Introduction
De studie van plasmonics trok veel belangstelling vanwege de toepassingen in vele verschillende gebieden 1-4. Een van de meest onderzochte velden plasmonics een oppervlaktebehandeling plasmonics, waarbij de collectieve oscillatie van geleidingselektronen paren met een externe electromagnetische golf bij een grensvlak tussen een metaal en diëlektricum. Oppervlak Plasmonics is onderzocht voor zijn potentiële toepassingen in subwavelength optica, biofotonica en microscopie 5,6. De sterke veldversterking in de ultra-kleine hoeveelheid metallische nanodeeltjes als gevolg van lokale surface plasmon resonance (LSPR) trok veel aandacht, niet alleen vanwege de uitzonderlijke gevoeligheid voor deeltjesgrootten, deeltjesvormen en de diëlektrische eigenschappen van het omringende medium 7 -10, maar ook vanwege zijn vermogen om inherent zwak niet-lineaire optische effecten 11 te verhogen. De uitzonderlijke gevoeligheid van LSPR is waardevol voor bio-sensing en bijna-field beeldvormende technieken 12,13. Aan de andere kant kan de verbeterde lineariteit van plasmon structuren worden gebruikt in fotonische geïntegreerde schakelingen in toepassingen zoals optische switching en volledig optische signaalverwerking 14,15. Het is bekend dat de plasmon absorptie lineair evenredig aan de excitatie-intensiteit bij lage intensiteit. Wanneer de excitatie sterk genoeg is, de absorptie bereikt verzadiging. Intrigerend, bij hogere intensiteit, de absorptie verhoogt opnieuw. Deze niet-lineaire effecten zijn verzadigbaar absorptie (SA) 15-17 genoemd en achteruit verzadigbaar absorptie (RSA) 18, respectievelijk.
Het is bekend dat als gevolg van de LSPR, verstrooiing is bijzonder sterk in plasmonische structuren. Op basis van fundamentele elektromagnetisme, moet de respons van verstrooiing versus incident intensiteit lineair zijn. Echter, in nanodeeltjes, verstrooiing en absorptie zijn nauw met elkaar verbonden via de Mie theorie, en beide kunnen worden expressed in termen van reële en imaginaire delen van de diëlektrische constante. In de veronderstelling dat een enkele GNS zich gedraagt als een dipool onder licht verlichting, kan de verstrooiing coëfficiënt (Q SCA) en absorptie coëfficiënt (Q abs) uit één plasmonische nanodeeltje volgens de Mie theorie worden uitgedrukt als 19
waarin x 2 πa / λ, a de straal van de bol en m 2 is ε m / ε d. Hier, ε m en ε d overeen met de diëlektrische constanten van het metaal en de omringende diëlektrische resp. Aangezien de vorm van de verstrooiingscoëfficiënt is vergelijkbaar met die van the absorptiecoëfficiënt, wordt daarom verwacht dat verzadigbaar verstrooiing observeren in één plasmonische nanodeeltje 20.
Onlangs lineaire verzadigbare verstrooiing in een geïsoleerde plasmonische deeltjes werd aangetoond voor het eerst 21. Het is opmerkelijk dat in diepe verzadiging, de verstrooiingsintensiteit in feite daalde licht wanneer de excitatie-intensiteit verhoogd. Nog meer opvallend wanneer de excitatie-intensiteit een intensievere na verstrooiing verzadigd raakte, de verstrooiingsintensiteit opgestaan, die het effect van omgekeerde verzadigbaar 20 verstrooiing. Wavelength- en grootte-afhankelijke studies hebben aangetoond een sterke relatie tussen LSPR en niet-lineaire verstrooiing 21. De intensiteit en de golflengte afhankelijkheid van plasmon verstrooiing is vergelijkbaar met de absorptie, suggereert een gemeenschappelijk mechanisme achter deze niet-lineair gedrag.
In termen van toepassingen, is het goed known lineariteit die helpt optische microscopie resolutie te verbeteren. In 2007, verzadigd excitatie (SAX) microscopie werd voorgesteld, die resolutie kan verbeteren door het extraheren van de verzadigde signaal via een tijdelijke sinusvormige modulatie van de excitatiebundel 22. SAX microscopie is gebaseerd op het concept dat een laser brandpunt, de intensiteit sterker in het midden dan aan de rand. Als het signaal (ofwel fluorescentie of verstrooiing) vertoont saturatiegedrag, moet de verzadiging starten van het centrum, terwijl de lineaire respons blijft aan de periferie. Daarom, als er een methode om alleen het gedeelte verzadigde extract, het zal alleen laat het middengedeelte en de verwerping het randdeel, dus effectief verbeteren van de ruimtelijke resolutie. In principe is er geen lagere resolutie limiet in SAX microscopie, mits diepe verzadiging bereikt is en er geen monster schade als gevolg van de intense verlichting.
