Introduction
Studiet av plasmonics har vakt stor interesse på grunn av sine programmer i mange ulike felt 1-4. En av de mest undersøkte felt i plasmonics er overflate plasmonics, i hvilken den kollektive svingning av lednings elektroner par med en ytre elektromagnetisk bølge ved et grensesnitt mellom et metall og dielektrikum. Overflate plasmonics har vært utforsket for sine potensielle bruksområder i Subwavelength optikk, biophotonics, og mikros 5,6. Den sterke feltøkning i det ultra-små volum av metallnanopartikler på grunn av lokaliserte overflate-plasmonresonans (LSPR) har tiltrukket seg stor oppmerksomhet, ikke bare på grunn av sin enestående følsomhet for partikkelstørrelser, partikkelformer, og de dielektriske egenskapene til det omgivende medium 7 -10, men også på grunn av sin evne til å øke iboende svake ikke-lineære optiske effekter 11. Den eksepsjonelle følsomheten LSPR er verdifullt for bio-sensing og nær-fyld avbildningsteknikker 12,13. På den annen side, kan den forbedrede ulineariteten Plasmonic strukturer benyttes i fotoniske integrerte kretser i applikasjoner som optisk svitsjing og alle optiske signalbehandlings 14,15. Det er vel kjent at plasmonic absorpsjonen er lineært proporsjonal med intensiteten eksitasjon ved lave intensitetsnivåer. Ved magnetisering er sterk nok, når absorpsjonen metning. Forbløffende nok på høyere intensiteter, øker absorpsjonen igjen. Disse ikke-lineære effekter kalles metningsabsorpsjon (SA) 15-17 og omvendt metningsabsorpsjon (RSA) 18, respektivt.
Det er kjent at på grunn av den LSPR, er spesielt sterk i Plasmonic strukturer spredning. Med utgangspunkt i de grunnleggende elektromagnetisme, bør responsen til spredning i forhold til innfallende intensitet være lineær. Men i nanopartikler, spredning og absorpsjon er nært bundet via Mie teori, og begge kan være expressed i form av reelle og imaginære deler av dielektrisk konstant. Under forutsetning av at en enkelt GNS oppfører seg som en dipol under lett belysning, kan spredningskoeffisienten (Q SCA) og absorpsjon koeffisient (Q abs) fra en enkelt plasmonic nanopartikkel ifølge Mie teori uttrykkes som 19
hvor x er 2 πa / λ, er radien av sfæren, og m er 2 ε m / ε d. Her, ε m og ε d tilsvarer de dielektriske konstanter i metallet og av de omkringliggende dielektrika, respektivt. Siden formen av spredningskoeffisienten er lik som the absorbsjonskoeffisient, er det derfor forventet å observere mettbar spredning i en enkelt plasmonic 20 nanopartikkel.
Nylig ble ikke-lineær mett spredning i et isolert plasmonic partikkel demonstrert for første gang 21. Det er bemerkelsesverdig at i dyp metning, spredning intensitet faktisk gått litt ned når eksitasjon intensiteten økes. Enda mer bemerkelsesverdig når magnetisering intensitet fortsatte å øke etter spredning ble mettet, steg spredningsintensitet på nytt, og viser effekten av omvendt mettbar spredning 20. Bølgelengde og størrelse avhengig studier har vist en sterk sammenheng mellom LSPR og ikke-lineær spredning 21. Intensitet og bølgelengde-avhengigheter av plasmonic spredning er meget lik de av absorpsjon, noe som tyder på en felles mekanisme ligger til grunn følgende ikke-lineære virkemåter.
Når det gjelder søknader, er det vel known som ulinearitet bidrar til å forbedre optisk mikroskopi oppløsning. I 2007, mettet eksitasjon (SAX) mikroskopi ble foreslått, noe som kan øke oppløsningen ved å klippe et mettet signal via en tidsmessig sinusmodulering av eksitasjon bjelke 22. SAX mikroskopi er basert på det konseptet at, for en laser fokalpunktet, er intensiteten sterkere i midten enn ved periferien. Hvis signalet (enten fluorescens eller spredning) utviser metnings oppførsel, må metnings starte fra sentrum, mens den lineære respons forblir i periferien. Derfor, hvis det er en metode for å ekstrahere bare den mettede del, vil det la kun den sentrale delen mens det avviser den periferiske del, og dermed effektivt å øke den romlige oppløsningen. I prinsippet er det ingen nedre grense oppløsning i SAX mikroskopi, så lenge lav metning er nådd, og det er ingen prøve skade på grunn av intens belysning.
