Introduction
Das Studium der Plasmonik hat großes Interesse aufgrund seiner Anwendungen in vielen verschiedenen Bereichen 1-4 angezogen. Eine der am besten untersuchten Felder Plasmonics oberflächen Plasmonics, bei dem die kollektive Schwingung der Leitungselektronen Paare mit einer externen elektromagnetischen Welle an einer Grenzfläche zwischen einem Metall und Dielektrikum. Oberflächen Plasmonik hat für seine potentiellen Anwendungen in Subwellenlängen Optik, Biophotonik und Mikroskopie 5,6 erforscht. Die starke Feldverstärkung in der ultra-kleinen Volumen von Metallnanopartikeln durch lokalisierte Oberflächenplasmonresonanz (LSPR) hat große Aufmerksamkeit nicht nur wegen seiner außergewöhnlichen Empfindlichkeit auf Korngrößen, Kornformen und den dielektrischen Eigenschaften des umgebenden Mediums 7 angezogen wird, -10, sondern auch wegen seiner Fähigkeit, von sich aus schwach nichtlineare optische Effekte 11 zu steigern. Die außergewöhnliche Empfindlichkeit der LSPR ist wertvoll für Bio-Sensorik und in der Nähe von-field Bildgebungstechniken 12,13. Andererseits kann die erhöhte Nichtlinearität plasmonischer Strukturen in photonischen integrierten Schaltkreisen in Anwendungen wie optischen Schalt und volloptischen Signalverarbeitung 14,15 verwendet werden. Es ist gut bekannt, dass das Plasmonen Absorption ist linear proportional zur Anregungsintensität bei niedrigen Intensitätspegel. Wenn die Erregung stark genug ist, erreicht der Absorptionssättigung. Interessanterweise bei höheren Intensitäten steigt die Absorption wieder. Diese nichtlinearen Effekte sind aufgerufen sättigbaren Absorptions (SA) 15-17 und umgekehrt sättigbare Absorption (RSA) 18 auf.
Es ist bekannt, dass aufgrund der LSPR ist Streuung besonders stark in plasmonic Strukturen. Basierend auf Grund Elektromagnetik, sollte die Antwort der Streulichtintensität gegenüber linear sein. Doch in Nanopartikeln, Streuung und Absorption sind eng über die Mie-Theorie verbunden, und beide können e seinim Hinblick auf die realen und imaginären Teile der dielektrischen Konstante xpressed. Unter der Annahme, dass ein einzelnes GNS verhält sich wie ein Dipol unter Lichtbestrahlung kann der Streuungskoeffizient (Q sca) und der Absorptionskoeffizient (Q abs) aus einem einzigen plasmonic Nanopartikel nach der Mie-Theorie als 19 ausgedrückt werden
wobei x 2 πa / λ, a ist der Radius der Kugel ist, und m 2 ε m / ε d. Hier ε m ε d entsprechen den Dielektrizitätskonstanten des Metalls und der umgebenden Dielektrika sind. Da die Form der Streukoeffizient ähnlich dem von the Absorptionskoeffizienten wird daher erwartet, dass sättigbaren Streuung in einem einzelnen plasmonic Nanopartikel 20 beobachten.
Kürzlich wurde linearen sättigbaren Streuung in einem isolierten plasmonic Partikel erstmals 21 gezeigt. Es ist bemerkenswert, dass bei tiefen Sättigung, die Streuintensität in der Tat leicht zurückgegangen, wenn die Anregungsintensität erhöht. Noch bemerkenswerter ist, wenn die Anregungsintensität weiter zunehmende nach der Streuung gesättigt wurde, erhöhte sich die Streuintensität wieder, die die Wirkung der umgekehrt sättigbare Streu 20. Wellenlängen- und größenabhängige Studien haben eine starke Beziehung zwischen LSPR und nichtlineare Streu 21 dargestellt. Die Intensität und Wellenlänge Abhängigkeiten plasmonischer Streuung sind sehr ähnlich denen der Absorption, was auf einen gemeinsamen Mechanismus hinter diesen nichtlinearen Verhalten.
In Bezug auf die Anwendungen ist es auch known, dass Nichtlinearität hilft, optische Mikroskopie Auflösung zu verbessern. 2007, gesättigten Anregung (SAX) Mikroskopie wurde vorgeschlagen, die Auflösung durch Extrahieren des gesättigten Signals über eine zeitliche sinusförmige Modulation des Anregungsstrahls 22 verbessern können. SAX Mikroskopie beruht auf dem Gedanken, dass bei einer Laserbrennfleck, stärker in der Mitte als am Rand der Intensität basiert. Wenn das Signal (entweder Fluoreszenz oder Streuung) zeigt Sättigungsverhalten, muss die Sättigung von der Mitte zu starten, während die lineare Reaktion an der Peripherie bleibt. Deshalb, wenn es eine Methode, um nur den gesättigten Teil zu extrahieren, es wird nur verlassen den zentralen Teil, während die Ablehnung der Umfangsteil, somit effektiv die Verbesserung der räumlichen Auflösung. Im Prinzip gibt es keine untere Auflösungsgrenze in SAX Mikroskopie, solange tiefe Sättigung erreicht ist und sich keine Probe Schäden aufgrund der intensiven Beleuchtung.
