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Biology

Multifunctional, छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayers में बैक्टीरियल Mechanosensitive आयन चैनल का समावेश और उत्तेजना के लिए विधि Micropipette आधारित

Published: November 19, 2015 doi: 10.3791/53362
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 3, 4
1Department of Mechanical Engineering, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biology, University of Maryland, 4College of Engineering, University of Georgia, 5Department of Engineering Sciences and Mechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

बैक्टीरियल mechanosensitive चैनलों biomolecular उपकरणों में mechanoelectrical transducers के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। छोटी बूंद इंटरफेस bilayers (dibs), इस तरह के उपकरणों के लिए सेल से प्रेरित इमारत ब्लॉकों को शामिल करने और mechanosensitive चैनलों को प्रोत्साहित करने के लिए नए प्लेटफार्म का प्रतिनिधित्व करते हैं। यहाँ, हम, dibs गठन यांत्रिक उत्तेजना के तहत mechanosensitive चैनलों के अध्ययन की अनुमति का एक नया micropipette आधारित विधि का प्रदर्शन।

Abstract

MSCL, एक बड़े प्रवाहकत्त्व mechanosensitive चैनल (एमएससी), बैक्टीरिया अचानक हाइपो-आसमाटिक झटके जीवित रहने में मदद करता है कि एक सर्वव्यापी osmolyte रिलीज वाल्व है। यह खोज की है और कड़ाई से लगभग तीन दशकों के लिए पैच दबाना तकनीक का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। पारगम्यता प्रतिक्रिया में कोशिका झिल्ली के लिए लागू तनाव का अनुवाद करने के अपने बुनियादी भूमिका यह कृत्रिम झिल्ली आधारित biomolecular उपकरणों में एक mechanoelectrical ट्रांसड्यूसर के रूप में कार्य करने के लिए एक मजबूत उम्मीदवार बनाती है। इस तरह के उपकरणों के लिए ब्लॉकों इमारत के रूप में कार्य करना, छोटी बूंद इंटरफेस bilayers (dibs) MSCL चैनलों के समावेश और उत्तेजना के लिए एक नया मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम शामिल MSCL चैनलों की गतिविधि dibs फार्म और मापने के लिए एक micropipette आधारित विधि का वर्णन है। इस विधि के दो परस्पर विरोधी (coaxially तैनात) borosilicate ग्लास micropipettes के सुझावों के लिए लंगर लिपिड encased जलीय बूंदों के होते हैं। बूंदों संपर्क में लाया जाता है, जब एक लिपिड bilayer इंटरफेस हैका गठन किया। इस तकनीक को रासायनिक संरचना और प्रत्येक छोटी बूंद के आकार पर नियंत्रण, साथ ही बाईलेयर इंटरफेस के आयाम प्रदान करता है। एक हार्मोनिक पीजोइलेक्ट्रिक क्रियाकारक से जुड़ी micropipettes के एक के बाद एक वांछित oscillatory प्रोत्साहन देने की क्षमता प्रदान करता है। विरूपण के दौरान बूंदों के आकार के विश्लेषण के माध्यम से, इंटरफेस में बनाया तनाव का अनुमान लगाया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करना, एक डीआईबी प्रणाली में MSCL चैनलों की पहली गतिविधि की सूचना दी है। एमएस चैनलों के अलावा, चैनलों के अन्य प्रकार की गतिविधियों को इस मंच की बहु कार्यशीलता साबित हो रही है, इस विधि का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है। यहाँ प्रस्तुत विधि, मौलिक झिल्ली गुणों की माप के लिए सक्षम बनाता है सममित और असममित झिल्ली के गठन पर अधिक नियंत्रण प्रदान करता है, और उत्तेजित और mechanosensitive चैनलों का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका है।