Det har blitt vist at resolution av fluorescens avbildning kan bli betydelig forbedret ved anvendelse av SAX teknikk. Imidlertid lider fluorescens fra fotobleking effekt. Kombinere oppdagelsen av spredning ulinearitet og begrepet SAX, kan super-oppløsning mikroskopi basert på spredning realiseres 21. Sammenlignet med konvensjonelle super oppløsning microscopies, gir spredningsbasert teknikk et nytt ikke-kontrast blekemetode. I denne artikkelen er en steg-for-steg beskrivelse gitt å skissere de krav som stilles for å få tak i og trekke ulineariteten plasmonic spredning. Fremgangsmåter for identifisering av sprednings ulineariteter innført ved endring av innfallende intensitet, er beskrevet. Flere detaljer vil bli gitt for å løse hvordan disse ulineariteter påvirke bilder av enkeltnanopartikler og hvordan romlig oppløsning kan bli styrket tilsvar av SAX teknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. GNS Sample Preparation
- Før fremstilling av prøven, sonicate 1 ml GNS kolloid oppløsning i minst 15 minutter ved ca. 40 kHz for å hindre partikkelaggregering, noe som kan føre til at LSPR peak å skifte.
- Drop 100-200 ul GNS kolloid på et lysbilde glass med kommersiell magnesiumaluminiumsilikat (MAS) belegg for å fikse GNSS.
- Etter minst 1 min, fjerne den ekstra kolloid ved spyling med destillert vann. Ventetiden er avhengig av den ønskede fordelingstetthet av GNSS. Vanligvis 1-3 min resulterer i en passende tetthet som gjør at partiklene lett kan identifiseres, siden de fleste av dem er isolert fra hverandre. Betydelig aggregering kan oppstå hvis ventetiden er for lang.
- Tørk prøven ved spyling med nitrogengass.
- (Valgfritt) Hvis kartlegge GNSS på glasset med høy oppløsning, utføre scanning elektronmikroskopi (SEM) på dette stadiet 23. Et eksempel bilde er gitt i Figure 1, som viser den karakteristiske tettheten av GNSS. Bruk et felt emisjon SEM å hente bildet. Når oljen er lagt inn på prøven (neste trinn), vil det være vanskelig å fjerne oljen og observere prøven med SEM.
- Tilsette en dråpe olje med samme brytningsindeks på prøven for å dekke GNSS og for å eliminere sterke reflekser fra glass-substrat.
- Plasser et dekkglass på toppen av prøven og forsegle den med neglelakk.
- Vent minst 5 minutter før neglelakk tørker. Prøven er klar nå.
2. Justering av Home-bygget konfokalmikroskop
- Se figur 2 for ordningen med oppsettet. Juster hvitt lys belysning banen til mikroskopet kroppen selv. Slå på halogen lyskilde av mikroskopet, og følg mikroskop produsentens veiledning for å oppnå Köhler belysning tilstand. Sørg for at de hvite halogen lysstråler er nesten parallelt på baksiden avåpning av målet, delvis reflektert av strålesplitteren 50/50, og deretter forplante seg mot laseren.
- Slå på galvanospeil for å sikre at de forblir i riktig utgangsstilling, dvs. ved midten av skanneområdet.
- Plassere minst to mål, laget av et tynt papirark med konsentriske ringer på det, langs halogen lys banen, og justere dem med halogen strålen.
- For å utføre bildebehandling, velg 532 nm laser. For å utføre spektroskopi målinger, velg super-kontinuum laser. Under justering, bør strøm av lasere være mindre enn 10 μW på baksiden blenderåpning på objektivet for å unngå linearitet. Deretter kollimere innfallende laserstrålen på motsatt side til den utgående halogen bjelken ved hjelp av de to mål. Når denne prosessen er fullført, har grov innretting av laserstrålen er oppnådd.
- Juster laserstrålen gjennom midten av baksiden åpningen for objektivlinsen. Vanligvis bruker en oil-nedsenking objektiv. Legg en dråpe olje mellom olje-nedsenking objektiv og GNS prøven. Bruk et fotomultiplikatorrør (PMT) som detektor for å samle spredningssignalene til GNSS.
- Plasser en 20-mikrometer-diameter pinhole foran PMT å stenge ute av fokus spredning signaler. Slå på galvano speil og PMT (via hjemme-bygget programvare), justere pinhole posisjon og høyde av prøven scenen for å maksimere backscattering signaler om GNSS, og deretter observere en person GNS på en dataskjerm. En prøve xy bilde av GNSS med korrekt innretting er vist i figur 2B.
- Litt endre høyden av prøven trinnet for å kontrollere konsentrisitet av fokus. Hvis det ikke er konsentriske, juster strålen med de to speil i front av skanneren inntil midten av GNS forblir i samme posisjon, mens høyden av prøven trinnet endres. Kontroller at xz bildet av PSF er tilsvarende figur 2Cfor å sikre riktig strålejustering. Behandle disse to bildene med low-pass og Gaussian glatte filtre.
3. Karakterisering av spredning non-linearitet
- Ved lav eksitasjon intensitet (mindre enn 10 4 W / cm 2), erverve et bilde av gull nanopartikler ved å følge protokollen 2.6.