Es wurde, daß die resolutio gezeigt,n der Fluoreszenzabbildung kann durch Verwendung des SAX Technik erheblich verbessert werden. Jedoch leidet Fluoreszenz von dem Photobleichwirkung. Kombinieren der Entdeckung von Streunichtlinearität und das Konzept der SAX können Superauflösungsmikroskopie anhand von Streuung realisiert 21 sein. Im Vergleich zu herkömmlichen Superauflösungsmikroskopie bietet die Streuung-basierte Technik eine neuartige Nicht-Bleichkontrastverfahren. In diesem Papier wird ein Schritt-für-Schritt Beschreibung angegeben, die erforderlich ist, um zu erhalten, und extrahieren Sie die Nichtlinearität der Plasmonen Streuverfahren skizzieren. Verfahren zur Identifizierung von durch Veränderung der Lichtintensität eingeführt Streunichtlinearitäten werden beschrieben. Weitere Details werden zur Verfügung gestellt, um zu lüften, wie diese Nichtlinearitäten auswirken Bilder einzelner Nanopartikel und wie räumliche Auflösung kann entsprechend durch die SAX-Technik verbessert werden kann.
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Protocol
1. GNS Probenvorbereitung
- Vor der Herstellung der Probe 1 ml Sonikat GNS Kolloidlösung für mindestens 15 min bei etwa 40 kHz, um die Partikelaggregation, die bewirken können, die LSPR Spitze zu verlagern verhindern.
- Drop 100-200 ul GNS Kolloid auf einen Objektträger mit kommerziellen Magnesiumaluminiumsilikat (MAS) Beschichtung, um die GNSS beheben.
- Nach mindestens 1 min, entfernen Sie die zusätzlichen Kolloid durch Spülen mit destilliertem Wasser. Die Wartezeit abhängig von der erforderlichen Verteilungsdichte der GNSS. Typischerweise 1-3 min ergibt eine geeignete Dichte, die die Teilchen leicht zu identifizieren, da die meisten von ihnen voneinander getrennt werden können. Signifikante Aggregation kann auftreten, wenn die Wartezeit zu lang ist.
- Trocknen Sie die Probe durch Spülen mit Stickstoffgas.
- (Optional) Um den GNSS-Karte auf dem Glas mit hoher Auflösung, führen Sie die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) in dieser Phase 23. Ein Beispiel Bild ist in Figur bereitgestellte 1, welches die Kenn Dichte GNSS. Verwenden Sie eine Feldemissions SEM, um das Bild zu erwerben. Wenn das Öl auf die Probe (nächster Schritt) hinzugefügt wird, wird es schwierig sein, das Öl zu entfernen und beobachten die Probe mit SEM.
- Fügen Sie einen Tropfen Öl mit dem gleichen Brechungsindex auf die Probe, um das GNSS zu decken und die starke Reflexion von dem Glassubstrat zu beseitigen.
- Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite der Probe und verschließen Sie diese mit Nagellack.
- Warten Sie mindestens 5 Minuten, bis der Lack trocknet. Die Probe ist nun bereit.
2. Ausrichtung der selbstgebauten Konfokalmikroskop
- Siehe Abbildung 2 für die Regelung des Setup. Richten Sie die Beleuchtung mit weißem Licht Gang des Mikroskops Körper selbst. Schalten Sie den Halogen-Lichtquelle des Mikroskops und folgen Sie den Mikroskopherstellerhandbuch, das Köhler-Beleuchtung Zustand zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass die weißen Halogenlichtstrahlen nahezu parallel an der Rückseite sindApertur des Objektivs, die teilweise durch den Strahlenteiler 50/50 reflektiert und dann auf den Laser zu propagieren.
- Einzuschalten Galvanospiegel, um sicherzustellen, dass sie noch auf der richtigen Ausgangsposition, das heißt, in der Mitte des Abtastbereichs.
- Platzieren Sie mindestens zwei Ziele, die durch eine dünne Blatt Papier mit konzentrischen Ringen auf sie gemacht, entlang der Halogenlichtpfad, und richten Sie sie mit der Halogenstrahl.
- Zur Bildgebung durchzuführen, wählen Sie die 532-nm-Laser. Um Spektroskopie-Messungen durchzuführen, wählen Sie die Superkontinuum-Laser. Bei der Ausrichtung, sollte die Leistung der Laser weniger als 10 & mgr; W auf der Rückseite Apertur des Objektivs sein, die Nichtlinearität zu vermeiden. Dann Kollimieren des einfallenden Laserstrahls gegenüber der ausgehenden Halogenlicht mit Hilfe der zwei Targets. Wenn dieser Prozess abgeschlossen ist, ist die Grobausrichtung des Laserstrahls erreicht.
- Ausrichten des Laserstrahls durch die Mitte der hinteren Öffnung des Objektivs. In der Regel verwenden Sie eine oil-Immersionsobjektiv. Fügen Sie einen Tropfen Öl zwischen dem Ölimmersionsobjektivlinse und der GNS Probe. Verwenden eine Photovervielfacherröhre (PMT) als Detektor die Streusignale der GNSS sammeln.
- Legen Sie eine 20-um-Durchmesser Lochblende vor dem PMT zu blockieren, die unscharfe Streusignale. Schalten Sie den Galvanospiegel und PMT (über selbst gebaute Software), passen Sie die Pinhole-Position und Höhe der Probe Bühne, um die Rückstreusignale des GNSS zu maximieren, und dann beobachten, eine individuelle GNS auf einem Computerbildschirm. Eine Probe xy Bild des GNSS mit korrekter Ausrichtung ist in 2B gezeigt.
