibile.
- Acquisire unimmagine del GNSS su vetro. Individuare un singolo GNS nell'immagine, e fissare la messa a fuoco della luce a banda larga incidente sulla particella.
- Utilizzare uno specchio capovolgimento di fronte al PMT per dirigere il segnale di backscattering verso lo spettrometro, che è dotato di un dispositivo ad accoppiamento di carica, e poi prendere uno spettro dei singoli GNS selezionati. Fare attenzione che lo spettro qui è una miscela di GNS dispersione e lo sfondo a causa di riflessioni da altre superfici.
- Tornare al rivelatore PMT, e prendere un'altra immagine per confermare che la posizione delle particelle non è cambiata. Quindi, spostare l'attenzione ad un punto in cui è presente nessuna particella. Passare allo spettrometro, e prendere un altro spettro, che rappresenta lo sfondo.
- Sottrarre il spettro di fondo dal punto 4.5 dello spettro dal punto 4.4 per ottenere una chiara gamma backscattering di un singolo GNS.
5. L'allineamento di SAX microscopio
- Vedi Figura 3per lo schema del microscopio SAX, dove una modulazione temporale sinusoidale ideale è ottenuta dalla frequenza di battimento tra due modulatori acusto-ottica (AOMS). Innanzitutto, regolare la dimensione del fascio del laser per soddisfare il requisito dei AOMS successive. Dividere la luce laser 532 nm in due fasci, utilizzando un divisore di fascio 50/50.
- Guida i due raggi attraverso i due AOMS, ad un trave che passa attraverso ogni AOM. Le frequenze di modulazione dei due AOMS devono essere diversi. Ad esempio, si può essere a 40.000 MHz e l'altro a 40.010 MHz, ottenendo una differenza di frequenza di 10 kHz. Questa frequenza differenza sarà la frequenza fondamentale di modulazione f m per i segnali SAX.
- Prendere il primo ordine fasci diffratti da entrambi AOMS, e combinare i due fasci utilizzando un altro splitter 50/50 fascio. Regolare gli specchi dopo che i AOMS per collimare i due fasci.
- Aggiungere un fotorivelatore che è collegato ad un oscilloscopio per monitorare la modulatio temporalen. Dividere una piccola porzione del laser con un vetrino, e inviarlo al fotorivelatore, come mostrato nella figura 3. Con corretta modulazione e fascio sovrapposizione, osservare modulazione dell'intensità sinusoidale alla principale frequenza f m, simile a quella della forma d'onda mostrata in figura 4.
Nota: Lo sfondo della modulazione deve essere il più basso possibile per ottenere la massima profondità di modulazione. Inoltre, utilizzare la funzione di analisi di Fourier dell'oscilloscopio per verificare che la distorsione armonica della modulazione sta diminuendo. Per raggiungere implementazione SAX successo, garantire una perfetta modulazione dell'intensità eccitazione sinusoidale con minimizzato linearità iniziale. - Scollegare l'uscita elettrica del fotorivelatore dall'oscilloscopio e collegare l'ingresso di riferimento di un amplificatore lock-in.
- Come mostrato in figura 3, allineare il raggio laser nel sistema confocale seguendo i protocolli precedenti. Here, collegare l'uscita elettrica del PMT all'amplificatore lock-in come ingresso di segnale.
- Utilizzare un vetro di copertura in bianco come campione, e verificare la linearità del sistema di rivelazione elettrico gradualmente aumentando la potenza di eccitazione ,, come mostrato in figura 5, dove il rivelatore è lineare sotto di un valore di lettura di 1-V. In tutte le misurazioni successive, fare attenzione a frenare la lettura al di sotto di questo valore.
- Impostare l'uscita dell'amplificatore lock-in per esportare la grandezza assoluta del segnale di tensione. Modificando la componente armonica impostazione al canale di riferimento, ottenere le ampiezze dei segnali SAX, A 1, A 2, e così via.
- Esportare i segnali lineari e non lineari dal amplificatore lock-in per una scheda di acquisizione dati, che riceve anche i segnali di tensione guida degli specchi galvaniche scansione raster. Con l'ausilio di un programma personalizzato Labview, sincronizzare i segnali dell'amplificatore lock-in egalvano specchi per formare un'immagine.