Aangetoond is dat de resolution fluorescentiebeeldvorming kan aanzienlijk worden verbeterd door gebruikmaking van de SAX techniek. Echter, lijdt de fluorescentie fotobleken effect. Het combineren van de ontdekking van verstrooiing lineariteit en het concept van SAX, kan superresolutietechnieken basis van verstrooiing worden gerealiseerd 21. Vergeleken met conventionele superresolutie microscopie, de verstrooiing gebaseerde techniek verschaft een nieuwe niet-blekende contrast methode. In dit artikel wordt een stap-voor-stap beschrijving gegeven om de vereiste te verkrijgen en halen de niet-lineariteit van plasmonische verstrooiing procedures te schetsen. Werkwijzen voor het identificeren verstrooiing lineariteiten geïntroduceerd door het veranderen van de invallende intensiteit beschreven. Meer informatie zal worden verstrekt om te ontrafelen hoe deze lineariteiten invloed beelden van enkele nanodeeltjes en hoe ruimtelijke resolutie kan dienovereenkomstig door de SAX techniek worden verbeterd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. GNS Monstervoorbereiding
- Voor de monsterbereiding, ultrasone trillingen 1 ml GNS colloïdale oplossing ten minste 15 minuten bij ongeveer 40 kHz tot deeltjesaggregatie, wat kan leiden tot de LSPR piek verschuiven voorkomen.
- Drop 100-200 ul van GNS colloïden op een dia glas met commerciële magnesiumaluminiumsilicaat (MAS) coating aan het GNSS te lossen.
- Na ten minste 1 min, verwijder de extra colloïde door te spoelen met gedestilleerd water. De wachttijd is afhankelijk van de gewenste dichtheidsverdeling van het GNSS. Gewoonlijk 1-3 min leidt tot een geschikte dichtheid waarmee de deeltjes gemakkelijk worden geïdentificeerd aangezien de meeste van hen zijn geïsoleerd van elkaar. Significante aggregatie kan optreden als de wachttijd te lang.
- Droog het monster door spoelen met stikstofgas.
- (Optioneel) Als u het GNSS-kaart op het glas met een hoge resolutie, voert scanning elektronenmicroscoop (SEM) in dit stadium 23. Een beeld voorbeeld is in Figure 1, met het kenmerk dichtheid van GNSS. Gebruik een veldemissie SEM om het beeld te verwerven. Zodra olie wordt toegevoegd aan het monster (volgende stap), wordt het moeilijk om de olie te verwijderen en bekijk het monster met SEM.
- Een druppeltje olie met dezelfde brekingsindex op het monster op de GNSS dekken en de sterke reflectie van het glassubstraat te elimineren.
- Leg een deksel glas op de top van het monster en verzegelt het met nagellak.
- Wacht ten minste 5 minuten, totdat de nagellak droogt. Het monster is nu klaar.
2. Afstemming van huis-gebouwd confocale microscoop
- Zie figuur 2 voor de regeling van de setup. Lijn het witte licht verlichting pad van de microscoop lichaam zelf. Schakel de halogeen lichtbron van de microscoop, en volg de handleiding van de fabrikant van de microscoop om de Köhlerverlichting conditie te bereiken. Zorg ervoor dat het witte halogeenlicht balken zijn bijna parallel aan de achterkant vanapertuur van het objectief, gedeeltelijk gereflecteerd door de 50/50 bundelsplitser en vervolgens propageren in de richting van de laser.
- Zet de galvano spiegel zodat ze blijven op de juiste uitgangspositie, dat wil zeggen in het midden van het scanbereik.
- Plaats ten minste twee doelen, gemaakt door een dun vel papier met concentrische ringen op het, langs de halogeenlicht pad, en lijn ze met de halogeen balk.
- Om beeldvorming te voeren, selecteert u de 532 nm laser. Om spectroscopie metingen uit te voeren, selecteert u de super-continuüm laser. Tijdens de uitlijning moet de kracht van de lasers minder dan 10 uW achter opening van de doelstelling lineariteit voorkomen. Vervolgens collimeren de invallende laserbundel tegenover de uitgaande halogeen licht met behulp van de twee doelen. Wanneer dit proces voltooid is, is de grove uitlijning van de laserbundel bereikt.
- Lijn de laserbundel door het midden van de achterkant apertuur van de objectieflens. Typisch, gebruik een oil-immersie objectief. Een druppeltje olie tussen de olie-immersie objectieflens en GNS monster. Gebruik een fotomultiplicatorbuis (PMT) als detector voor de verstrooiing signalen van de GNSS verzamelen.
- Plaats een pinhole 20 pm diameter voor de PMT te blokkeren onscherpe verstrooiing signalen. Schakel de galvano spiegels en PMT (via zelfgebouwde software), stel de pinhole positie en hoogte van het monster podium om de backscattering signalen van de GNSS te maximaliseren, en dan nemen een individuele GNS op een computerscherm. Een monster xy beeld van de GNSS correcte uitlijning wordt getoond in figuur 2B.
- Iets veranderen de hoogte van het monster podium om de concentriciteit van de focus te controleren. Als het niet concentrisch, past de bundel met de twee spiegels voor de scanner tot het midden van de GNS blijft op dezelfde positie, terwijl de hoogte van de monstertafel veranderd. Zorg ervoor dat de XZ beeld van de PSF is gelijk aan figuur 2Com de juiste koplampen zorgen. Verwerk deze twee beelden met low-pass en Gauss gladde filters.
3. Karakterisering van Scattering Non-lineariteit
- Bij lage excitatie-intensiteit (minder dan 10 4 W / cm 2) verkrijgen van een beeld van goud nanodeeltjes met volgende protocol 2,6.