- Leicht ändern Sie die Höhe der Probe Bühne, um den Rundlauf der Fokus zu überprüfen. Wenn es nicht konzentrisch, Einstellen der Lichtstrahl mit den beiden Spiegeln vor den Scanner, bis die Mitte des GNS bleibt in derselben Position, während die Höhe der Probenstufe geändert wird. Stellen Sie sicher, dass die xz Bild der PSF ist ähnlich zu 2Cum eine korrekte Strahlausrichtung zu gewährleisten. Verarbeiten diese beiden Bilder mit Tiefpass und Gaussian glatte Filter.
3. Charakterisierung der Scattering Nonlinearity
- Bei niedrigen Anregungsintensität (weniger als 10 4 W / cm 2), erwerben Sie ein Bild von Gold-Nanopartikeln durch folgende Protokoll 2.6.
- Öffnen Sie das Bild in ImageJ (oder jede andere Bildanalyse-Software). Zeichnen Sie eine Linie quer über eine der GNSS im Bild (siehe Abbildung 2B), und verwenden Sie Analysis -> Plot Profil der ImageJ Werkzeuge, um die Streuintensität Profil abrufen. Montieren Sie das Profil des gewählten PSF durch eine Gauß-Funktion:
wobei y die PMT Auslesewert, y 0 ist der Hintergrundwert (falls vorhanden), A ist die Spitzenamplitude ist, w die Breite ist, x die räumliche Koordinate und x c ist das Zentrum coordinate der Gaußfunktion. Die FWHM des entsprechenden PSF (½ln2) w. Auf der Grundlage der numerischen Apertur (NA) des Objektivs kann die theoretische FWHM des konfokalen PSF schätzungsweise etwa 0.43l / NA, wobei L die Anregungswellenlänge ist. Vergleichen Sie diese beiden Zahlen, um die Ausrichtung des Abbildungssystems zu überprüfen. - Erhöhen Sie die Anregungsintensität durch die Neutraldichtefilter (ND) in 2A manuell ändern, und notieren Sie die Rückstreuung Bilder bei jeder Intensitätsstufe. Nehmen Sie den Wert des Streusignals von der Mitte jeder GNS bei unterschiedlichen Anregungsintensitäten, und zeichnen Sie die Kurve der Streusignale gegenüber Anregungsintensitäten. Prüfen die Linearität der ersten Punkte, die eine lineare Beziehung aufweisen sollte, wenn die Anregungsintensität ausreichend niedrig ist. Zeichnen Sie eine Linie auf der Basis linearer Anpassung der ersten paar Punkte. Wenn die Streuintensitäten der folgenden Punkte fallen unter diese linearen Trend, saturation ist aufgetreten.
- Nach Beobachtung sättigbaren Streuung, nach und nach die Intensität unterhalb der Sättigungsschwelle zu verringern, und das gleiche Bild GNSS erneut, um die Reversibilität der nichtlineare Verhalten zu gewährleisten.
4. Messung eines Streuspektrum eines einzelnen Gold Nanosphere
- Um die Rückstreuungsspektrum aus einer Hand GNS zu messen, verwenden Sie das Superkontinuum-Laser als Laserquelle. Die anfängliche Wellenlänge des Lasers im Bereich von 450 nm bis 1.750 nm. Um das überschüssige Infrarotleistung, die Schäden an der Probe und der optischen Komponenten führen könnten, zu entfernen, setzen Sie ein oder zwei Spiegel direkt nach dem Superkontinuum-Laser, um das sichtbare Licht zu reflektieren, und verwenden Sie Strahl Dumps, um die überschüssige Infrarotlicht zu sammeln.
- Befolgen Sie die Abläufe zur Ausrichtung der Abschnitt 2, um den Superkontinuum-Laser in die Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop zu lenken. Einen Breitband 50/50 BS zum spektrale Abdeckung über den gesamten sichtbaren Bereich zu gewährleisten.
- Erwerben Sie einBild der GNSS auf Glas. Suchen Sie eine Einzel GNS in das Bild, und befestigen Sie den Fokus des einfallenden Breitbandlicht auf das Teilchen.
- Verwenden Sie einen flipping Spiegel vor der PMT, um die Rückstreusignal zu dem Spektrometer, das mit einer ladungsgekoppelte Vorrichtung ausgestattet ist direkt, und nehmen Sie dann ein Spektrum der ausgewählten Einzel GNS. Achten Sie darauf, dass das Spektrum hier ist eine Mischung von GNS-Streuung und Hintergrund durch Reflexionen von anderen Oberflächen.
- Wechseln Sie wieder zu der PMT-Detektor, und nehmen Sie ein anderes Bild, um zu bestätigen, dass die Partikellage hat sich nicht geändert. Dann verschieben den Fokus auf einen Punkt, an dem kein Teilchen vorhanden ist. Wechseln Sie zurück in das Spektrometer, und nehmen Sie eine weitere Spektrum, das den Hintergrund stellt.
- Subtrahieren Sie die Hintergrundspektrum aus Schritt 4.5 aus dem Spektrum aus Schritt 4.4 eine klare Rückstreuungsspektrum einer einzigen GNS erhalten.