- Per ottimizzare il rapporto segnale-rumore nelle immagini, selezionare opportunamente l'acquisizione pixel e tempi di integrazione dell'amplificatore lock-in. Ad esempio, quando la frequenza di modulazione principale f m dell'eccitazione è 10 kHz, cioè quando il periodo è di 100 msec, impostare il tempo di integrazione del blocco amplificatore di essere almeno tre volte più lungo del periodo. Aggiungendo il tempo del movimento specchio galvano, la velocità di acquisizione è impostato a 1.500 pixel al secondo in modalità di imaging SAX.
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Representative Results
La figura 6 mostra lo spettro misurato da un 80 GNS nm. Una curva calcolata sulla base della teoria di Mie è dato nello stesso appezzamento, mostrando ottima accordo. Il picco LSPR è di circa 580 nm. Nel seguente esperimento, la lunghezza d'onda del laser è a 532 nm, che è stato scelto in quanto si trova all'interno della banda plasmonica per migliorare la dispersione ottica con effetto plasmoniche e consentire la dispersione di saturazione 21.
Figura 7 presenta di scattering immagini di una nanoparticella di oro a diverse intensità di eccitazione, e la fila inferiore fornisce la linea di profilo di ogni particella per evidenziare la non linearità. La dimensione dell'immagine è di 600 nm × 600 nm, e la dimensione dei pixel è di 13,8 nm. La velocità di acquisizione è stato 234.000 pixel al secondo nella normale modalità di imaging xy. Ogni immagine è stata media su cinque acquisizioni per migliorare il rapporto segnale-rumore.
Quando l'intensità di eccitazione è inferiore1,5 x 10 6 W / cm 2, la dispersione è linearmente dipendente dall'intensità di eccitazione, così l'immagine risultante di una singola nanoparticella assomiglia alla FPF del fascio di eccitazione, con un profilo gaussiano standard. Tuttavia, quando le intensità di eccitazione aumenta a 1,7 × 10 6 W / cm 2, non solo chiaro appiattimento nella parte superiore della PSF si osserva, ma anche allargamento del FWHM, che indica la saturazione. Molto interessante, in lieve intensità più elevate, l'intensità centrale diventa inferiore al periferico, causando un PSF a forma di ciambella. Poi, come l'intensità di eccitazione continua ad aumentare, l'intensità di diffusione aumenta di nuovo, rivelando saturazione inversa e un conseguente nuovo picco al centro del PSF.
Tracciando le intensità centrali delle PSF a diverse intensità di eccitazione, la dipendenza dell'intensità di scattering viene ottenuta, come mostrato dai punti nella Figura 8. Questa curva clearly rivela le tendenze di saturazione e comportamenti di saturazione inversa. Come previsto, sembra molto simile alla dipendenza dell'intensità del 15-17 assorbimento non lineare. Seguendo il metodo tipico di analizzare assorbimento non lineare, una funzione polinomiale è stato utilizzato per adattare il risultato dispersione non lineare. Tuttavia, diverso dalla maggior parte degli studi di assorbimento non lineari, in cui terzo ordine linearità è sufficiente per modellare i risultati, qui quinto ordine linearità è stato richiesto per adattarsi meglio alla curva di diffusione.
Come indicato nella sezione 5, le componenti di frequenza armoniche possono essere sperimentalmente estratte da un amplificatore lock-in, ed i risultati sono riportati nella Figura 9A. D'altra parte, le componenti armoniche possono essere calcolati dalla Figura 8. In primo luogo, utilizzare una funzione polinomiale, dove I è l'intensità di eccitazione, per adattarsi a figura 8, quindi abbiamo i parametri di montaggio α, β, γ .... Possiamo poi esprimere le intens eccitazionelità in funzione temporalmente modulata I (t) = I 0 (1 + cos (2 πf m t)) / 2, dove t è il tempo, f m è la frequenza di modulazione, e 0 è l'intensità massima di eccitazione. Sostituendo I (t) in S (I), e fare una trasformata di Fourier per convertire la risultante S (I (t)) in dominio della frequenza, abbiamo la seguente equazione composto da più funzioni delta (δ):
Il coefficiente di ciascuna funzione delta (A 0, A 1, A 2, etc.) rappresenta l'ampiezza del segnale SAX alla corrispondente frequenza armonica. Questi coefficienti, che corrispondono ai signa SAXpunti di forza l a differenti armoniche, possono essere scritti come funzioni dei parametri di montaggio alfa, beta, γ ...:
I risultati del calcolo sono mostrati nella Figura 9B. Le trame sperimentali e di calcolo sono d'accordo da vicino, in particolare nei seguenti due aspetti.