- Open de afbeelding in ImageJ (of andere beeldanalyse software). Trek een lijn over een van de GNSS in het beeld (zie figuur 2B), en het gebruik van Analysis -> Plot profiel van de ImageJ tools om de verstrooiing intensiteit profiel te halen. Aan het profiel van de gekozen PSF door een Gauss-functie:
waarbij y de PMT uitleeswaarde, y 0 is de achtergrondwaarde (indien aanwezig), A is de piekamplitude, w is de breedte x de ruimtelijke coördinaat en x c is het centrum coördinaattransformatiese van de Gauss-functie. De FWHM van de overeenkomstige PSF is (½ln2) w. Op basis van de numerieke apertuur (NA) van het objectief, kan de theoretische FWHM van de confocale PSF worden geschat op ongeveer 0.43l / NA, waarbij L de excitatiegolflengte. Vergelijk deze twee getallen om de uitlijning van het beeldvormingssysteem controleren. - Verhoging van de excitatie-intensiteit door de neutrale dichtheid (ND) filter handmatig veranderen in figuur 2A, en noteer de backscattering beelden bij elke intensiteit. Neem de waarde van het signaal verstrooiing van het centrum van elk GNS bij verschillende excitatie-intensiteit en plot de curve van verstrooiing signalen versus excitatie intensiteiten. Controleer de lineariteit van de eerste punten, waarbij een lineaire relatie moet vertonen als de excitatie-intensiteit is voldoende laag. Trek een lijn op basis van lineaire montage van de eerste paar punten. Als de verstrooiing intensiteiten van de volgende punten vallen onder deze lineaire trend, saturation opgetreden.
- Na het observeren verzadigbaar verstrooiing, geleidelijk af van de intensiteit onder de verzadiging drempel, en het beeld hetzelfde GNSS opnieuw om de omkeerbaarheid van de niet-lineaire gedrag zorgen.
4. Meting van een Verstrooiing Spectrum van een Single Gold Nanosphere
- Om de backscattering spectrum van een enkele GNS te meten, gebruik maken van de super-continuüm laser als de laserbron. De eerste golflengte van de laser varieert van 450 nm tot 1750 nm. Om de overtollige infrarood kracht die schade aan het monster en de optische componenten kunnen veroorzaken te verwijderen, plaatst u één of twee spiegels direct na de super-continuüm laser om het zichtbare licht te reflecteren, en gebruik beam dumpt om de overtollige infrarood licht te verzamelen.
- Volg de uitlijning procedures in artikel 2 aan direct de super-continuüm laser in de laser scanning confocale microscoop. Gebruik een breedband 50/50 BS spectrale dekking te garanderen over het hele zichtbare bereik.
- Verwervenbeeld van de GNSS op glas. Zoek een GNS in het beeld, en bevestig de focus van het invallende licht breedband op het deeltje.
- Gebruik een flipping spiegel voor de PMT naar de backscattering signaal naar de spectrometer, die is uitgerust met een ladingsgekoppelde inrichting leiden, en vervolgens een spectrum van een enkel geselecteerd GNS. Zorg ervoor dat het spectrum hier is een mengsel van GNS verstrooiing en de achtergrond als gevolg van reflecties van andere oppervlakken.
- Ga terug naar de PMT-detector, en neem een ander beeld te bevestigen dat het deeltje positie is niet veranderd. Vervolgens verschuift de focus naar een punt waarop er geen deeltje aanwezig is. Ga terug naar de spectrometer, en neem nog een spectrum, dat de achtergrond vormt.
- Trek de achtergrond spectrum uit stap 4.5 uit het spectrum van stap 4.4 om een duidelijk terugstrooiing spectrum van één GNS verkrijgen.
5. Aanpassing van SAX Microscope
- Zie figuur 3voor de regeling van de SAX microscoop, waarbij een ideale sinusvormige tijdelijke modulatie wordt verkregen uit de beat frequentie tussen twee akoestisch-optische modulators (AOM's). Stel eerst de bundelgrootte van de laser aan de eis van de volgende AOM's voldoen. Splitsing van de 532 nm laserlicht in twee bundels met behulp van een 50/50 bundelsplitser.
- Leid de twee bundels door de twee AOM's, met een straal die door elke AOM. De modulerende frequenties van de twee AOM's moeten verschillend zijn. Zo kan men ten 40,000 MHz en een aan 40,010 MHz, waarbij een verschilfrequentie van 10 kHz. Dit verschil frequentie zal de fundamentele modulatiefrekwentie f m voor de SAX signalen.
- Neem de eerste-orde gebogen bundels van zowel AOM's, en combineren de twee bundels met een andere 50/50 bundelsplitser. Stel de spiegels na de AOM's om de twee bundels collimeren.
- Voeg een fotodetector die is aangesloten op een oscilloscoop aanwezig om de waterijsje bewakenn. Split een klein deel van de laser met een objectglaasje, en het naar de fotodetector, zie figuur 3. Bij correcte modulatie en beam overlapping in acht sinusvormige intensiteitsmodulatie in het belangrijkste frequentie fm, vergelijkbaar met die van de getoonde golfvorm in figuur 4.
Opmerking: De achtergrond van de modulatie moet zo laag mogelijk zijn om het maximum modulatiediepte bereiken. Daarnaast gebruiken de Fourier-analyse functie van de oscilloscoop om te controleren dat de harmonische vervorming van de modulatie afneemt. Om succesvol SAX uitvoering te komen, zorgen voor een perfecte sinusvormige excitatie intensiteitsmodulatie met minimale initiële niet-lineariteit. - Maak de elektrische output van de fotodetector van de oscilloscoop en verbinden met de referentie-ingang van een lock-in versterker.