5. Ausrichtung der SAX-Mikroskop
- Siehe Abbildung 3für die Regelung des SAX-Mikroskop, wo eine ideale sinusförmige zeitliche Modulation aus der Schwebungsfrequenz zwischen zwei akustisch-optische Modulatoren (AOMs) erhalten. Zunächst Einstellen der Strahlgröße des Lasers, um die Anforderung der nachfolgenden AOMs erfüllen. Teilen Sie die 532 nm-Laserlicht in zwei Strahlen unter Verwendung eines 50/50 Strahlteiler.
- Führen Sie die beiden Strahlen durch die zwei AOMs, mit einem Strahl durch jeden AOM vorbei. Die Modulationsfrequenzen der beiden AOMs müssen unterschiedlich sein. Beispielsweise kann man bei 40.000 MHz und die andere auf 40.010 MHz sein, was eine Differenzfrequenz von 10 kHz. Diese Differenzfrequenz wird die Grundmodulationsfrequenz f m für die SAX-Signale sein.
- Nehmen Sie die erste Ordnung gebeugten Strahlen von beiden AOMs, und kombinieren Sie die beiden Strahlen durch Verwendung eines anderen 50/50 Strahlteiler. Stellen Sie die Spiegel nach den AOMs, um die zwei Strahlen zu kollimieren.
- Hinzufügen eines Photodetektors, der mit einem Oszilloskop verbunden ist, um die zeitliche Modulatio überwachenn. Aufgeteilt einen kleinen Teil des Lasers mit einem Objektträger, und senden es an den Photodetektor, wie in Figur 3 gezeigt ist. Mit der richtigen Modulation und Strahlüberlappungs beachten sinusförmigen Intensitätsmodulation auf der Hauptfrequenz f m, ähnlich derjenigen der dargestellten Wellenform in 4.
Anmerkung: Der Hintergrund der Modulation muss so niedrig wie möglich sein, um die maximale Modulationstiefe zu erreichen. Darüber hinaus verwenden die Fourier-Analyse-Funktion des Oszilloskops, um zu überprüfen, dass die harmonische Verzerrung des Modulations abnimmt. Um erfolgreich zu SAX Umsetzung zu erreichen, sorgen für eine perfekte sinusförmige Anregungsintensitätsmodulation mit minimierten Ausgangslinearität. - Trennen des elektrischen Ausgangssignals des Photodetektors vom Oszilloskop und eine Verbindung zu dem Referenzeingang des Lock-in-Verstärkers.
- Wie in Figur 3 gezeigt, richten den Laserstrahl in das konfokale System, indem die vorherigen Protokolle. Here, schließen Sie das elektrische Ausgangssignal des PMT auf die Lock-in-Verstärker als Signaleingang.
- Verwenden Sie eine leere Deckglas wie die Probe, und überprüfen Sie die Linearität des elektrischen Detektionssystem durch die schrittweise Erhöhung der Anregungsleistung ,, wie in 5, in dem der Detektor linear unter einen Auslesewert von 1-V gezeigt. In allen nachfolgenden Messungen ist darauf zu achten, um die Anzeige auf unter diesen Wert zurückzuhalten.
- Gesetzt den Ausgang des Lock-in-Verstärker, um die absolute Höhe des Spannungssignals zu exportieren. Durch die Veränderung der harmonischen Komponente Einstellung an der Referenzkanal, zu erhalten, die Amplituden der SAX-Signale, A 1, A 2, und so weiter.
- Exportieren der linearen und nichtlinearen Signale von dem Lock-in-Verstärker mit einer Datenerfassungskarte, die ebenfalls das Ansteuerspannungssignale der Rasterabtastung Galvanospiegel. Mit Hilfe einer angepassten Labview Programm synchronisiert die Signale des Lock-in-Verstärker und derGalvanospiegel, um ein Bild zu bilden.
- Zur Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnis in den Bildern auszuwählen entsprechend den Pixelerfassung und Integrationszeiten des Lock-in-Verstärker. Beispielsweise, wenn das Hauptmodulationsfrequenz f m der Anregung 10 kHz, das heißt, wenn die Periode von 100 & mgr; s gesetzt die Integrationszeit des Lock-in-Verstärker, mindestens drei Mal länger als die Periode. Hinzufügen der Zeit der Galvanospiegel Bewegung wird die Aufnahmegeschwindigkeit bei 1.500 Pixel pro Sekunde in der SAX-Bildaufnahmemodus eingestellt.
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Representative Results
Figur 6 zeigt das gemessene Spektrum von einer 80 nm GNS. Eine berechnete Kurve auf der Grundlage der Mie-Theorie wird in der gleichen Handlung gegeben, zeigt eine ausgezeichnete Übereinstimmung. Die LSPR Gipfel ist in der Umgebung von 580 nm. In dem folgenden Versuch wird die Laserwellenlänge betrug 532 nm, die gewählt wurde, wie es in dem Plasmonen-Band befindet, um die optische Streuung mit plasmonic Wirkung zu verbessern und den Streusättigungs 21.