In primo luogo, le curve di 2 f m e 3 f m non sono uniformi, mostrando cali in intensità specifici lungo le curve. In entrambe le figure, ci sono tre tuffi nelle curve m 2 f, mentre due tuffi sono visti nelle curve m 3 f. In secondo luogo, le piste sono differenti con diverse intensità di eccitazione. Quando l'intensità di eccitazione non è elevato, le piste di 1 f m, 2 m f, e 3 f m sono 1, 2, e 3, rispettivamente. Tuttavia, dopo ogni tuffo, alle pendici dei corrispondenti curve non lineari diventano più grandi.
Con i tuffi e le variazioni di pendenza, PSF non convenzionali sono previsti se i componenti non lineari vengono estratti mediante la tecnica SAX, quando l'intensità di eccitazione aumenta attraverso i tuffi. La figura 10A mostra i esempi di immagini SAX del 1 f m, 2 f m, e 3 f m componenti di frequenza a diverse intensità di eccitazione. Nella prima riga, l'intensità di eccitazione è 0,7 MW / cm 2, che è sufficiente per indurre i componenti non lineari, ma l'ampiezza è relativamente debole. A questo livello di intensità, la pendenza del segnale di m 2 f è 2, ed è 3 per il segnale m 3 f, come mostrato nella Figura 9A. Se l'intensità di eccitazione raggiunge il livello del primo dip del segnale di m 2 f, le immagini del SAX 2f m segnale diventa forma di ciambella, come mostrato nella seconda riga della Figura 10A. Entrambi i 1 f m e 3 F M immagini rimangono solide, mentre la FWHM del 3 f m PSF è significativamente inferiore a quella del segnale di 1 m f, manifestando notevole miglioramento della risoluzione. Dal profilo di segnale sul pannello più a destra della stessa riga, il FWHM del 2 f anello ciambella m è circa 110 nm. D'altra parte, la terza fila di figura 10A mostra che quando l'intensità di eccitazione aumenta alla prima immersione del segnale di m 3 f, m solo l'immagine 3 f diventa a forma di ciambella, con una larghezza dell'anello 65 nm. A questa intensità, notevole miglioramento della risoluzione si trova quando si confrontano il segnale di m 2 f per il 1 f m uno.
Le figure 10B e 10C mostrano la calcolato PSFS della m segnali, rispettivamente 2 e 3 f m f, ai corrispondenti intensità che provocano le forme ciambella. I calcoli sono stati basati sulla curva polinomiale raccordo in Figura 9B. Le curve calcolate e riproducono le caratteristiche delle PSF sperimentali nei pannelli più a destra in Figura 10A, confermando nuovamente l'idoneità di un quinto ordine polinomiale per la dispersione lineare.
Figura 1. Immagine SEM di GNSS. Eseguendo i processi di preparazione descritti nella prima parte del protocollo, sufficientemente separati GNSS sono osservati. Con più di 100 nm tra GNSS, i loro effetti LSPR non sono accoppiati tra loro. Scala bar:. 100 nm Clicca qui per vedereuna versione più grande di questa figura.