Introduction

पिछले दशक में, कृत्रिम लिपिड bilayers की विधानसभा में काफी छोटी बूंद इंटरफेस बाईलेयर पद्धति के विकास के माध्यम से उन्नत किया गया है। स्थिर और मजबूत के रूप में जाना जाता है, dibs (मुलर) चित्रित शास्त्रीय और मुड़ा (Montal-मुलर) तलीय bilayers 1 करने के लिए वैकल्पिक मॉडल प्रणाली के रूप में खुद को भी लगाया। लिपिड bilayers बनाने के लिए बूंदों का उपयोग करने का विचार वापस 1960 के दशक 2 करने के लिए तारीखें हालांकि, यह हाल ही में जब तक लोकप्रियता प्राप्त नहीं हुआ है। पहला सफल प्रयास बारले समूह 4-6 से बूंदों के एक नेटवर्क का उपयोग कर बाईलेयर गठन का प्रदर्शन कई अध्ययनों से पीछा Takeushi समूह 3, द्वारा सूचना मिली थी। हाल ही में, encapsulation तकनीक उपन्यास उत्तेजनाओं उत्तरदायी सामग्री प्रणालियों के 10 ब्लॉकों इमारत के रूप dibs उपयोग की अवधारणा जो बीड़ा सिंह समूह 7-9, द्वारा प्रस्तावित किया गया। पिछले अध्ययनों में, dibs बिजली 9,11, केम के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता साबित कर दिया है10,12 राजनैतिक, और ऑप्टिकल उत्तेजनाओं 13। डीआईबी 10,14 में पुनर्गठन जब विभिन्न उत्तेजनाओं उत्तरदायी functionalities के साथ विभिन्न जैवअणुओं प्रभावी रूप से प्रेरित किया गया है। एक महत्वपूर्ण सवाल उठाया है कि इन सफल प्रयास के प्रकाश में: यांत्रिक प्रोत्साहन के लिए डीआईबी जब जवाब उचित जैवअणुओं शामिल कर रहे हैं हो सकता है? एक डीआईबी पर अभिनय इंटरफेसियल बलों अन्य बाईलेयर सिस्टम 15,16 में उन लोगों से भिन्न होते हैं। इसलिए, बूंदों से आयोजित bilayer में तनाव पानी लिपिड तेल इंटरफेस में तनाव के विनियमन के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है; पेंट या मुड़ा बाईलेयर सिस्टम के साथ लागू नहीं एक अवधारणा।

व्यापक रूप से osmolyte रिलीज वाल्व और बैक्टीरियल साइटोप्लास्मिक झिल्ली के मौलिक तत्वों के रूप में जाना जाता है MSCL चैनलों, वृद्धि हुई झिल्ली तनाव 17,18 के लिए प्रतिक्रिया। हाइपो-आसमाटिक झटके की घटना में, कई चैनलों के एक छोटे से सेल की झिल्ली में रहने वाले 19 एक मास उत्पन्न कर सकते हैंनिर्णायक पारगम्यता प्रतिक्रिया जल्दी सेल 20 से बैक्टीरिया बचत, आयनों और छोटे अणुओं जारी करने के लिए। Biophysically, MSCL अच्छी तरह से अध्ययन किया है और प्रमुख पैच दबाना तकनीक 21-23 के माध्यम से मुख्य रूप से होती है। MSCL के gating तंत्र 24,25 समझा विश्वसनीय संरचनात्मक मॉडल अपने homolog के क्रिस्टल 28 मॉडलिंग संरचना 26,27, और व्यापक प्रयोग 24,29-31 के परिणामों के आधार पर प्रस्तावित है। ~ के एक आवेदन तनाव के तहत 10 करोड़ / मी, ट्रांसमेम्ब्रेन सर्पिलों की एक तंग बंडल के होते हैं जो बंद चैनल, एक ~ 28 एक पानी से भरे प्रवाहकीय ताकना 21,24,32 बनाने में काफी झुका सर्पिलों की एक अंगूठी में बदल देती है। यह भी आंतरिक TM1 डोमेन के चौराहे पर तैनात तंग फाटक के hydrophobicity, चैनल 33 के सक्रियण सीमा निर्धारित करता है कि स्थापित किया गया है। तदनुसार, यह पाया गया कि फाटक के hydrophobicity कम करके, tensioएन सीमा 22 से कम किया जा सकता है। MSCL की इस संपत्ति मुख्य रूप से दवा वितरण उद्देश्यों के लिए, विभिन्न चलाया हुआ वाल्व 34 के डिजाइन संभव बनाया। सभी aforementioned संपत्तियों के लिए और electrophysiological गतिविधियों में कोशिका झिल्ली अत्यधिक तनाव का अनुवाद करने में अपनी मौलिक भूमिका पर आधारित, MSCL dibs में एक mechanoelectrical ट्रांसड्यूसर के रूप में एक महान फिट बनाता है।