Figur 7 stellt die Streubilder von einem einzigen Goldnanopartikel bei unterschiedlichen Anregungsintensitäten und die untere Reihe stellt die Linienprofil der einzelnen Teilchen, die Nichtlinearität zu markieren. Die Bildgröße ist 600 nm × 600 nm, und die Pixelgröße beträgt 13,8 nm. Die Aufnahmegeschwindigkeit betrug 234.000 Pixel pro Sekunde im normalen xy-Bildaufnahmemodus. Jedes Bild wurde über fünf Akquisitionen gemittelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
Wenn die Anregungsintensität niedriger als1,5 × 10 6 W / cm 2, ist der Streu linear abhängig von der Anregungsintensität, so dass das resultierende Bild von einem einzigen Nanopartikel ähnelt der PSF des Anregungsstrahls mit einem Standard-Gauss-Profil. Jedoch, wenn die Anregungsintensität erhöht sich auf 1,7 × 10 6 W / cm 2, nicht nur klar Abflachung an der Spitze der PSF beobachtet wird, sondern auch Verbreiterung der Halbwertsbreite, was darauf hinweist Sättigung. Sehr interessant ist, bei etwas höheren Intensitäten wird das zentrale Intensität geringer ist als die Umfangs, was zu einer torusförmigen PSF. Dann, als die Anregungsintensität weiter ansteigt, erhöht sich die Streuintensität wieder und zeigt Umkehrsättigung und damit einen neuen Spitzenwert in der Mitte der PSF.
Durch Auftragen der mittleren Intensitäten der PSFs bei unterschiedlichen Anregungsintensitäten ist die Streuintensitätsabhängigkeit erhalten wird, wie durch die Punkte in Fig. 8 dargestellt Diese Kurve clearly zeigt die Trends der Sättigung und Sperrsättigungsverhalten. Wie erwartet, es sieht sehr ähnlich wie die Intensitätsabhängigkeit des nichtlinearen Absorptions 15-17. Nach dem traditionellen Verfahren zum Analysieren von nichtlineare Absorption wurde eine Polynomfunktion verwendet, um die nichtlineare Streuung Ergebnis passen. Doch anders als die meisten nichtlineare Absorption Studien, in der Nichtlinearität dritter Ordnung ist ausreichend, um die Ergebnisse zu modellieren, hier fünfter Ordnung Nichtlinearität war erforderlich, um besser auf die Streukurve.
Wie in Abschnitt 5 erwähnt, können die harmonischen Frequenzkomponenten experimentell durch einen Lock-in-Verstärker extrahiert werden, und die Ergebnisse sind in 9A angegeben. Auf der anderen Seite können die harmonischen Komponenten aus Abbildung 8. Zuerst berechnet werden, verwenden Sie eine Polynom-Funktion, wobei I Anregungsintensität, um 8 zu passen, also haben wir die passenden Parameter α, β, γ .... Wir können dann drücken die Anregungs intenskeit als zeitlich modulierte Funktion I (t) = I 0 (1 + cos (2 & pgr; f m t)) / 2, wobei t die Zeit ist, f m die Modulationsfrequenz, und I 0 ist der maximale Anregungsintensität. Durch Substitution I (t) in S (I), und stellen eine Fourier-Transformation, um die resultierende S (I (t)) in den Frequenzbereich umzuwandeln, haben wir die folgende Gleichung zusammengesetzt aus mehreren Delta-Funktionen (δ):
Der Koeffizient jedes Deltafunktion (A 0, A 1, A 2 usw.) stellt die Amplitude des SAX-Signal an der entsprechenden harmonischen Frequenz. Diese Koeffizienten, die den SAX signa entsprechenl Stärken bei verschiedenen Oberschwingungen, als Funktionen der Anpassungsparameter α, β, γ ... geschrieben werden:
Die Berechnungsergebnisse werden in 9B gezeigt. Die experimentellen und Berechnung Stücke stimmen eng, insbesondere in den beiden folgenden Aspekten.
Zuerst werden die Kurven der 2 und 3 f m f m sind nicht glatt, welche Einbrüche an bestimmten Intensitäten entlang der Kurven. In beiden Figuren gibt es drei Dips in den 2 f m-Kurven, während zwei Dips sind in den 3 f m-Kurven zu sehen. Zweitens sind die Pisten verschiedene mit unterschiedlichen Anregungsintensitäten. Wenn die Anregungsintensität ist nicht hoch, die Steigungen von 1 f m, 2 f m und 3 f m sind 1, 2, und 3, beziehungsweise. Doch nach jedem Eintauchen, die Steigungen der entsprechenden nicht-linearen Kurven größer.
Mit den Dips und Steigung Variationen sind unkonventionelle PSFs erwartet, wenn die nicht-linearen Komponenten werden über den SAX-Technik, wenn die Anregungsintensität über die Dips erhöht extrahiert. 10A zeigt die Bild SAX Beispiele der 1 f m, 2 f m, und 3 f m Frequenzkomponenten bei unterschiedlichen Anregungsintensitäten. In der ersten Zeile ist die Anregungsintensität von 0,7 mW / cm 2, die ausreicht, um die nicht-linearen Komponenten zu induzieren, aber die Amplitude ist relativ schwach. Bei dieser Belastung, die Steigung der 2 f m Signals gleich 2 ist, und es ist 3 zur 3f m Signal, wie es in 9A gezeigt ist. Wenn die Anregungsintensität auf das Niveau des ersten Tauch des 2 f m-Signal erhöht, die SAX Bilder der 2f m Signal geworden Donut geformt, wie es in der zweiten Reihe in 10A gezeigt. Sowohl die 1 f m und 3 m f Bilder bleiben solide, während die Halbwertsbreite des 3 f m PSF ist deutlich kleiner als die der 1 f m-Signal, manifestiert bemerkenswerte Auflösungsverbesserung. Von der Signalverlauf am weitesten rechts Platte der gleichen Zeile, die Halbwertsbreite des 2 f m cubering ist etwa 110 nm. Andererseits ist die dritte Zeile von Figur 10A zeigt, daß, wenn die Erregungsintensität auf die erste Neigung der 3 f m Signals zunimmt, wird nur die Bild 3f m wird torusförmigen, mit einer 65 nm Ringbreite. Bei dieser Intensität ist bemerkensAuflösungsVerbesserung gefunden beim Vergleich der 2 f m Signal an die 1 f m ein.