- Zoals getoond in figuur 3, sluiten de laserstraal in de confocale systeem na de eerdere protocollen. Here, sluit de elektrische uitgang van de PMT aan de lock-in versterker als het ingangssignaal.
- Gebruik een lege dekglas als voorbeeld en controleer de lineariteit van het elektrisch detectiesysteem door geleidelijk verhogen van de excitatievermogen ,, zoals weergegeven in figuur 5, waarbij de detector onder een lineaire uitlezing waarde van 1-V. In alle volgende metingen, zorgen de uitlezing beperken tot onder deze waarde.
- Stel de uitgang van de lock-in versterker de absolute grootte van het spanningssignaal exporteren. Door de harmonische component instelling op het referentiekanaal, krijgen de amplitudes van de signalen SAX, A 1, A 2, enzovoort.
- De lineaire en niet-lineaire signalen van de lock-in versterker exporteren naar een data acquisitie kaart, die tevens de stuurspanning signalen van het raster scan galvano spiegels. Met behulp van een op maat Labview programma synchronisatie signalen van de lock-in versterker en degalvano spiegels om een beeld te vormen.
- Om de signaal-ruisverhouding in het beeld te optimaliseren, selecteert passende de pixel acquisitie en integratietijden van de lock-in versterker. Bijvoorbeeld, als de belangrijkste modulatie frequentie fm van de excitatie is 10 kHz, dat wil zeggen wanneer de periode 100 psec, stel de integratietijd van de lock-in versterker ten minste driemaal langer is dan de periode. De tijd van de galvano spiegel beweging voegen, wordt de opnamesnelheid ingesteld op 1500 pixels per seconde in de SAX afbeeldingsmode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 6 toont het gemeten spectrum van een 80 nm GNS. Een berekende curve op basis van de Mie theorie wordt gegeven in dezelfde plot, toont uitstekende overeenkomst. De LSPR piek ligt rond de 580 nm. In het volgende experiment, de laser golflengte was 532 nm, die werd gekozen omdat het zich in het plasmonische band optische verstrooiing met plasmon effect te versterken en mogelijk verstrooiing verzadiging 21.
Figuur 7 presenteert verstrooiing beelden van een gouden nanodeeltjes bij verschillende excitatie-intensiteit, en de onderste rij geeft de regel profiel van elk deeltje de lineariteit te markeren. Het beeldformaat is 600 nm × 600 nm, en de pixelgrootte is 13,8 nm. De overname snelheid was 234.000 pixels per seconde in de normale xy imaging-modus. Elk beeld werd gemiddeld over vijf overnames om de signaal-ruisverhouding te verbeteren.
Als de excitatie-intensiteit is hoger dan1,5 x 10 6 W / cm2, de verstrooiing lineair afhankelijk van de excitatie-intensiteit, zodat het resulterende beeld van een nanodeeltje lijkt op de PSF van de excitatiebundel met een standaard Gaussisch profiel. Echter, wanneer de excitatie-intensiteit toeneemt tot 1,7 x 10 6 W / cm2, niet alleen duidelijke afvlakking bovenaan de PSF wordt waargenomen, maar ook verbreding van de FWHM, met vermelding van verzadiging. Zeer interessant bij iets hogere intensiteiten, de centrale intensiteit lager dan de rand, wat resulteert in een donut-vormige PSF. Dan, als de excitatie-intensiteit blijft toenemen, de verstrooiingsintensiteit weer verhoogd, onthullen omgekeerde verzadiging en resulteert in een nieuwe piek in het midden van de PSF.
Door het uitzetten van de centrale intensiteit van de PSF's bij verschillende excitatie-intensiteit is de verstrooiingsintensiteit afhankelijkheid verkregen, zoals getoond door de stippen in figuur 8. Deze curve clearly onthult de trends van verzadiging en omgekeerde verzadiging gedrag. Zoals verwacht, lijkt sterk op de intensiteit afhankelijkheid van lineaire absorptie 15-17. Na de typische werkwijze voor het analyseren lineaire absorptie werd een polynomiale functie gebruikt om de lineaire verstrooiing resultaat past. Echter, anders dan de meeste niet-lineaire absorptie studies, waarbij derde-orde niet-lineariteit is voldoende om het model van de resultaten, hier vijfde-orde niet-lineariteit is nodig om beter te passen bij de verstrooiing curve.
Zoals vermeld in paragraaf 5, kan de harmonische frequentiecomponenten experimenteel worden onttrokken door een lock-in versterker, en de resultaten zijn weergegeven in figuur 9A. Anderzijds kunnen de harmonische componenten berekend uit figuur 8. Gebruik eerst een polynomiale functie, waarbij I excitatie-intensiteit, figuur 8 past, zodat we de fitting parameters α, β, γ .... Wij kunnen dan drukken de excitatie intensity als temporeel gemoduleerde functie I (t) = 0 I (1 + cos (2 πf m t)) / 2, waarbij t de tijd, fm is de modulatiefrequentie en ik 0 is de maximale excitatie-intensiteit. Invullen I (t) in de S (I), en een Fourier-transformatie van de daaruit voortvloeiende S (I (t)) in frequentiedomein zetten, hebben we de volgende vergelijking uit meerdere deltafuncties (δ):
De coëfficiënt van elke delta functie (A 0, A 1, A 2, etc.) de amplitude van het signaal bij de SAX overeenkomstige harmonische frequentie. Deze coëfficiënten die overeenkomen met de SAX Signal krachten op verschillende harmonischen, kan worden geschreven als functies van de fitting parameters α, β, γ ...:
De berekeningsresultaten worden weergegeven in figuur 9B. De experimentele en berekening plots eens laten, zeker in de volgende twee aspecten.