इस अनुच्छेद में, हम यांत्रिक उत्तेजना के तहत शामिल MSCL चैनलों की गतिविधि dibs फार्म और मापने के लिए एक मूल micropipette आधारित तरीका मौजूद है। हम पहली बार के लिए यांत्रिक प्रोत्साहन और dibs 35 में MSCL की V23T कम दहलीज उत्परिवर्ती के कार्यात्मक पुनर्गठन करने के लिए dibs की प्रतिक्रिया रिपोर्ट।

प्रायोगिक प्रणाली दो परस्पर विरोधी borosilicate ग्लास micropipettes के सुझावों के लिए लंगर लिपिड encased जलीय बूंदों के होते हैं। बूंदों संपर्क में लाया जाता है जब एक लिपिड bilayer इंटरफेस के लिए हैrmed। इस तकनीक में एक छोटी बूंद (थोक) की रासायनिक संरचना और आकार पर नियंत्रण, साथ ही बाईलेयर इंटरफेस के आयाम प्रदान करता है। इसके अलावा, प्रत्येक पत्रक में विभिन्न लिपिड रचनाओं के साथ असममित झिल्ली आसानी से गठित किया जा सकता है। एक हार्मोनिक पीजोइलेक्ट्रिक क्रियाकारक से जुड़ी micropipettes के एक के बाद एक पूर्व क्रमादेशित एकल चक्र या oscillatory प्रोत्साहन लागू करने की क्षमता प्रदान करता है। तनाव इसका समर्थन दोनों बूंदों के संपीड़न के माध्यम से कृत्रिम झिल्ली को दिया है। छोटी बूंद विरूपण का एक परिणाम के रूप में, पानी-लिपिड तेल इंटरफेस वृद्धि हुई है, और साथ ही साथ बूंदों के बीच कोण के क्षेत्रों झिल्ली तनाव और क्षणिक MSCL सक्रियण में वृद्धि के कारण कम हो जाती है। विरूपण के दौरान बूंदों के आकार के विश्लेषण के माध्यम से, इंटरफेस में बनाया तनाव का अनुमान लगाया जा सकता है। इस लेख में ध्यान डीआईबी के Mechano पारगमन गुणों पर है, भले ही हम यह भी जोर है कि अन्य प्रकार की जैवऐसे alamethicin के रूप में अणुओं, इस बहुआयामी मंच से सक्रिय किया जा सकता है। हम तैयारी संयोजन, और एक कदम-दर-कदम तरीके से इस नई विधि के साथ माप लेने के सभी तकनीकी पहलुओं को, यहाँ प्रस्तुत करते हैं।