Figura 2. (A) Configurazione di casa costruita confocale microscopio 24. (B) immagine xy con GNSS a fuoco. 2 (c):. Immagine xz di PSF con corretto allineamento Esistono due sorgenti laser per questo sistema. Uno è un nm laser ad onda continua 532, e l'altro è un laser pulsato super-continuo. Quando si misurano i segnali di diffusione, un 532 nm laser ad onda continua è stato utilizzato come fonte e una PMT come il rivelatore (con un filtro di linea laser inserita). Per misurare lo spettro, un laser super-continuo è stato adottato come la sorgente laser e uno spettrometro come rivelatore. Il laser selezionato viene inviato attraverso una serie di filtri a densità neutra per controllare l'intensità di eccitazione. A 50/50 Beamsplitter guida il laser nel microscopio a scansione e consente la metà dei segnali backward-diffusione nelPM T o lo spettrometro, che viene selezionato da uno specchio capovolgimento. Nel sistema di scansione, ci sono due specchi galvaniche che formano scansione raster verticale e orizzontale nel piano focale di un obiettivo. La retrodiffusione viene raccolto per lo stesso obiettivo e convertito in segnali elettrici dai rivelatori. I segnali sono sincronizzati con il sistema di scansione confocale per formare immagini. Il palcoscenico PI è stato utilizzato per acquisire l'immagine XZ spostando il GNSS assialmente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Configurazione di microscopia SAX. La maggior parte dei componenti sono identici a quelli ottenuti da un microscopio confocale (rettangolo rosso), ma modulazione sinusoidale è stato aggiunto al raggio laser di eccitazione. Rettangolo blu mostra modulinstallazione ator. Innanzitutto, il laser di eccitazione è stata divisa in due fasci e inviato separatamente attraverso due AOMS per produrre modulazioni alta frequenza con frequenze leggermente diverse. Poi, i due fasci modulati sono stati combinati per produrre modulazione sinusoidale alla frequenza di battimento tra i due AOMS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Modulazione di travi unite dopo AOMS misurati da un oscilloscopio. Y1 e Y2 indicano i valori di intensità della modulazione massima (52,1 MW) e minimo (1,2 MW), rispettivamente. Y2 deve essere zero per ottenere perfetta modulazione. Frequenza di modulazione corrente era a 10 kHz. Cliccate qui per vedere una grander Versione di questa figura.
Figura 5. Prova della linearità del sistema di rilevamento. Inserendo un vetro di copertura in corrispondenza del piano focale, il riflesso del laser di eccitazione dall'interfaccia vetro / aria è stato utilizzato per verificare la linearità del sistema di rivelazione. L'uscita del segnale rispetto intensità di eccitazione mostra linearità sotto di un valore di lettura di 1-V. Inoltre, il livello di rumore è ben al di sotto 10 -4 V, in modo che il sistema fornisce una gamma dinamica di almeno 10 4. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Spettro Scattering di 80 GNS nm. I puntini rossi indicano sperimmisure ental, e la linea nera rappresenta calcolo dalla teoria di Mie. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. immagini Scattering di GNS da lineare a invertire la saturazione. Riga superiore mostra immagini retrodiffusione, e basse di fila dà profili di nanoparticelle selezionato segnale a varie intensità di eccitazione. Transizione dalla linearità a saturazione di invertire la saturazione è chiaramente osservato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8. intensità Scatteringcontro intensità di eccitazione dai singoli GNS. Punti blu corrispondono a dispersione intensità al centro di FPF a diverse intensità di eccitazione, mostrando risposte molto lineari, tra cui la saturazione e la saturazione inversa. Curva rossa indica la curva in forma sulla base di quinto ordine funzione polinomiale. (Immagini riprodotte dal Rif. 25). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 9. dipendenze intensità dei segnali SAX secondo (A) esperimento e (B) calcolo. (A) segnali SAX sono stati estratti da amplificatore lock-in, e ogni punto di dati sperimentali sono stati mediati su quattro 80 nm GNSS. Le linee tratteggiate indicano pendici di segnali SAX 25. (B) A seguito del protocollo 5, SAX signals sono stati calcolati sulla base di quinto ordine polinomiale in figura 8. (immagini riprodotte dal Rif. 25) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 10. immagini SAX a diverse intensità di eccitazione. (A) Sperimentalmente osservato 1 f m, 2 f m, e 3 F immagini m SAX a diverse intensità di eccitazione. Dimensione dei pixel è di 20 nm, e ogni dimensione dell'immagine è di 750 nm × 750 nm. Profili di intensità di ciambelle a 2 f m e 3 f m sono tracciate in pannelli più a destra. (B) il profilo immagine Calcolato 2 f m immagine pari ad 0,75 MW / cm 2. (C) Calcolato profilo immagine di 3 f </ em> m immagine a 1,1 MW / cm 2. (Immagini riprodotte dal Rif. 25). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nel protocollo, ci sono diversi passaggi critici. In primo luogo, durante la preparazione dei campioni, la densità di nanoparticelle non deve essere troppo elevato, per evitare l'accoppiamento plasmonica tra le particelle. Se due o più particelle sono molto vicini l'uno all'altro, i risultati di accoppiamento in lunghezza d'onda LSPR spostando verso lunghezze d'onda maggiori, riducendo in modo significativo la non linearità. Tuttavia, questa tecnica di imaging mappe realtà la distribuzione dei modi plasmonici, invece delle particelle stesse. Pertanto, si prevede che con un appropriato la lunghezza d'onda di eccitazione, i modi plasmoniche accoppiati possono anche mostrare una forte linearità dispersione e possono essere ripreso con una maggiore risoluzione. In secondo luogo, è molto importante produrre modulazione sinusoidale pura all'interno del fascio di eccitazione, stimolando così l'uso di battimento tra i due AOMS. Dal miglioramento della risoluzione si basa sull'estrazione di parti non lineari (componenti di frequenza armonica) del modulazione del segnale di scattering, se non linearedistorsione è presente nella modulazione di eccitazione, allora estrazione sarà più difficile. Inoltre, nello schema corrente, una configurazione interferometro è usato per produrre la modulazione battitura, quindi l'allineamento delle due travi dell'interferometro è anche critica per ottenere più grande di un indice di modulazione possibile. In terzo luogo, è molto importante assicurare che la non linearità del segnale non deriva dal sistema di rilevamento (che include il rivelatore, amplificatore, convertitore A / D, e il computer I / O). Pertanto, un'attenzione particolare è necessario per garantire che il sistema di rilevamento funziona entro il campo dinamico. La gamma dinamica è definito come la regione della linearità del sistema di rilevamento, cioè, dal livello di rumore di saturazione del rivelatore. Nel presente caso, il segnale di tensione rilevato è lineare sotto 1 V, e il livello di rumore è inferiore a 10 -4 V. Pertanto, il sistema fornisce una gamma dinamica di almeno 10 4. Per assicurarsi che la non linearità del segnale proviene dananoparticelle dell'oro stesso, non dal sistema di rilevamento, è necessario mantenere il valore di lettura all'interno della gamma dinamica. Il quarto fattore critico è la stabilità meccanica del campione. Durante la caratterizzazione non linearità, è essenziale che le nanoparticelle rimangono nello stesso piano focale. Deriva assiale del nanoparticelle o la fase del campione sarebbe gravemente influenzare l'accuratezza della valutazione non linearità. Pertanto, quando si lavora con nanoparticelle, è importante trovare particelle che non facilmente si muovono sotto luce di eccitazione. D'altra parte, è anche possibile lavorare con campioni cresciuti da litografia. In questo caso, la stabilità fase microscopica è il principale fattore limitante. Ci sono fasi con controllo di retroazione di posizione che possono migliorare notevolmente la stabilità. In alternativa, poiché il movimento stadio è in genere molto lento (ad esempio, 1 micron di 10 min), è utile acquisire un xyz 3D pila di immagini, ad esempio 10 immagini con 100 nm assiale separation tra immagini adiacenti, per ogni valore di intensità differente. Poi, durante la fase di analisi, l'immagine luminosa di ciascuna pila deve essere scelto come immagine rappresentativa a quella intensità.
In linea di principio, la risoluzione di tecniche basate saturazione-, che includono SAX e saturo di microscopia strutturato illuminazione (SSIM) 26, presenta nessun limite minimo fino a quando non linearità di ordine superiore (componenti di frequenza armoniche superiori) può essere raggiunto. Tuttavia, in pratica, la risoluzione è limitata dal rapporto segnale-rumore (SNR), soprattutto quando si estraggono ordine superiore demodulazione componenti armoniche. Ci sono alcune strategie che possono migliorare il SNR. Ad esempio, è stato dimostrato che la frequenza di modulazione influenza fortemente il SNR 27. È anche possibile aumentare il SNR calcolando la differenza di intensità tra i segnali non saturi e saturi per estrarre solo il segnale saturo (manoscritto in preparazione).