- Åpne bildet i ImageJ (eller annen programvare for bildeanalyse). Tegn en linje over en av GNSS i bildet (se figur 2B), og bruke Analyse -> Plot profil av ImageJ verktøy for å hente spredning intensitet profil. Monter av valgt PSF av en Gaussisk funksjon:
hvor y er en PMT avlesningsverdi, y er 0 til bakgrunnsverdi (hvis noen), A er toppamplituden, w er bredden, x er den romlig koordinat, og x c er sentrum KOORDINATe av den gaussiske funksjonen. Den FWHM av den tilsvarende PSF er (½ln2) w. Basert på den numeriske apertur (NA) av målet, kan den teoretiske FWHM av det konfokale PSF anslås til å være ca. 0.43l / NA, hvor l er eksitasjonsbølgelengden. Sammenligne disse to tallene for å sjekke justeringen av imaging system. - Øk eksitasjon intensiteten ved manuelt å endre nøytral tetthet (ND) filter i figur 2A, og registrere spredningsbilder på hvert intensitetsnivå. Ta verdien av spredning signal fra sentrum av hver GNS ved forskjellige intensiteter eksitasjon, og plotte kurven av spredningssignaler versus eksitasjon intensiteter. Sjekk linearitet av de første punktene, som skal stille ut en lineær sammenheng når eksitasjon intensitet er tilstrekkelig lav. Tegn en linje basert på lineær tilpasning av de første punktene. Dersom sprednings intensiteter av de etterfølgende punkter falle under dette lineær trend, saturation har oppstått.
- Etter å ha observert mett spredning, gradvis redusere intensiteten under metningsterskel og bilde samme GNSS på nytt for å sikre reversibilitet av de ikke-lineære atferd.
4. Måling av en adspredelse Spectrum av en enkelt Gold nanosphere
- For å måle backscattering spekteret fra en enkelt GNS, bruke super-kontinuum laser som laserkilden. Den innledende laserens bølgelengde i området fra 450 nm til 1750 nm. For å fjerne overskytende infrarøde kraft som kan føre til skade på prøven og de optiske komponenter, plassere en eller to speil rett etter super-kontinuum laser for å reflektere synlig lys, og bruk bjelke dumper for å samle opp overskytende infrarødt lys.
- Følg justerings prosedyrene i § 2 for å lede super-kontinuum laser inn i laserskanning confocal mikroskop. Bruk en bredbånds 50/50 BS å sikre spektral dekning over hele synlige området.
- Tilegne seg enbilde av GNSS på glass. Finn en GNS i bildet, og fikse fokus for hendelsen bredbånd lys på partikkelen.
- Bruk en blar speil foran PMT å lede backscattering signal mot spektrometeret, som er utstyrt med en CCD, og deretter ta et spektrum av de utvalgte enkelt GNS. Vær forsiktig at spekteret her er en blanding av GNS spredning og bakgrunn på grunn av refleksjoner fra andre overflater.
- Bytt tilbake til PMT detektoren, og ta et nytt bilde for å bekrefte at partikkel posisjonen ikke har endret seg. Deretter skifte fokus til et punkt hvor ingen partikkel er til stede. Bytte tilbake til det spektrometer, og ta en mer spektrum, som representerer bakgrunnen.
- Trekk fra bakgrunnsspektrum fra trinn 4.5 fra spekteret fra trinn 4,4 for å oppnå en klar tilbakespredning spektrum av en enkelt GNS.
5. Justering av SAX Microscope
- Se figur 3for ordningen av SAX mikroskop, hvor en ideell sinusformet temp modulasjon er hentet fra beat frekvens mellom to akustooptiske modulatorer (AOMs). Først justere størrelsen av laserstrålen for å møte kravet for de etterfølgende AOMs. Splitte 532 nm laserlys inn i to stråler ved hjelp av en 50/50 strålesplitter.
- Veilede de to stråler gjennom de to AOMs, En-bjelke som går gjennom hver AOM. De modulerende frekvenser for de to AOMs må være forskjellige. For eksempel kan en være 40,000 MHz og den andre på 40,010 MHz, hvilket gir en differansefrekvens på 10 kHz. Denne forskjellen frekvensen vil være den fundamentale modulasjonsfrekvensen f m for sax signaler.
- Ta første orden diffraktert bjelker fra begge AOMs, og kombinere de to bjelkene ved hjelp av en annen 50/50 stråledeler. Juster speilene etter AOMs å kollimere de to bjelker.
- Legg til en fotodetektor som er koblet til et oscilloskop for å overvåke den temporale modulation. Dele en liten del av laseren med et lysbilde glass, og sende den til fotodetektoren, slik det er vist i figur 3. Ved korrekt modulasjon og strålen overlappende, observere sinusintensitetsmodulering ved hovedfrekvensen f m, lik den av bølgeformen vist i figur 4.
Merk: Bakgrunnen for modulering må være så lav som mulig for å oppnå maksimal modulasjon dybde. I tillegg bruker den Fourier analyse funksjon av oscilloskop for å kontrollere at den harmoniske forvrengning av module avtar. For å oppnå vellykket SAX gjennomføring, sikre en perfekt sinusformet eksitasjon intensitet modulasjon med minimert innledende linearitet. - Frakoble den elektriske utgangssignalet fra fotodetektoren fra oscilloskopet og koble til referanseinngangen på en lock-in-forsterker.