Protocol

खूंटी-डीएमए hydrogels के 1. तैयारी

  1. आवेदन के लिए एक उपयुक्त मापने / मिश्रण कंटेनर (फ्लास्क, बीकर, आदि।) का चयन करें। साबुन और पानी का उपयोग कर इसे अच्छी तरह से साफ करें, और उसके बाद प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक वाइपर से पोंछ।
  2. उंगलियों से तेलों के साथ कांच के बने पदार्थ दूषित से बचने के लिए दस्ताने पहनें। डिटर्जेंट अवशेषों को हटाने के लिए पर्याप्त विआयनीकृत पानी के साथ कंटेनर कुल्ला।
  3. फिर, पानी से छुटकारा पाने के isopropyl शराब (आईपीए, 99.5%) के साथ स्प्रे और स्वच्छ जब तक सफाया करने के लिए एक प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक के साथ कंटेनर साफ कर लें। सभी आईपीए पूरी तरह से लुप्त हो जाना करने की अनुमति के लिए एक निर्वात चैम्बर में जगह है। आसुत जल से हाइड्रोजेल के गठन की प्रक्रिया में इस्तेमाल प्रयोगशाला उपकरणों के बाकी साफ करें।
  4. एक प्रयोगशाला पैमाने का उपयोग बहुलक, पाली (ईथीलीन- ग्लाइकोल) dimethacrylate (मेगावाट = 1000 ग्राम / मोल खूंटी-डीएमए) के 4 ग्राम वजन, खूंटी-डीएमए हाइड्रोजेल समाधान (वी / डब्ल्यू) एक 40% तैयार करने के लिए।
  5. 4 में एक sonicator स्नान का उपयोग कर फ्लास्क और गर्मी में तौला खूंटी-डीएमए रखेंठोस खूंटी-डीएमए तक 5-55 डिग्री सेल्सियस तरलीकृत गया है। प्रक्रिया के दौरान, पानी को बाहर रखने के लिए Parafilm / मोम पेपर के साथ कुप्पी के उद्घाटन को कवर किया।
  6. खूंटी-डीएमए द्रवीभूत हो जाने के बाद, बफर समाधान (500 मिमी KCl, 10 मिमी mops, पीएच 7.0) कुल मात्रा ~ (एक छह महीने की अवधि में कई प्रयोगों के लिए पर्याप्त) 10 मिलीलीटर तक पहुँचता जोड़ें।
  7. 0.5% पर इलाज एजेंट जोड़ें (w / v)। इस मामले में, 10 मिलीलीटर मिश्रण करने के लिए इलाज एजेंट की 0.05 ग्राम जोड़ें। वापस sonicator स्नान में कुप्पी की जगह और घटकों (10 मिनट, 250 वाट के आसपास) के घोल में भंग करने के लिए अनुमति देते हैं।

नोट: इलाज एजेंट समाधान के लिए जोड़ा गया है एक बार समय की एक पर्याप्त राशि के लिए किसी भी प्रकाश स्रोत के संपर्क में हैं, तो हाइड्रोजेल (जमना) का इलाज करेंगे। इस लड़ाई में मदद करने के लिए, काले टेप के साथ शीशी / कंटेनर लपेट और एक अंधेरी जगह में यह दुकान। यह समाधान कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर कई हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है।

Lipos की 2. तैयारीOMES

  1. 1,2-diphytanoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine (DPhPC) सिंथेटिक के 20 मिलीग्राम के लिए बफर के 10 एमएल (500 मिमी KCl, 10 मिमी mops, पीएच 7.0) को जोड़कर एक 2 मिलीग्राम / एमएल लिपिड समाधान के 10 मिलीलीटर की तैयारी लिपिड lyophilized पाउडर के रूप में खरीदा। सुनिश्चित करें कि दोनों लिपिड vesicles और बफर समाधान अच्छी तरह से (सब कुछ भंग कर रहा है जब मिश्रण समरूप और धुंधला दिखना चाहिए) मिश्रित कर रहे हैं बनाओ।
  2. फ्रीज (-20 डिग्री सेल्सियस) और पूरी तरह से छह गुना की कुल के लिए नई लिपिड मिश्रण पिघलना। कभी नहीं एक गर्म वातावरण में, कमरे के तापमान पर मिश्रण पिघलना करते हैं।
  3. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बाहर निकालना का उपयोग करना, एक 0.1 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से पहली बार एक 0.4 माइक्रोन polycarbonate झिल्ली फिल्टर के माध्यम से और उसके बाद छह बार पूरे लिपिड निलंबन मजबूर द्वारा लिपिड बाहर निकालना। यह प्रक्रिया (फिल्टर के छेद के आकार के बराबर) 100 एनएम के पास व्यास के साथ कणों अर्जित करता है।

नोट: अन्य लिपिड और लिपिड अनुपात इस मुझे का उपयोग कर तैयार किया जा सकताThod। Liposomes कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए।