Ten eerste, de krommen van 2 fm en 3 fm niet glad, met dips op specifieke intensiteiten langs de bochten. In beide figuren zijn er drie kuilen in de 2 fm krommen, terwijl twee dips worden gezien in de 3 fm curves. Ten tweede, de hellingen zijn verschillende met verschillende excitatie intensiteiten. Als de excitatie-intensiteit niet hoog, de hellingen van 1 f m, 2 fm en 3 f m zijn 1, 2 en 3, respectievelijk. Echter, na elke onderdompeling, de hellingen van de overeenkomstige lineaire curves groter worden.
Met de dips en helling variaties, zijn onconventionele PSF verwacht als de niet-lineaire componenten via de SAX techniek, wanneer de excitatie-intensiteit toeneemt over de dips worden gewonnen. Figuur 10A toont het beeld SAX voorbeelden van de 1 f m, 2 fm, en 3 f m frequentie componenten op verschillende excitatie intensiteiten. In de eerste rij, de excitatie-intensiteit 0,7 MW / cm 2, wat voldoende is om de niet-lineaire componenten induceren, maar de amplitude is relatief zwak. Op deze intensiteit, de helling van de 2 fm signaal 2 en 3 is de 3 fm-signaal, zoals weergegeven in figuur 9A. Als de excitatie-intensiteit toe tot het niveau van de eerste helling van de 2 fm-signaal, de SAX afbeeldingen van 2fm signaal worden donutvormige, zoals in de tweede rij in figuur 10A. Zowel de 1 en 3 fm fm beelden blijven vast, terwijl de FWHM van de 3 fm PSF aanzienlijk kleiner dan die van de 1 fm signaal, het vertonen opmerkelijke resolutieverbetering. Uit het signaalprofiel het rechterpaneel van dezelfde rij, de FWHM van de 2 fm donut ring ongeveer 110 nm. Anderzijds, de derde rij van Figuur 10A laat zien dat wanneer de excitatie-intensiteit toe tot de eerste helling van de 3 fm signaal verschijnt alleen de 3 fm wordt donutvormige, met een 65 nm ringbreedte. Op deze intensiteit, wordt opmerkelijke verbetering resolutie gevonden bij het vergelijken van de 2 fm signaal naar de 1 f m één.
Figuren 10B en 10C tonen de berekende PSFs van de 2 fm en 3 fm signalen op respectievelijk de overeenkomstige intensiteiten die resulteren in de donut vormen. De berekeningen waren gebaseerd op de polynomiale curve fitting in figuur 9B. De berekende curven goed reproduceren van de kenmerken van de experimentele PSF in de meest rechtse panelen in figuur 10A, opnieuw bevestiging van de geschiktheid van een 5-orde polynoom fit voor de niet-lineaire verstrooiing.
Figuur 1. SEM beeld van GNSS. Door het uitvoeren van de bereidingsprocessen in het eerste deel van het protocol beschreven, voldoende gescheiden GNSS waargenomen. Met meer dan 100 nm tussen GNSS, hun LSPR die niet aan elkaar gekoppeld. Schaal bar:. 100 nm Klik hier om te bekijkeneen grotere versie van deze figuur.
Figuur 2. (A) Instellen van zelfgebouwde confocale microscoop 24. (B) xy afbeelding met GNSS op focus. 2 (c):. Xz beeld van PSV met de juiste afstemming Er zijn twee laserbronnen voor dit systeem. Eén is een 532 nm continu werkende laser en de andere is een gepulste laser super-continuüm. Bij het meten van de verstrooiing signalen, werd een 532 nm continu werkende laser als bron en een PMT als detector (een laserlijn filter geplaatst). Om het spectrum te meten, werd een super-continuüm laser aangenomen als de laserbron en een spectrometer als detector. De geselecteerde laser wordt gestuurd door een reeks van neutrale dichtheid filters om de excitatie-intensiteit te controleren. Een 50/50 beamsplitter begeleidt de laser in de scanning microscoop en maakt de helft van de backward-verstrooiing signalen in dePM T of spectrometer, die wordt geselecteerd door een flipping spiegel. In het aftastsysteem, zijn er twee galvano spiegels die verticale en horizontale raster scanning in het brandvlak van een doel vormen. De achterwaartse verstrooiing wordt verzameld door hetzelfde objectief en omgezet in elektrische signalen door de detectoren. De signalen worden gesynchroniseerd met de confocale scanning systeem afbeeldingen te vormen. De PI podium werd gebruikt om de afbeelding van de XZ verwerven door het bewegen van de GNSS-axiaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Instelling van SAX microscopie. De meeste onderdelen zijn dezelfde als worden verkregen met een confocale microscoop (rode rechthoek), maar sinusvormige modulatie werd toegevoegd aan de excitatie laserbundel. Blauwe rechthoek toont moduleator setup. Eerst werd de excitatielaser verdeeld in twee bundels en afzonderlijk verzonden via twee AOM's hoogfrequente modulaties te produceren met enigszins verschillende frequenties. Daarna werden de twee gemoduleerde bundels gecombineerd om sinusvormige modulatie op de beat frequentie tussen de twee AOM's te produceren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Modulatie Gecombineerd bundels na AOM's gemeten met oscilloscoop. Y1 en Y2 duiden maximum (52,1 mW) en minimum (1,2 mW) waarden van de modulatie-intensiteit resp. Y2 moet nul perfecte modulatie bereiken. Huidige modulatiefrequentie was 10 kHz. Klik hier om een groot bekijkenr versie van deze figuur.