Figuren 10B und 10C zeigen den berechneten PSFs der 2 f m und 3 m f-Signale jeweils an den entsprechenden Intensitäten, die in den Donut-Formen führen. Die Berechnungen wurden auf der Polynomanpassung Kurve in 9B basiert. Die berechneten Kurven und in den am weitesten rechts liegenden Platten in 10A reproduzieren die Eigenschaften der Versuchs PSFs, erneut bestätigt die Eignung eines Polynom fünfter Ordnung Passung für die nichtlineare Streuung.
Abbildung 1. SEM-Bild von GNSS. Durch Durchführen der im ersten Teil des Protokolls beschriebenen Herstellungsverfahren, ausreichend getrennt GNSS beobachtet. Mit mehr als 100 nm zwischen GNSS, werden ihre LSPR Effekte nicht miteinander gekoppelt sind. Maßstab:. 100 nm Bitte klicken Sie hier, um zu seheneine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. (A) Aufbau von selbstgebauten konfokalen Mikroskops 24. (B) xy-Bild mit GNSS auf Fokus. 2 (c):. Xz Bild der PSF mit der richtigen Ausrichtung sind zwei Laserquellen für dieses System. Eines ist ein 532 nm-Dauerstrichlaser, und der andere ist ein gepulster Superkontinuumslaser. Bei der Messung der Streusignale wurde eine 532 nm kontinuierlichen Laser als Quelle und einer PMT Detektors (mit einem Laserlinienfilter eingesetzt) verwendet wurde. Um das Spektrum zu messen, wurde eine Superkontinuum-Lasers als Laserquelle und ein Spektrometer als Detektor angenommen. Der ausgewählte Laser wird durch einen Satz von Graufilter, um die Erregungsintensität steuern gesendet. A 50/50 Strahlteiler führt den Laser in die Scanning-Mikroskop und ermöglicht die Hälfte der nach hinten streuenden Signale in diePM T oder das Spektrometer, die durch eine Wendespiegel ausgewählt ist. Des Scansystems gibt es zwei Galvanospiegeln, die vertikalen und horizontalen Rasterabtastung in der Brennebene eines Objektivs zu bilden. Die Rückwärts-Streuung wird durch das gleiche Objektiv gesammelt und durch die Detektoren in elektrische Signale umgewandelt. Die Signale werden mit dem konfokalen Rastersystem zur Erzeugung von Bildern synchronisiert. Der PI-Stufe wurde verwendet, um die xz Bild durch Bewegen des GNSS axial zu erwerben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3 Aufbau SAX Mikroskopie. Die meisten Komponenten entsprechen denen aus einem konfokalen Mikroskop (rotes Rechteck) erhalten werden, aber sinusförmige Modulation zu der Anregungslaserstrahl zugegeben. Blaue Rechteck zeigt modulator-Setup. Zunächst wurde die Anregungslaser in zwei Strahlen aufgeteilt und separat durch zwei AOMs gesendet hochfrequente Modulationen mit geringfügig unterschiedlichen Frequenzen zu erzeugen. Dann wurden die beiden modulierten Strahlen kombiniert, um sinusförmige Modulation bei der Schwebungsfrequenz zwischen den beiden AOMs zu produzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4. Modulation des kombinierten Strahlen nach AOMs durch Oszilloskops. Y1 und Y2 gemessen anzuzeigen Maximum (52,1 mW) und minimalen (1,2 mW) Werte Modulationsintensität auf. Y2 sollte Null auf perfekte Modulation zu erzielen. Aktuelle Modulationsfrequenz betrug 10 kHz. Bitte klicken Sie hier, um zu sehen eine großer Version dieser Figur.