3. MSCL अलगाव और पुनर्गठन

  1. एक तापमान agarose थाली बाहर स्ट्रीक, जिसमें 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन, ई 3 'के अंत (सी टर्मिनस) पर एक 6 उनकी टैग के साथ बढ़ाया V23T MSCL जीन ले जाने के लिए एक pB10b प्लाज्मिड के साथ कोलाई MJF465 कोशिकाओं। एक स्थिर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति रातोंरात (12-16 घंटा) के लिए थाली की अनुमति दें। प्लाज्मिड के लिए चयनित और मानक लेग माध्यम में 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के साथ कोशिकाओं में बनाए रखा है। एक संवर्धन पुटिका में 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के साथ लेग मीडिया के अगले दिन जगह 20 एमएल (एक 50 मिलीलीटर कुप्पी या क्या उपलब्ध है संस्कृति धारण करने के लिए)। रात भर संवर्धित किया गया था कि थाली ले लो और एक बाँझ टीका छड़ी के साथ तैयार 20 मिलीलीटर लेग मीडिया के लिए (टीका लगाना) को हस्तांतरण करने की थाली से एक कॉलोनी का चयन करें। 20 मिलीलीटर संस्कृति एक मिलाते इनक्यूबेटर में 250 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (12-16 घंटा) विकसित करने के लिए अनुमति दें।
  2. 20 मिलीलीटर overn छाननालेग माध्यम से 2-4 एल में ight संस्कृति। एम्पीसिलीन अब जरूरी नहीं है। आयुध डिपो के 600 0.5 पहुंचता है जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 250 rpm पर एक मिलाते इनक्यूबेटर में बोतल हिला। 0.6 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए इसोप्रोपाइल β-डी-1-thiogalactopyranoside (IPTG) जोड़ें और संस्कृति (600 आयुध डिपो = 0.8-1.0 करने के लिए) एक घंटे के लिए चलते हैं।
  3. संस्कृतियों ठंडा और फिर centrifugation द्वारा बैक्टीरिया एकत्र करने के लिए बर्फ पर बोतल में डाल दिया। बैक्टीरिया गोली करने के लिए पर्याप्त है, जो 7438 XG पर 5-8 मिनट के लिए और सेंट्रीफ्यूज (प्रयुक्त रोटर द्वारा अनुमति के रूप में या के रूप में कई) छह 400 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें। सतह पर तैरनेवाला छानना, और मीडिया से सभी कोशिकाओं को काटा जाता है जब तक प्रक्रिया को दोहराने। आवश्यक Spins की संख्या बड़ा हो गया है कि संस्कृति की राशि और इस्तेमाल रोटर के आधार पर भिन्न होता है। एक 2 एल संस्कृति के लिए यह केवल एक बार कोशिकाओं नीचे स्पिन करने के लिए आवश्यक है। एक भी अपकेंद्रित्र ट्यूब में सभी काटा कोशिकाओं स्थानांतरण।
  4. ~ फ्रांसीसी प्रेस बफर (100 मिमी केपी के 20 मिलीलीटर में सेल छर्रों Resuspendमैं और 5 मिमी 2 MgCl, पीएच 7.4)। निलंबन (क्रीम या दूध की तरह) घने होना चाहिए। इसके तत्काल निलंबन 2 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के protease अवरोध phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) जोड़ने और सख्ती मिश्रण फ्रेंच-दबाने से पहले।
  5. फ्रेंच प्रेस 10,000 16,000 साई में एक 35 मिलीलीटर फ्रेंच दबाव सेल में संस्कृति,। 7438 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट पर अटूट कोशिकाओं को अलग करने के निलंबन स्पिन।
  6. एक अलग ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला रखो, और यह करने के लिए लाइसोज़ाइम और DNase (0.2 मिलीग्राम / मिलीलीटर प्रत्येक) जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सतह पर तैरनेवाला हुई बात करते हैं।

नोट: DNase वैकल्पिक है; यह उच्च गति centrifugation के लिए चिपचिपाहट कम कर देता है। लाइसोज़ाइम महत्वपूर्ण है; यह सेल की दीवार के अवशेष हज़म और एक हल्के गैर denaturing डिटर्जेंट के साथ किया झिल्ली निकासी की उपज बढ़ाने में मदद करता है।