- Som vist i figur 3, retter laserstrålen inn i det konfokale systemet i henhold til foregående protokoller. Here, koble den elektriske produksjonen av PMT til lock-in forsterker som signalinngang.
- Bruke en tom dekkglass som prøven, og kontroller lineariteten av den elektriske detektorsystem ved gradvis å øke magnetiseringseffekten ,, som vist i figur 5, der detektoren er lineært under en avlesningsverdi på 1-V. I alle etterfølgende målinger, ta vare å begrense avlesning til under denne verdien.
- Angi utgangen på lock-in-forsterker for å eksportere den absolutte størrelsen av spenningssignalet. Ved å endre innstillingen harmoniske komponenten i referansekanalen, oppnå amplitudene til signalene SAX, A 1, A 2, og så videre.
- Eksportere lineære og ikke-lineære signaler fra synkroniseringsforsterkeren til en datainnsamlingskort, som også mottar den drivende spenningssignalene for rasteravsøksmetoder Galvano speil. Ved hjelp av en tilpasset LabVIEW program, synkronisere signalene av lock-in forsterker oggalvano speil for å danne et bilde.
- For å optimalisere signal-til-støy-forhold i bildene, velger du riktig piksel oppkjøp og integrasjons ganger av lock-forsterker. For eksempel, når hoved modulasjonsfrekvensen f m av magnetisering er 10 kHz, det vil si når perioden er 100 usek, sett integrasjonstiden på lock-in-forsterker for å være minst tre ganger lenger enn perioden. Legge tidspunktet for galvano speil bevegelse, er oppkjøpet hastigheten satt til 1500 piksler per sekund i SAX avbildningsmodus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6 viser den målte spekteret fra en 80 nm GNS. En beregnet kurve basert på Mie teorien er gitt på samme tomten, som viser utmerket avtale. Den LSPR toppen er rundt 580 nm. I det følgende eksperiment, laser bølgelengde var 532 nm, som ble valgt som det ligger inne i plasmonic bandet å forbedre optisk spredning med plasmonic effekt og aktiver spredning metning 21.
Figur 7 presenterer spredning bilder av en enkelt gull nanopartikkel på ulike eksitasjon intensiteter, og den nederste raden gir linjen profilen til hver partikkel å markere ulineariteten. Bildestørrelsen er 600 nm × 600 nm, og pikselstørrelsen er 13,8 nm. Oppkjøpet hastighet var 234.000 piksler per sekund i normal xy avbildningsmodus. Hvert bilde er i gjennomsnitt på fem anskaffelser for å forbedre signal-til-støy-forholdet.
Når eksitasjon intensiteten er lavere enn1,5 x 10 6 W / cm 2, er sprednings lineært avhengig av eksitasjon intensitet, slik at det resulterende bildet av en enkelt nanopartikkel ligner PSF av eksitasjon strålen, med en standard gaussisk profil. Men når magnetisering intensiteten øker til 1,7 x 10 6 W / cm2, ikke bare tydelig flatere på toppen av PSF er observert, men også utvidelse av FWHM, noe som indikerer metning. Meget interessant på litt høyere intensiteter, blir det sentrale intensiteten lavere enn den perifere, noe som resulterer i en smultring-formet PSF. Deretter, som eksitasjon intensiteten fortsetter å øke, øker spredningsintensitet på nytt, avslører omvendt metning og som resulterer i en ny topp i sentrum av PSF.
Ved å plotte den sentrale intensiteter av PSFs ved forskjellige intensiteter eksitasjon, er spredningsintensiteten avhengighet oppnådd, som vist ved prikkene i figur 8. Denne kurven clearly avslører trender i metning og omvendt metnings atferd. Som forventet, det ser veldig lik intensiteten avhengighet av ikke-lineær absorpsjon 15-17. Ved å følge den typiske metode for å analysere ikke-lineær absorpsjon, ble en polynomisk funksjon som brukes for å passe til det ikke-lineære sprednings resultatet. Men forskjellig fra de fleste ikke-lineære absorpsjon studier, der tredje-order ulineariteten er tilstrekkelig til å modellere resultatene, her femte-order ulineariteten var nødvendig for å bedre passe spredning kurve.
Som nevnt i avsnittet 5, kan de harmoniske frekvenskomponentene bli eksperimentelt ekstraheres med en lock-in-forsterker, og resultatene er gitt i figur 9A. På den annen side kan de harmoniske komponentene beregnes fra figur 8. Bruk først en polynomisk funksjon, hvor I er intensiteten eksitasjon, for å passe til figur 8, slik at vi har de passende parametre α, β, γ .... Kan vi deretter uttrykke eksitasjonsparametrene intensligheten som temporært modulert funksjon I (t) = I 0 (1 + cos (2 πf m t)) / 2, hvor t er tiden, er f m modulasjonsfrekvensen, og I 0 er maksimal eksitasjon intensitet. Ved å erstatte I (t) til S (I), og foreta en Fourier-transformasjon for å omdanne det resulterende S (I (t)) til frekvensplanet, har vi følgende ligning består av flere deltafunksjoner (A):
Koeffisienten for hver deltafunksjon (0 A, A 1, A 2, etc.) betegner amplituden av SAX signal ved den tilhørende harmonisk frekvens. Disse koeffisientene, som tilsvarer de SAX signal styrker ved forskjellige harmoniske, kan skrives som funksjoner av de passende parametere a, p, γ ...:
Beregningsresultatene er vist i figur 9B. De eksperimentelle og beregnings tomter enig nøye, særlig i de følgende to aspekter.