Figur 5. Linearitätstest des Erfassungssystems. Indem ein Deckglas in der Brennebene, die Reflexion des Anregungslasers von der Glas / Luft-Schnittstelle wurde verwendet, um die Linearität des Detektorsystems zu überprüfen. Der Signalausgang gegenüber Anregungsintensität zeigt Linearität unter einen Auslesewert von 1-V. Darüber hinaus ist das Geräuschniveau deutlich unter 10 -4 V, so dass das System bietet einen Dynamikbereich von mindestens 10 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Streuspektrum von 80 nm GNS. Red Punkte zeigen experimental Messungen und schwarze Linie stellt die Berechnung von Mie-Theorie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Scattering Bilder der GNS aus linearen Sättigungsumzukehren. Obere Reihe zeigt Rückstreubilder und untere Reihe gibt Signalverläufe ausgewählter Nanopartikel bei verschiedenen Anregungsintensitäten. Der Übergang von der Linearität zur Sättigung rückgängig Sättigung deutlich zu beobachten ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8. Streuintensitätgegenüber Anregungsintensität von einzelnen GNS. Blaue Punkte entsprechen den Streuintensitäten in der Mitte der PSF an unterschiedlichen Anregungsintensitäten, welche sehr nichtlineare Reaktionen, einschließlich Sättigung und Sättigungssperr. Rote Kurve zeigt Anpassungskurve basierend auf Polynomfunktion fünfter Ordnung. (Bilder aus Lit.. 25.) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 9. Intensity Abhängigkeiten SAX Signale gemäß (A) Experiment und (B) Berechnung. (A) SAX Signale wurden Einfangverstärker extrahiert und jede experimentelle Datenpunkt wurde über vier 80 nm GNSS gemittelt. Gestrichelten Linien Hängen des SAX-Signale 25. (B) Nach Protokoll 5, SAX signale wurden basierend auf Polynom fünfter Ordnung fit in 8 berechnet. (Bilder aus Lit.. 25) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 10. SAX Bilder mit unterschiedlichen Anregungsintensitäten. (A) experimentell beobachteten 1 f m, 2 f m und 3 m f SAX Bilder bei unterschiedlichen Anregungsintensitäten. Pixelgröße 20 nm, und jede Bildgröße beträgt 750 nm × 750 nm. Intensitätsprofile von Donuts bei 2 f m und 3 m f sind in ganz rechte Platten bei 0,75 mW / cm 2 aufgetragen. (B) Berechnet Profil-Bild von 2 f Bild m. (C) Berechnete Profil-Bild von 3 f </ em> m Bild bei 1,1 MW / cm 2. (Bilder aus Lit.. 25.) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Im Protokoll gibt es mehrere wichtige Schritte. Zuerst wird, wenn der Probenvorbereitung, die Dichte des Nanoteilchen sollten nicht zu hoch sein, um plasmonic Kopplung zwischen den Teilchen zu vermeiden. Wenn zwei oder mehr Teilchen sehr nahe beieinander, die Kopplung bewirkt die LSPR Wellenlänge Verschiebung zu längeren Wellenlängen, wodurch die Nichtlinearität wesentlich reduziert wird. Jedoch dieser Abbildungstechnik bildet tatsächlich die Verteilung plasmonischer Arten anstelle der Teilchen selbst. Daher ist zu erwarten, daß mit einer geeigneten Anregungswellenlänge, die gekoppelten plasmonic Modi zeigen starke Streuung Linearität und kann mit verbesserter Auflösung abgebildet werden. Zweitens ist es sehr wichtig, reine Sinusmodulation innerhalb des Anregungsstrahl zu erzeugen, wodurch die Motivation der Verwendung von Überlagerung zwischen den zwei AOMs. Da Auflösungsverbesserung beruht auf der Gewinnung von nicht-linearen Teile (harmonischen Frequenzkomponenten) der Streusignalmodulation, wenn nichtlineareVerzerrung ist, die in dem Erregermodulation dann Extraktion wird schwieriger. Zusätzlich in das aktuelle Schema wird ein Interferometer Setup verwendet werden, um das schlagende Modulation zu erzeugen, so dass die Ausrichtung der beiden Strahlen in dem Interferometer ist auch entscheidend, wie groß der Modulationstiefe wie möglich zu erzielen. Drittens ist es sehr wichtig sicherzustellen, dass die Signallinearität nicht von dem Detektionssystem entstehen (die den Detektor, Verstärker, A / D-Wandler und Computer-I / O enthält). Daher ist besondere Aufmerksamkeit notwendig, um zu gewährleisten, daß das Detektionssystem in den Dynamikbereich arbeitet. Der Dynamikbereich wird als der Bereich des Erfassungssystems Linearität definiert ist, das heißt, aus dem Rauschpegel, um Detektorsättigung. Im vorliegenden Fall wird der erfasste Spannungssignal ist linear unter 1 V, und der Rauschpegel unterhalb 10 -4 V. Daher liefert das System einen dynamischen Bereich von mindestens 10 4. Um sicherzustellen, dass die Signallinearität stammt ausDie Gold-Nanopartikel selbst und nicht von dem Detektionssystem ist es erforderlich, den Anzeigewert innerhalb des dynamischen Bereichs zu halten. Die vierte kritische Faktor ist die mechanische Stabilität der Probe. Während der Nichtlinearität Charakterisierung ist es wesentlich, dass die Nanopartikel in der gleichen Brennebene bleibt. Axialdrift des Nanoteilchens oder der Probenplattform erheblich beeinträchtigen würde die Genauigkeit der Linearitätsbewertung. Daher beim Umgang mit Nanopartikeln, ist es wichtig, um Partikel, die nicht leicht zu bewegen weiß unter Lichtanregung zu finden. Andererseits ist es auch möglich, mit Proben von Lithographie gewachsen zu arbeiten. In diesem Fall ist Mikroskoptisch Stabilität der Hauptbegrenzungsfaktor. Es gibt Phasen mit Positionsrückkopplungssteuerung, die die Stabilität erheblich verbessern können. Alternativ kann, da Tischbewegung ist in der Regel sehr langsam (zB 1 & mgr; m in 10 min), ist es hilfreich, eine xyz 3D-Bildstapel zu erwerben, wie zum Beispiel 10 Bilder mit 100 nm axiale separation zwischen benachbarten Bildern, an jedem unterschiedlichen Intensitätswert. Dann während der Analysephase sollte die hellste Bild von jedem Stapel als repräsentatives Bild zu dieser Intensität gewählt werden.