28-30, oper saturazione di emissione di fluorescenza 22,26,31. Tuttavia, fluorescenza presenta un problema intrinseco di fotometabolismo, specialmente sotto forte illuminazione luce. Questo studio ha dimostrato che la dispersione saturabile di GNSS è un metodo promettente di super-risoluzione microscopia poiché non vi è alcun problema sbiancamento 21. Rispetto ai precedenti studi di microscopia a fluorescenza utilizzando SAX, il miglioramento della risoluzione con dispersione saturabile era molto più alto in questa inchiesta, probabilmente a causa della non linearità di ordine superiore 22. Inoltre, a parte la microscopia SAX, c'è un'altra tecnica super-risoluzione basata sulla saturazione: SSIM 26. SSIM sfrutta la modulazione spaziale delle frange per estrarre i segnali non lineari, mentre la microscopia SAX utilizza la modulazione temporale. Con la proprietà saturazione di questo dispersione non sbianca, si prevede quindi che questa scoperta può essere combinato con SSIM per migliorare la risoluzione spaziale sotto grande campo malatoumination.
In future applicazioni, questa tecnica SAX plasmonica sarà utile non solo per risolvere distribuzioni risonanza modalità e dinamiche nei circuiti plasmonic, ma anche per migliorare la risoluzione delle immagini tessuto biologico. Simili miglioramento della risoluzione è stata dimostrata con altri materiali plasmonic come argento (non pubblicato), così come i materiali non plasmoniche, come il silicio 32. Nel campo dell'imaging super-risoluzione, microscopia SAX ha vantaggi sotto diversi aspetti. Rispetto alla microscopia ottica stocastica ricostruzione (STORM) e foto-attivati microscopia localizzazione (PALM), microscopia SAX ha una velocità di scansione più veloce di pochi secondi per immagine. Rispetto alla deplezione emissione stimolata (STED) microscopia, un solo laser è necessaria per microscopia SAX, riducendo in modo significativo la complessità ottica. Rispetto SSIM, la risoluzione del SAX viene contemporaneamente migliorata in entrambe le direzioni assiali e laterali. Inoltreraggiungere una profondità di imaging sufficiente dispersione casuale lungo il percorso del fascio di eccitazione o di raccolta è critica. Per le tecniche a livello di campo come STORM, PALM, e SSIM, le immagini vengono catturate con una macchina fotografica, che è altamente sensibile alla dispersione casuale di fotoni fluorescenza emessa nei tessuti. Per le tecniche point-scansione come STED e SAX, i segnali di fluorescenza vengono raccolti da un rivelatore punto, quindi sono più robusti contro dispersione tessuto. Tuttavia, STED richiede una piastra di fase per creare un profilo del fascio ciambella al fuoco, e le informazioni di fase può essere deteriorata durante la propagazione del fascio nei tessuti. Pertanto, la microscopia SAX dovrebbe essere la migliore tra queste modalità di tessuto profondo super-risoluzione delle immagini.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope body | Olympus, Japan | BX-51 | |
| objective lens | Olympus, Japan | UPlanSapo, 100X, NA 1.4 | |
| 80-nm gold colloid | BBI Solutions, UK | EM.GC80 | |
| supercontinuum laser | Fianium, United Kingdom | SC400-2-PP | |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, USA | BB1-E02 | |
| field emission SEM | JEOL, Japan | JSM-6330F | optional |
| spectrometer | Andor Technology, UK | Shamrock 163 | |
| charge-coupled device | Andor Technology, UK | iDus DV420A-OE | |
| acousto-optic modulators | IntraAction Corp., USA | AOM-402AF1 | |
| lock-in amplifier | Stanford Research Systems, USA | SR-830 | |
| MAS-coated slide glass | Matsunami Glass, Japan, | S9215 |
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