Først kurvene 2 og 3 f m f m ikke er glatte, og viser dips ved bestemte intensiteter langs kurvene. I begge figurene er det tre fall i 2 K M kurver, mens to fall er sett i 3 K M kurver. Sekund, bakkene er forskjellige med ulike eksitasjon intensiteter. Når eksitasjon intensitet er ikke høy, i bakken av en f m, 2 f m, og 3 f m er 1, 2 og 3Hhv. Men etter hvert dukkert, bakkene i de tilsvarende lineære kurver blir større.
Med fall og skråningen variasjoner, er ukonvensjonelle PSFs forventet hvis de ulineære komponenter er hentet via SAX teknikk, når eksitasjon intensiteten øker over dips. Figur 10A viser SAX bilde eksempler på en f m, 2 f m, og 3 f m frekvens komponenter på ulike eksitasjon intensiteter. I den første rad, er den magnetisering intensitet 0,7 MW / cm2, som er tilstrekkelig til å indusere de ulineære komponenter, men amplituden er forholdsvis svak. På dette intensitetsnivå, er hellingen av to f m signal 2, og det er tre til tre f m-signal, som vist i figur 9A. Ved eksitasjon intensiteten øker til nivået for den første dyppe av to f m signal, sax bilder av tof m signal blir smultringformet, som vist i den andre raden i figur 10A. Både 1 f m og 3 K M bilder forbli fast, mens den FWHM på 3 f m PSF er betydelig mindre enn den for en f m signal, som åpenbarer bemerkelsesverdig forbedret oppløsning. Fra signalprofilen ved den lengst til høyre panel av samme rad, FWHM av to f m bolle ring er omtrent 110 nm. På den annen side viser den tredje raden av figur 10A at når eksitasjon intensiteten øker til den første dyppe av 3 f m-signalet, blir bare de tre f m bilde smultringformet, med en 65 nm ringbredde. På denne intensiteten, er bemerkelsesverdig oppløsning forbedring når man sammenligner de to f m signal til en f m en.
Tallene 10B og 10C viser den beregnede PSFs av to f m og 3 m f-signaler, henholdsvis, på de tilsvarende intensiteter som resulterer i bolle former. Beregningene er basert på polynomet montering kurven i figur 9B. De beregnede kurvene godt reprodusere funksjonene i de eksperimentelle PSFs i lengst til høyre paneler i figur 10A, bekrefter igjen egnetheten av en femte-order eksakt tilpasning for den ikke-lineære spredning.
Figur 1. SEM-bilde av GNSS. Ved å utføre de fremstillingsprosesser som er beskrevet i den første del av protokollen, atskilt tilstrekkelig GNSS er observert. Med mer enn 100 nm mellom GNSS, deres LSPR virkninger som ikke er koplet til hverandre. Skala:. 100 nm Klikk her for å seen større versjon av dette tallet.
Figur 2. (A) Oppsett av hjemmebygde konfokalmikroskop 24. (B) xy bilde med GNSS på fokus. 2 (c).: Xz bilde av PSF med korrekt innretting Det er to laserkilder for dette systemet. Det ene er et 532 nm kontinuerlig-bølge laser, og den andre er en pulset super-kontinuum laser. Ved måling av spredningssignalene, ble en 532 nm kontinuerlig-bølge laser benyttes som kilde og en PMT som detektoren (med en laserlinjefilter satt inn). For å måle spekteret, ble en super-kontinuum laseren fastsettes som den laserkilde og et spektrometer som detektoren. Den valgte laser blir sendt gjennom et sett med nøytral tetthet filter for å styre eksiteringen intensitet. En 50/50 strålesplitteren styrer laser inn i mikroskop og tillater halvparten av de bakoverspredningssignalene inn i detPM T eller spektrometeret, som er valgt av en bla speil. I skannesystemet, er det to Galvano speil som danner vertikal og horisontal skanning raster i fokalplanet til et mål. Den bakoversprednings oppsamles ved den samme objektiv og omdannes til elektriske signaler ved hjelp av detektorene. Signalene blir synkronisert med konfokal skannesystemet til å danne bilder. PI scenen ble brukt til å erverve xz bildet ved å flytte den GNSS aksialt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Innstilling av SAX mikroskopi. De fleste komponentene er de samme som de som er oppnådd fra et konfokalt mikroskop (rødt rektangel), men sinusformet modulasjon ble tilsatt til eksitasjon laserstrålen. Blå firkant viser modulator oppsett. Først ble magnetisering laser deles i to stråler og sendes hver for seg gjennom to AOMs å frembringe høyfrekvente modulasjoner med litt forskjellige frekvenser. Deretter ble de to modulbjelker kombineres for å produsere sinusformet modulasjon på valdet frekvens mellom de to AOMs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Modulering av kombinerte stråler etter AOMs målt ved oscilloskop. Y1 og Y2 indikerer maksimum (52,1 mW) og minimum (1,2 mW) verdier av modulasjon intensitet, respektivt. Y2 bør være null for å oppnå perfekt modulasjon. Nåværende modulasjonsfrekvens var 10 kHz. Klikk her for å se et stortr versjon av denne figuren.