Figuur 5. Lineariteit test detectiesysteem. Door een dekglas in het brandvlak, de reflectie van de excitatie laser van het glas / lucht-interface werd gebruikt om de lineariteit van het detectiesysteem controleren. Het uitgangssignaal versus excitatie-intensiteit toont lineariteit onder een uitlezing waarde van 1-V. Bovendien is het geluidsniveau ruim onder 10 -4 V, zodat het systeem biedt een dynamisch bereik van ten minste 10 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Verstrooiing spectrum van 80 nm GNS. Rode stippen geven experimental metingen en zwarte lijn geeft de berekening van Mie theorie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Verstrooiing beelden van GNS van lineaire verzadiging te keren. Bovenste rij toont backscattering afbeeldingen en onderste rij geeft signaal profielen van geselecteerde nanodeeltjes bij verschillende excitatie intensiteit. Overgang van lineariteit tot verzadiging te keren verzadiging wordt duidelijk waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8. Scattering intensiteitversus excitatie-intensiteit van enkele GNS. Blauwe stippen corresponderen met verstrooiing intensiteiten in het midden van PSV bij verschillende excitatie intensiteiten, waaruit blijkt zeer lineaire respons, met inbegrip van verzadiging en omgekeerde verzadiging. Rode curve geeft fit curve gebaseerd op de vijfde-orde polynomiale functie. (Foto overgenomen uit Ref. 25). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9. Intensiteit bijgebouwen van SAX signalen volgens (A) experiment en (B) berekening. (A) SAX signalen werden gewonnen door de lock-in versterker en elke experimentele data punt werd gemiddeld over vier 80 nm GNSS. Gestippelde lijnen geven hellingen van SAX signalen 25. (B) Na protocol 5, SAX signals werden berekend op basis van de vijfde-orde polynoom fit in figuur 8. (Foto overgenomen uit Ref. 25) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10. SAX beelden op verschillende excitatie intensiteiten. (A) experimenteel waargenomen 1 f m, 2 fm, en 3 f m SAX beelden op verschillende excitatie intensiteiten. Pixelgrootte is 20 nm, en elk beeldformaat is 750 nm × 750 nm. Intensiteit profielen van donuts op f 2 m en 3 fm zijn (C) Berekend beeld Het profiel van 3 f <uitgezet in rechtse panelen. (B) Berekend image profile image 2 f m op 0,75 MW / cm2./ em> m afbeelding op 1,1 MW / cm2. (Foto overgenomen uit Ref. 25). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het protocol zijn er verschillende kritische stappen. Ten eerste, de voorbereiding van de monsters, de dichtheid van nanodeeltjes moet niet te hoog zijn, plasmon koppeling tussen deeltjes te voorkomen. Als twee of meer deeltjes zeer dicht bij elkaar, de koppeling resulteert in de LSPR golflengteverschuivende richting van langere golflengten, waardoor de lineariteit aanzienlijk verminderen. Echter, deze beeldvormende techniek daadwerkelijk brengt de verdeling van plasmonische wijzen, in plaats van de deeltjes zelf. Daarom wordt verwacht dat bij een geschikte golflengte, kan de gekoppelde plasmonische modes tonen ook een sterke verstrooiing lineariteit en kunnen worden afgebeeld met verbeterde resolutie. Ten tweede is het zeer belangrijk om zuiver sinusvormige modulatie produceert binnen de excitatiebundel, waardoor motiveren het gebruik van slaan tussen de twee AOM's. Sinds enhancement resolutie is gebaseerd op de winning van niet-lineaire delen (harmonische frequentie componenten) van de verstrooiing signaal modulatie, als niet-lineairevervorming in de excitatie modulatie dan winning moeilijker zal zijn. Bovendien, in het huidige schema wordt een interferometer opstelling gebruikt voor het slaan modulatie te produceren, zodat de uitlijning van de twee bundels in de interferometer is ook kritisch zo groot van een modulatiediepte mogelijk te verwezenlijken. Ten derde is het zeer belangrijk dat het signaal lineariteit niet voortvloeit uit het detectiesysteem (waarbij de detector, versterker, A / D omvormer en computer I / O bevat). Daarom speciale aandacht moet worden gewaarborgd dat het detectiesysteem werkt binnen het dynamische bereik. Het dynamische bereik wordt gedefinieerd als het gebied van het detectiesysteem lineariteit, dat wil zeggen van het geluidsniveau detector verzadiging. In het onderhavige geval, het gedetecteerde voltage signaal lineair is dan 1 V, en het geluidsniveau is dan 10 -4 V. Daarom is het systeem een dynamisch bereik van ten minste 10 4. Om het signaal afkomstig is van niet-lineariteitde gouden nanodeeltjes zelf niet van het detectiesysteem, is het noodzakelijk om de uitlezing waarde binnen het dynamische bereik te behouden. De vierde kritische factor is de mechanische stabiliteit van het monster. Tijdens de lineariteit karakterisering, is het essentieel dat de nanodeeltjes blijven hetzelfde focal plane. Axiale verplaatsing van de nanodeeltjes of monstertafel zou ernstige invloed op de nauwkeurigheid van de lineariteit beoordeling. Daarom, bij het werken met nanodeeltjes, is het belangrijk om deeltjes die niet gemakkelijk bewegen onder lichte excitatie vinden. Anderzijds is het ook mogelijk om met samples gegroeid van lithografie. In dit geval, microscopische stabiliteit fase is de belangrijkste beperkende factor. Er zijn podia met terugmelding controle die sterk kunnen verbeteren van de stabiliteit. Als alternatief, aangezien verkeerspodium is typisch zeer langzaam (bijvoorbeeld 1 urn in 10 min), is het nuttig om een xyz 3D afbeeldingsstapel verkrijgen, zoals 10 beelden met 100 nm axiale separation tussen aangrenzende beelden, bij elke andere intensiteit waarde. Dan tijdens de analysefase, de helderste afbeelding van elke stapel moet worden gekozen als representatief beeld op die intensiteit.