  1. दो ultracentrifuge ट्यूबों में सतह पर तैरनेवाला मिश्रण बांटो और कम से उन्हें स्पिन40 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर (रोटर पर निर्भर करता है) 106,883-153,911 XG। Centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला निथर जाता है और नीचे में भूरा गोली (कुल झिल्ली अंश) लंबी अवधि के भंडारण के लिए ट्यूब में जमे हुए किया जा सकता है (- 80 डिग्री सेल्सियस) या तत्काल प्रोटीन शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया।
  2. उच्च Imidazole बफर के 0.5-1 एल तैयार: 100 मिमी NaCl + 500 मिमी imidazole, केंद्रित एचसीएल के साथ पीएच 7.2-7.4 को titrate। Imidazole अपने आप में एक अच्छा बफरिंग पदार्थ है कि ध्यान दें।
  3. उचित रूप से 100 मिमी NaCl के साथ ऊपर बफर गिराए द्वारा, 100 मिमी NaCl, 15 मिमी imidazole: कम Imidazole बफर के 0.5-1 एल तैयार करें। कोई पीएच समायोजन की आवश्यकता है।
  4. अलग बोतलों में प्रत्येक बफर के 100-150 मिलीलीटर ले लो, और बी octyl glucopyranoside (ओग) (w / v) 1% जोड़ें। अच्छी तरह से समाधान हलचल और एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर। ये समाधान कम और उच्च imidazole क्रोमैटोग्राफी समाधान कर रहे हैं।
  5. , निष्कर्षण बफर तैयार कम imidazole बफर के 50 मिलीलीटर ले, और 3% जोड़ने (डब्ल्यू / वी)ओग और बफर फिल्टर।
  6. प्रोटीन अलगाव के लिए 0.5-2 जी गीला वजन की झिल्ली छर्रों का प्रयोग करें। , निकासी बफर के 5-7 मिलीलीटर जोड़ें गोली resuspend, और एक 30 मिलीलीटर हाथ से चलने वाली कांच पिस्टन homogenizer में यह homogenize। 5-10 कोमल स्ट्रोक के साथ गांठ के बिना एक सजातीय निलंबन बनाते हैं। सावधानी बरतें, कतरनी तनाव प्रोटीन विकृतीकरण पैदा करने के लिए जाना जाता है।
  7. (15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, मध्य दूरी के सेंट्रीफ्यूज, तय कोण रोटर, 38,478-68,405 XG) अघुलनशील कणों स्पिन। इस बीच, नी NTA मोती (निलंबन के 6 एमएल) के 3 मिलीग्राम लेने के लिए और कम imidazole बफर एक 15 मिलीलीटर में उन्हें झटकों से (/ ओग ओ डब्ल्यू) ट्यूब पेंच टोपी के साथ एक बार से धो लें। मोती तल पर (~ 5-7 मिनट) बसने या 4 डिग्री सेल्सियस पर एक मिनट के लिए 129-201 XG पर उन्हें नीचे स्पिन करते हैं। गोली का गठन हो जाने के बाद, ध्यान से हाथ से सतह पर तैरनेवाला छानना और प्रक्रिया को दोहराने। 3% ओग निकासी बफर के 2-3 मिलीलीटर के साथ मोती संतुलित करना।
  8. 3 से homogenized मिश्रण (झिल्ली गोली और निकासी बफर) मिलाएं।3-3.5 मिलीलीटर नी NTA मोतियों के साथ 12। 60 मिनट (बैच लोडिंग) के लिए एक पेंच टोपी ट्यूब में मिश्रण हुई बात करते हैं। 201 XG (30 सेकंड) पर मोती स्पिन हाथ से सतह पर तैरनेवाला छानना, और एक बार 1% ओग कम imidazole बफर के साथ मोती धो लें। फिर 3.13 में के रूप में मोती गोली और ताजा कम imidazole बफर के 20-30 मिलीलीटर में resuspend।
  9. नी NTA मोती के साथ (एक ऊपरी प्रवाह एडाप्टर से लैस) एक छोटे से कॉलम पैक, और मोती के माध्यम से निकालने के प्रवाह (मोती शुष्क करने की अनुमति नहीं है) जाने के लिए पानी निकलने की टोंटी खोलने के द्वारा तय है। खुला बंद मुर्गा के साथ 10 मिलीलीटर कम imidazole बफर (1% ओग) में से एक विभाज्य के साथ मोती धो लें।