Figur 5. Linearitet test av deteksjonssystemet. Ved å plassere et dekkglass på fokalplanet, ble refleksjonen av lasers magnetisering fra glass / luft-grenseflaten benyttes for å kontrollere linearitet av deteksjonssystemet. Signalutgangen versus eksitasjon intensitet viser linearitet under en avlesningsverdi på 1-V. Videre er støynivået godt under 10 -4 V, slik at systemet gir et dynamisk område på minst 10 fire. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Spredning spektrum av 80 nm GNS. Røde prikker angir experimental målinger, og svarte linjen viser beregningen fra Mie teori. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Sprednings bilder av GNS fra lineær å reversere metning. Top rad viser backscattering bilder og nederste raden gir signal profiler av valgt nanopartikkel på ulike eksitasjon intensiteter. Overgang fra linearitet til metning å reversere metning er klart observert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Spredning intensitetversus eksitasjon intensitet fra enkle GNS. blå prikker tilsvarer spredning intensiteter på midten av PSF på ulike eksitasjon intensiteter, som viser svært lineære responser, inkludert metning og omvendt metning. Røde kurven viser fit kurve basert på femte-order polynomfunksjonen. (Bilder gjengitt fra Ref. 25.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9. Intensity dependences av SAX signaler i henhold til (A) eksperiment og (B) beregningen. (A) SAX signalene ble hentet av lock-forsterker, og hver eksperimentelle data punktet ble i gjennomsnitt over fire 80 nm GNSS. Stiplede linjer viser bakken av SAX signaler 25. (B) Etter protokoll 5, SAX signals ble beregnet basert på femte-order eksakt tilpasning i Figur 8. (Bilder gjengitt fra Ref. 25) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10. SAX bilder på ulike eksitasjon intensiteter. (A) Eksperimentelt observert en f m, 2 f m, og 3 f m SAX bilder på ulike eksitasjon intensiteter. Pikselstørrelse er 20 nm, og hver bildestørrelsen er 750 nm × 750 nm. Intensitet profiler av donuts på to f m og 3 f m er plottet i lengst til høyre panel. (B) Beregnet bilde profilen til to f m bilde på 0,75 MW / cm 2. Image profil (C) Beregnet av tre f </ em> m image på 1,1 MW / cm 2. (Bilder gjengitt fra Ref. 25.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I protokollen, er det flere viktige trinn. Først ved fremstilling av prøvene, tettheten av nanopartikler bør ikke være for høy, for å unngå plasmonic kopling mellom partikler. Hvis to eller flere partikler er meget nær hverandre, koblings resultatene i LSPR bølgelengde forskyvning mot lengre bølgelengder, noe som i betydelig grad reduserer ulineariteten. Men dette avbildningsteknikk faktisk kart fordeling av Plasmonic modi, i stedet for selve partiklene. Derfor er det forventet at med en passende eksiteringsbølgelengde, kan de sammenkoblede Plasmonic modiene viser også sterk spredning ulinearitet og kan avbildes med forbedret oppløsning. For det andre er det svært viktig å produsere ren sinusformet modulasjon i eksitasjon strålen, og dermed motivere bruken av å slå mellom de to AOMs. Etter oppløsning forbedring er avhengig av å ekstrahere ikke-lineære deler (harmoniske frekvenskomponenter) av sprednings signalmodulasjon, hvis ikke-lineæreforvrengningen er tilstede i den eksitasjon modulasjon, og deretter utvinning blir vanskeligere. I tillegg, i den nåværende ordning er et interferometer oppsett brukes til å produsere det bankende modulasjon, slik at justeringen av de to stråler i interferometeret er også avgjørende for å oppnå en så stor av en modulasjonsdybde som mulig. For det tredje, er det svært viktig å sikre at signalet ulineariteten ikke oppstår fra deteksjonssystemet (som inkluderer detektor, forsterker, A / D-omformeren, og datamaskinen I / O). Derfor er spesiell oppmerksomhet er nødvendig for å garantere at deteksjonssystemet arbeider innenfor det dynamiske området. Det dynamiske området er definert som det området av deteksjonssystemet linearitet, det vil si fra støynivået til detektoren metning. I det gjeldende tilfelle er det detekterte spenningssignal lineært under en V, og støynivået er under 10 -4 V. Derfor gir systemet et dynamisk område på minst 10 4. For å sikre at signalet som kommer fra linearitetgull nanopartikkel i seg selv, ikke fra deteksjonssystemet, er det nødvendig å opprettholde avlesningsverdien innenfor det dynamiske området. Den fjerde kritiske faktor er den mekaniske stabiliteten av prøven. Under ulineariteten karakteriseringen, er det viktig at nanopartiklene forblir i samme fokalplan. Aksial drift av nanopartikkel eller prøvetrinnet ville alvorlig påvirke nøyaktigheten av ulineariteten vurderingen. Derfor, når man arbeider med nanopartikler, er det viktig å finne partikler som ikke lett bevege seg rundt under lett magnetisering. På den annen side er det også mulig å arbeide med prøver dyrket fra litografi. I dette tilfellet er mikroskopisk stadium stabilitet hoved begrensende faktor. Det er etapper med posisjon tilbakemeldinger kontroll som i stor grad kan forbedre stabiliteten. Alternativt, siden scenen bevegelsen er vanligvis svært treg (for eksempel en mikrometer i 10 min), er det nyttig å skaffe seg et xyz 3D-bilde stabelen, for eksempel 10 bilder med 100 nm aksial separasjonn mellom tilstøtende bilder i hver forskjellig intensitetsverdi. Deretter i analysetrinnet, bør den klareste bilde av hver stabel velges som representant bilde på den intensitet.