Im Prinzip ist die Auflösung der Sättigung basierende Techniken, die SAX und gesättigter strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SSIM) 26 umfassen, zeigt keine Untergrenze, solange hoher Ordnung Nichtlinearität (hohe harmonischen Frequenzkomponenten) erreicht werden kann. Dennoch in der Praxis ist die Auflösung durch die Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) begrenzt, vor allem bei der Extraktion von höherer Ordnung harmonische Demodulationskomponenten. Es gibt einige Strategien, die SNR verbessern können. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Modulationsfrequenz stark beeinflusst die SNR 27. Es ist auch möglich, das SNR durch Berechnen des Intensitätsunterschieds zwischen nicht gesättigte und gesättigte Signale lediglich Extrahieren des gesättigten Signals (Manuskript in Vorbereitung) zu erweitern.
28-30, oderdurch Sättigung der Fluoreszenzemission 22,26,31. , Fluoreszenz zeigt jedoch eine intrinsische Problem der Photobleaching, vor allem unter starker Lichtbeleuchtung. Diese Studie zeigte, dass sättigbaren Streuung von GNSS ist eine vielversprechende Methode der Superauflösungsmikroskopie, da es keine Bleich Ausgabe 21. Verglichen mit früheren Studien mit SAX-Mikroskopie unter Verwendung Fluoreszenz, die Auflösungsverbesserung mit sättigbaren Streuung wurde bei dieser Untersuchung sehr viel höher, möglicherweise aufgrund der höheren Ordnung Linearität 22. Darüber hinaus können andere als SAX Mikroskopie, gibt es ein weiteres Superauflösungstechnik basierend auf Sättigungs: SSIM 26. SSIM nutzt räumliche Modulation der Fransen, um die nichtlineare Signale zu extrahieren, während SAX-Mikroskopie nutzt zeitliche Modulation. Mit der Sättigungseigenschaft dieses nicht bleichStreuung wird daher erwartet, dass diese Entdeckung kann mit SSIM kombiniert werden, um die räumliche Auflösung unter Weitfeld ill verbessernumination.
In zukünftigen Anwendungen wird diese plasmonic SAX Technik nützlich sein, nicht nur, um eine Resonanz-Modenverteilungen und Dynamik in plasmonic Schaltungen zu lösen, aber auch, um die Auflösung der biologischen Gewebebildgebung zu verbessern. Ähnliche Auflösungsverbesserung wurde mit anderen plasmonic Materialien wie Silber (unveröffentlicht), sowie nicht-Plasmonen Materialien wie Silizium 32 gezeigt. In der bildgebenden Bereich Super-Resolution hat SAX Mikroskopie Vorteile in mehrfacher Hinsicht. Verglichen mit stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie (Palm) hat SAX Mikroskopie eine schnellere Abtastgeschwindigkeit von nur ein paar Sekunden pro Bild. Im Vergleich zu stimulierte Emission (STED) Mikroskopie wird nur ein Laser zu SAX Mikroskopie erforderlich, eine signifikante Reduzierung der optischen Komplexität. Im Vergleich zu SSIM wird die Auflösung des SAX gleichzeitig in sowohl der lateralen und axialen Richtungen verbessert. Zusätzlich zuerzielen eine ausreichende Abbildungstiefe ist Zufallsstreuung entlang dem Strahlengang der Anregungs oder Sammel kritisch. Für Weitfeld-Techniken wie STORM, PALM und SSIM, werden die Bilder mit einer Kamera, die sehr anfällig für zufällige Streuung der emittierten Fluoreszenzphotonen in Geweben eingefangen. Für Punkt-Scan-Techniken wie STED und SAX werden die Fluoreszenzsignale von einem Punktdetektor aufgefangen, so dass sie robuster gegen Gewebestreuung sind. Dennoch STED erfordert eine Phasenplatte, einen Donut Strahlprofil im Brennpunkt zu erzeugen, und die Phaseninformationen können während der Strahlausbreitung im Gewebe beeinträchtigt. Daher sollte SAX-Mikroskopie die beste unter diesen Modalitäten für tiefe Gewebe superauflösende Bildgebung sein.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope body | Olympus, Japan | BX-51 | |
| objective lens | Olympus, Japan | UPlanSapo, 100X, NA 1.4 | |
| 80-nm gold colloid | BBI Solutions, UK | EM.GC80 | |
| supercontinuum laser | Fianium, United Kingdom | SC400-2-PP | |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, USA | BB1-E02 | |
| field emission SEM | JEOL, Japan | JSM-6330F | optional |
| spectrometer | Andor Technology, UK | Shamrock 163 | |
| charge-coupled device | Andor Technology, UK | iDus DV420A-OE | |
| acousto-optic modulators | IntraAction Corp., USA | AOM-402AF1 | |
| lock-in amplifier | Stanford Research Systems, USA | SR-830 | |
| MAS-coated slide glass | Matsunami Glass, Japan, | S9215 |
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