In principe is de resolutie van verzadiging gebaseerde technieken, die SAX en verzadigd gestructureerde verlichting microscopie (SSIM) 26 omvatten, vertoont geen ondergrens zolang high-order lineariteit (hoge harmonische frequentiecomponenten) worden bereikt. Niettemin, in de praktijk wordt de resolutie beperkt door de signaal-ruisverhouding (SNR), vooral bij het extraheren hogere-orde harmonische componenten demodulatie. Er zijn een aantal strategieën die de SNR kan verbeteren. Zo is aangetoond dat de modulatiefrequentie ernstig beïnvloedt de SNR 27. Het is ook mogelijk om de SNR te verbeteren door het berekenen van de intensiteit verschil tussen onverzadigde en verzadigde signalen alleen de verzadigde signaal (manuscript in voorbereiding) extract.
28-30 ofdoor verzadiging van fluorescentie-emissie 22,26,31. Echter, fluorescentie vertoont een intrinsiek probleem van foto-bleken, vooral bij fel licht verlichting. Deze studie toonde aan dat verzadigbare verstrooiing van GNSS is een veelbelovende methode om superresolutietechnieken aangezien er geen bleken probleem 21. Vergeleken met eerdere studies van SAX fluorescentie microscopie gebruik, de resolutie uitbreiding met verzadigbare verstrooiing veel hoger in dit onderzoek, mogelijk als gevolg van de hogere-orde niet-lineariteit 22. Bovendien, met uitzondering SAX microscopie, kunnen andere super-resolutie techniek waarbij verzadiging: SSIM 26. SSIM exploiteert ruimtelijke modulatie van franjes aan de niet-lineaire signalen te halen, terwijl SAX microscopie maakt gebruik van tijdelijke modulatie. Met de eigenschap verzadiging van deze niet-bleken verstrooiing, wordt ook verwacht dat deze ontdekking kan worden gecombineerd met SSIM de ruimtelijke resolutie onder groothoek ill verbeterenumination.
In toekomstige toepassingen zal dit plasmon SAX techniek nuttig niet alleen voor resonantie-modus verdelingen en dynamica lossen plasmonische circuits, maar ook voor de oplossing van biologisch weefsel imaging verbeteren. Soortgelijke resolutie verbetering aangetoond met andere plasmon materialen zoals zilver (niet gepubliceerd), evenals niet-plasmonische materialen, zoals silicium 32. In de beeldvorming veld super-resolutie, SAX microscopie heeft voordelen in meerdere opzichten. Vergeleken met stochastische optische reconstructie microscopie (STORM) en foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM), SAX microscopie heeft een snellere scansnelheid van slechts een paar seconden per beeld. In vergelijking met gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie, slechts één laser vereist SAX microscopie, aanmerkelijk verminderen van de optische complexiteit. Vergeleken met SSIM, wordt de resolutie van SAX gelijktijdig verbeterd in zowel de laterale en axiale richtingen. Bovendieneen voldoende beeldvorming diepte te bereiken, willekeurige verstrooiing langs de stralengang van excitatie of verzameling is van cruciaal belang. Voor wide-field technieken zoals STORM, PALM, en SSIM, worden opnamen met een camera, die zeer gevoelig zijn voor willekeurige verstrooiing van uitgezonden fluorescentie fotonen in weefsels. Voor point-scan technieken zoals STED en SAX, zijn de fluorescentie signalen opgevangen door een punt detector, zodat ze meer bestand tegen weefsel verstrooiing. Toch STED vereist een fase plaat naar een donut balk profiel aanmaken op de focus en de fase-informatie kan tijdens bundelpropagatie in weefsels worden verslechterd. Daarom moet SAX microscopie de beste onder deze modaliteiten voor diepe weefsel super-resolutie beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope body | Olympus, Japan | BX-51 | |
| objective lens | Olympus, Japan | UPlanSapo, 100X, NA 1.4 | |
| 80-nm gold colloid | BBI Solutions, UK | EM.GC80 | |
| supercontinuum laser | Fianium, United Kingdom | SC400-2-PP | |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, USA | BB1-E02 | |
| field emission SEM | JEOL, Japan | JSM-6330F | optional |
| spectrometer | Andor Technology, UK | Shamrock 163 | |
| charge-coupled device | Andor Technology, UK | iDus DV420A-OE | |
| acousto-optic modulators | IntraAction Corp., USA | AOM-402AF1 | |
| lock-in amplifier | Stanford Research Systems, USA | SR-830 | |
| MAS-coated slide glass | Matsunami Glass, Japan, | S9215 |
References
- Fang, N., Lee, H., Sun, C., Zhang, X. Sub-diffraction-limited optical imaging with a silver superlens. Science. 308 (5721), 534-537 (2005).