I prinsippet oppløsningen av metningsbasert teknikk, som inkluderer SAX og mettet strukturert-lys mikroskopi (SSIM) 26 oppviser ingen nedre grense, så lenge høyere ordens ulineariteten (høye harmoniske frekvenskomponenter) kan oppnås. Likevel, i praksis, blir oppløsningen begrenset av signal-til-støy-forhold (SNR), spesielt når ekstrahering av høyere orden harmoniske demodulerte komponenter. Det er noen strategier som kan forbedre SNR. For eksempel har det blitt vist at modulasjonsfrekvensen alvorlig påvirker SNR 27. Det er også mulig å forbedre SNR ved å beregne intensiteten forskjellen mellom ikke-mettet og mettet signaler for å trekke ut bare mettede signal (manuskript under forberedelse).
28-30, ellerved metning av fluorescensemisjon 22,26,31. Imidlertid viser fluorescens en iboende problem av foto-bleking, spesielt under sterkt lys belysning. Denne studien viste at mett spredning av GNSS er en lovende metode for super-oppløsning mikroskopi siden det er ingen bleking problem 21. Sammenlignet med tidligere studier av SAX mikros utnytte fluorescens, oppløsningen forbedring med mett spredning var mye høyere i denne undersøkelsen, muligens på grunn av høyere ordens ulinearitet 22. I tillegg er andre enn SAX mikroskopi, er det en annen super-oppløsning teknikk basert på metning: SSIM 26. SSIM utnytter romlig modulering av frynser for å trekke ut de ikke-lineære signaler, mens SAX mikros benytter timemodulering. Med metning egenskap av denne ikke-bleking spredning, er det derfor forventet at denne oppdagelse kan kombineres med SSIM for å forbedre romlig oppløsning i vidvinkel illumination.
I fremtidige anvendelser vil denne plasmonic SAX teknikken være nyttig ikke bare for å løse resonans-modus-distribusjoner og dynamikk i Plasmonic kretser, men også for å forbedre oppløsningen av biologisk vev avbildning. Lignende forbedret oppløsning har blitt demonstrert med andre Plasmonic materialer slik som sølv (upublisert), så vel som ikke-Plasmonic materiale, for eksempel silisium 32. I super-oppløsning bildefelt, har SAX mikros fordeler i flere henseender. Sammenlignet med stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM) og foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM), har SAX mikros en raskere skanning hastighet på bare noen få sekunder per bilde. Sammenlignet med stimulert emisjon uttømming (STED) mikroskopi, er bare en laser som kreves for SAX mikroskopi, noe som reduserer den optiske kompleksitet. Sammenlignet med SSIM, er oppløsningen på SAX samtidig forbedret i både laterale og aksiale retninger. I tillegg tiloppnå tilstrekkelig avbildningsdybden, er tilfeldig spredning langs strålebanen av eksitasjon eller samling kritisk. For wide-feltteknikker som STORM, PALM, og SSIM, er bilder tatt med et kamera, som er svært utsatt for tilfeldig spredning av utsendte fluorescens fotoner i vev. For punkt-scan teknikker som STED og SAX, blir fluorescenssignaler samlet ved et punkt detektor, slik at de er mer robust mot vev spredning. Ikke desto mindre krever STED en faseplate for å lage en smultringbjelkeprofil i fokus, og den faseinformasjon kan bli forringet under stråleforplantning i vev. Derfor bør SAX mikros være den beste blant disse modaliteter for dyp vev super-oppløsning imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope body | Olympus, Japan | BX-51 | |
| objective lens | Olympus, Japan | UPlanSapo, 100X, NA 1.4 | |
| 80-nm gold colloid | BBI Solutions, UK | EM.GC80 | |
| supercontinuum laser | Fianium, United Kingdom | SC400-2-PP | |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, USA | BB1-E02 | |
| field emission SEM | JEOL, Japan | JSM-6330F | optional |
| spectrometer | Andor Technology, UK | Shamrock 163 | |
| charge-coupled device | Andor Technology, UK | iDus DV420A-OE | |
| acousto-optic modulators | IntraAction Corp., USA | AOM-402AF1 | |
| lock-in amplifier | Stanford Research Systems, USA | SR-830 | |
| MAS-coated slide glass | Matsunami Glass, Japan, | S9215 |
References
- Fang, N., Lee, H., Sun, C., Zhang, X. Sub-diffraction-limited optical imaging with a silver superlens. Science. 308 (5721), 534-537 (2005).