  10. मशीन परिभाषित प्रवाह दर पर शुद्ध कम और उच्च imidazole buffers के साथ प्रत्येक के बारे में 25 मिलीलीटर क्रोमैटोग्राफी मशीन लोड (मशीन प्रति भिन्न होता है); यह पहली प्रणाली के माध्यम से कम imidazole बफर गुजर द्वारा किया जाता है। शून्य आयुध डिपो 260 (आधारभूत) पर ऑप्टिकल रिकॉर्डर। कम ग्रेड imidazole मैं है क्योंकि बफर पानी से काफी अलग है कि नोटयूवी अवशोषित जो mpurities। स्तंभ के लिए प्रवाह एडाप्टर डालें और यह मशीन के लिए देते हैं।
  11. कम imidazole बफर के साथ फिर से स्तंभ धो आधारभूत पहुंचता है आता है के माध्यम से प्रवाह के आयुध डिपो तक (1 मिलीग्राम / मिनट पर) (यह 10-20 मिलीलीटर लग सकते हैं)। यह कॉलम से अनबाउंड प्रोटीन को हटा।
  12. 1 मिलीग्राम / मिनट पर 30 मिनट के लिए, 500 मिमी से 20 के Imidazole की एक रेखीय ढाल लागू करें। आयुध डिपो के 600 वृद्धि से पता चलता है जब 4 मिलीलीटर अंशों एकत्रित शुरू करो। MSCL-6His रैखिक ढाल का 40% ~ पर क्षालन शुरू होता है, जबकि पहले दो भिन्न, शिथिल बाध्य प्रोटीन से भरे हुए हैं। प्रोटीन का बहुमत 3-8 भागों में दिखाई देता है।
    नोट: आयुध डिपो की एक रैखिक वृद्धि के कारण imidazole की बढ़ती% तक मनाया जाएगा।
  13. 3-4, 5-6, और 7-8 एक साथ अंशों पूल। वैकल्पिक रूप से, व्यक्तिगत रूप से अंशों ध्यान केंद्रित। अंशों केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग 6-10 गुना ध्यान लगाओ। 804 XG पर और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 20 मिनट के स्पिन के बाद, ध्यान केंद्रित प्रोटीन resuspendप्रोटीन फिल्टर करने के लिए छड़ी करने के लिए जाता है।
  14. 50 μl aliquots वापस लेने एसडीएस नमूना बफर के साथ उन्हें मिश्रण, और पृष्ठ जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग प्रोटीन शुद्धता के लिए जाँच करें।
    नोट: MSCL जेल के नीचे करने के लिए लगभग 17 केडीए के एक फजी बैंड के रूप में विस्थापित हो जाएगा।
  15. निर्माता के निर्देश के बाद, एक प्रोटीन परख किट का उपयोग प्रोटीन यों केंद्रित अंशों का प्रयोग करें। एक 0.8 ग्राम झिल्ली गोली से एक ठेठ उपज संयुक्त भागों में शुद्ध प्रोटीन की 0.2 मिलीग्राम तक है।
  16. डायलिसिस के माध्यम से DPhPC liposomes में V23T MSCL Reconstitute। तीन डिस्पोजेबल दौर नीचे (12 x 130 मिमी) ग्लास ट्यूब में इसके बारे में एक 10 मिलीग्राम / एमएल क्लोरोफॉर्म DPhPC का समाधान और विभाज्य 0.5 मिलीलीटर (लिपिड की यानी 5 मिलीग्राम) ले लो। नाइट्रोजन की धारा के तहत लिपिड सूखी और निर्वात (4-6 घंटे) के तहत क्लोरोफॉर्म के अवशेष को हटा दें।
  17. डायलिसिस बफर (100 मिमी KCl, 5 मिमी KPI, पीएच 7.2), भंवर, और मील के 2 मिलीलीटर में इसे भंग, प्रत्येक ट्यूब में सूखे लिपिड पाउडर ओग के 15 से 20 मिलीग्राम जोड़ेंldly Sonicate। ओग solubilized लिपिड एक स्पष्ट समाधान होना चाहिए।
  18. 100: 1: 300 और 1: 1 प्राप्त करने के लिए प्रत्येक ट्यूब केंद्रित V23T MSCL समाधान जोड़ें 1,000 प्रोटीन-से-लिपिड अनुपात और भंवर में अच्छी तरह से। (तैयार गिने क्लिप के तीन जोड़े हैं, MWCO 8000, 7.5 मिमी व्यास।) में कटौती और डायलिसिस ट्यूबिंग के तीन टुकड़े (~ 12 सेमी लंबे) धोने
  19. ध्यान से क्लिप के साथ समाप्त होता है बंद है, और के चार परिवर्तन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए बफर के 2 एल (100 मिमी KCl, 5 मिमी KPI, pH7.2) के खिलाफ dialyze, ट्यूबिंग अंदर solubilized लिपिड प्रोटीन मिश्रण रखें हर 12 घंटे के बफर। डायलिसिस के बाद, PROTEO-लिपिड तैयार हैं।