- Lee, B., Kim, S., Kim, H., Lim, Y. The use of plasmonics in light beaming and focusing. 34 (2), 47-87 (2010).
- Lal, S., Link, S., Halas, N. J. Nano-optics from sensing to waveguiding. Nature Photon. 1 (11), 641-648 (2007).
- Kawata, S., Inouye, Y., Verma, P. Plasmonics for near-field nano-imaging and superlensing. Nature Photon. 3 (7), 388-394 (2009).
- Homola, J., Yee, S. S., Gauglitz, G. Surface plasmon resonance sensors: review. Sensor. Actuat. B-Chem. 54 ((1-2)), 3-15 (1999).
- Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
- Hache, F., Ricard, D., Flytzanis, C. Optical nonlinearities of small metal particles - surface-mediated resonance and quantum size effects. J. Opt. Soc. Am. B. 3 (12), 1647-1655 (1986).
- Balamurugan, B., Maruyama, T. Evidence of an enhanced interband absorption in Au nanoparticles: Size-dependent electronic structure and optical properties. Applied Physics Letters. 87 (14), 143105 (2005).
- Link, S., El-Sayed, M. A. Size and temperature dependence of the plasmon absorption of colloidal gold nanoparticles. J. Phys. Chem. B. 103 (21), 4212-4217 (1999).
- Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment. J. Phys. Chem B. 107 (3), 668-677 (2003).
- Kauranen, M., Zayats, A. V. Nonlinear plasmonics. Nature Photon. 6 (11), 737-748 (2012).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Au nanoparticles target cancer. Nano Today. 2 (1), 18-29 (2007).
- Wada, O. Femtosecond all-optical devices for ultrafast communication and signal processing. New J. Phys. 6 (183), Forthcoming.
- Elim, H. I., Yang, J., Lee, J. Y., Mi, J., Ji, W. Observation of saturable and reverse-saturable absorption at longitudinal surface plasmon resonance in gold nanorods. Appl. Phys. Lett. 88 (8), 083107 (2006).
- Ros, I., Schiavuta, P., Bello, V., Mattei, G., Bozio, R. Femtosecond nonlinear absorption of gold nanoshells at surface plasmon resonance. Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (41), 13692-13698 (2010).
- De Boni, L., Wood, E. L., Toro, C., Hernandez, F. E. Optical Saturable Absorption in Gold Nanoparticles. Plasmonics. 3 (4), 171-176 (2008).
- Gurudas, U., et al. Saturable and reverse saturable absorption in silver nanodots at 532 nm using picosecond laser pulses. J. Appl. Phys. 104 (7), 073107 (2008).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and scattering of light by small particles. , John Wiley & Sons Inc. (1983).
- Chu, S. W., et al. Saturation and reverse saturation of scattering in a single plasmonic nanoparticle. ACS Photon. 1 (1), 32-37 (2014).
- Chu, S. W., et al. Measurement of a saturated emission of optical radiation from gold nanoparticles: application to an ultrahigh resolution microscope. Phys. Rev. Lett. 112 (1), 017402 (2014).
- Fujita, K., Kobayashi, M., Kawano, S., Yamanaka, M., Kawata, S. High-resolution confocal microscopy by saturated excitation of fluorescence. Phys. Rev. Lett. 99 (22), 228105 (2007).
- Smith, K. C. A., Oatley, C. W. The scanning electron microscope and its fields of application. Brit. J.Appl. Phys. 6 (11), (1955).
- Yu, J. Y., et al. A diffraction-limited scanning system providing broad spectral range for laser scanning microscopy. Rev. Sci. Instru. 80 (11), 113704 (2009).
- Lee, H., et al. Point spread function analysis with saturable and reverse saturable scattering. Opt. Express. 22 (21), 26016-26022 (2014).
- Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Yonemaru, Y., Yamanaka, M., Smith, N. I., Kawata, S., Fujita, K. Saturated Excitation Microscopy with Optimized Excitation Modulation. ChemPhysChem. 15 (4), 743-749 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Heintzmann, R., Jovin, T. M., Cremer, C. Saturated patterned excitation microscopy - a concept for optical resolution improvement. J. Opt. Soc. Am. A. 19 (8), 1599-1609 (2002).
- Tzang, O., Pevzner, A., Marvel, R. E., Haglund, R. F., Cheshnovsky, O. Super-Resolution in Label-Free Photomodulated Reflectivity. Nano Lett. 15 (2), 1362-1367 (2015).