- Lee, B., Kim, S., Kim, H., Lim, Y. The use of plasmonics in light beaming and focusing. 34 (2), 47-87 (2010).
- Lal, S., Link, S., Halas, N. J. Nano-optics from sensing to waveguiding. Nature Photon. 1 (11), 641-648 (2007).
- Kawata, S., Inouye, Y., Verma, P. Plasmonics for near-field nano-imaging and superlensing. Nature Photon. 3 (7), 388-394 (2009).
- Homola, J., Yee, S. S., Gauglitz, G. Surface plasmon resonance sensors: review. Sensor. Actuat. B-Chem. 54 ((1-2)), 3-15 (1999).
- Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
- Hache, F., Ricard, D., Flytzanis, C. Optical nonlinearities of small metal particles - surface-mediated resonance and quantum size effects. J. Opt. Soc. Am. B. 3 (12), 1647-1655 (1986).
- Balamurugan, B., Maruyama, T. Evidence of an enhanced interband absorption in Au nanoparticles: Size-dependent electronic structure and optical properties. Applied Physics Letters. 87 (14), 143105 (2005).
- Link, S., El-Sayed, M. A. Size and temperature dependence of the plasmon absorption of colloidal gold nanoparticles. J. Phys. Chem. B. 103 (21), 4212-4217 (1999).
- Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment. J. Phys. Chem B. 107 (3), 668-677 (2003).
- Kauranen, M., Zayats, A. V. Nonlinear plasmonics. Nature Photon. 6 (11), 737-748 (2012).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Au nanoparticles target cancer. Nano Today. 2 (1), 18-29 (2007).
- Wada, O. Femtosecond all-optical devices for ultrafast communication and signal processing. New J. Phys. 6 (183), Forthcoming.
- Elim, H. I., Yang, J., Lee, J. Y., Mi, J., Ji, W. Observation of saturable and reverse-saturable absorption at longitudinal surface plasmon resonance in gold nanorods. Appl. Phys. Lett. 88 (8), 083107 (2006).
- Ros, I., Schiavuta, P., Bello, V., Mattei, G., Bozio, R. Femtosecond nonlinear absorption of gold nanoshells at surface plasmon resonance. Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (41), 13692-13698 (2010).
- De Boni, L., Wood, E. L., Toro, C., Hernandez, F. E. Optical Saturable Absorption in Gold Nanoparticles. Plasmonics. 3 (4), 171-176 (2008).
- Gurudas, U., et al. Saturable and reverse saturable absorption in silver nanodots at 532 nm using picosecond laser pulses. J. Appl. Phys. 104 (7), 073107 (2008).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and scattering of light by small particles. , John Wiley & Sons Inc. (1983).
- Chu, S. W., et al. Saturation and reverse saturation of scattering in a single plasmonic nanoparticle. ACS Photon. 1 (1), 32-37 (2014).
- Chu, S. W., et al. Measurement of a saturated emission of optical radiation from gold nanoparticles: application to an ultrahigh resolution microscope. Phys. Rev. Lett. 112 (1), 017402 (2014).
- Fujita, K., Kobayashi, M., Kawano, S., Yamanaka, M., Kawata, S. High-resolution confocal microscopy by saturated excitation of fluorescence. Phys. Rev. Lett. 99 (22), 228105 (2007).
- Smith, K. C. A., Oatley, C. W. The scanning electron microscope and its fields of application. Brit. J.Appl. Phys. 6 (11), (1955).
- Yu, J. Y., et al. A diffraction-limited scanning system providing broad spectral range for laser scanning microscopy. Rev. Sci. Instru. 80 (11), 113704 (2009).
- Lee, H., et al. Point spread function analysis with saturable and reverse saturable scattering. Opt. Express. 22 (21), 26016-26022 (2014).
- Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Yonemaru, Y., Yamanaka, M., Smith, N. I., Kawata, S., Fujita, K. Saturated Excitation Microscopy with Optimized Excitation Modulation. ChemPhysChem. 15 (4), 743-749 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Heintzmann, R., Jovin, T. M., Cremer, C. Saturated patterned excitation microscopy - a concept for optical resolution improvement. J. Opt. Soc. Am. A. 19 (8), 1599-1609 (2002).
- Tzang, O., Pevzner, A., Marvel, R. E., Haglund, R. F., Cheshnovsky, O. Super-Resolution in Label-Free Photomodulated Reflectivity. Nano Lett. 15 (2), 1362-1367 (2015).