नोट: liposome समाधान NaN3 2 मिमी (सोडियम azide) के साथ पूरक और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। ठंड से बचें।

तेल जलाशय 4. निर्माण

  1. एक 2 इंच व्यास की दीवार के माध्यम से दो परस्पर विरोधी छेद (व्यास में 1.0 मिमी) सभी तरह से ड्रिल, 1.5 सेमी लंबे एक्रिलिक CYLनीचे (चित्रा 1 ए) से 1 सेमी पर इंदर।
  2. को गाढ़ा ड्रिल दो 4 मिमी छेद पहले से 1 मिमी छेद। छेद की गहराई 1 मिमी प्रत्येक (सभी तरह से ड्रिल करने के लिए नहीं सुनिश्चित कर लें) होना चाहिए। ये छेद रबर गास्केट फिट किया जाता है।
  3. लीक से तेल को रोकने के क्रम में बड़ा छेद में 1 मिमी भीतरी व्यास होने प्लेस और गोंद दो रबर गास्केट।
  4. एक 10 सेमी x 10 सेमी किसी भी बहुउद्देशीय epoxy का उपयोग पतली एक्रिलिक शीट (चित्रा 1) के लिए मशीनीकृत सिलेंडर गोंद।

प्रयोग के दिन:

इलेक्ट्रोड 5. तैयारी

  1. एक चांदी क्लोराइड (AgCl) कोटिंग बनाने के लिए दो घंटे के लिए ब्लीच में उनके सुझावों को विसर्जित कर दिया तो दो 250 माइक्रोन व्यास चांदी के तारों की एक 7 सेमी लंबाई में कटौती, और। एक ग्रे रंग एक AgCl कोटिंग (चित्रा 2 ई) का गठन किया गया है कि इंगित करता है।
  2. एक ग्लास कटर का उपयोग करना, एक 10 सेमी लंबा, / 0.58 एक आयुध डिपो / आईडी मिमी borosilicate वर्ग capil विभाजितदो 5 सेमी केशिकाओं में लैरी।
  3. एक 34 गेज Microfil सुई खूंटी-डीएमए हाइड्रोजेल साथ केशिकाओं भरने का उपयोग करना। केशिका के बाहर सूजन से हाइड्रेटेड हाइड्रोजेल रोकने के लिए, सुझावों पर एक 3 मिमी निकासी को रखने के लिए और केशिकाओं में कोई हवाई बुलबुले हैं सुनिश्चित करें।
  4. हाइड्रोजेल भरा केशिकाओं (चित्रा 2 ई) में एजी / AgCl इलेक्ट्रोड डालें।
  5. एक यूवी स्पॉट बंदूक का इस्तेमाल डब्ल्यू 1 पर 2 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के संपर्क पर मुक्त कट्टरपंथी photopolymerization के माध्यम से खूंटी-डीएमए हाइड्रोजेल इलाज।

6. प्रयोग की स्थापना

नोट: प्रयोग पैच एम्पलीफायर पर एक जमीन कनेक्शन करने के लिए आधारित एक फैराडे पिंजरे के तहत सेटअप है।

  1. एक पुरुष कनेक्टर (चित्रा 2 ई) है कि एक सीधे microelectrode धारक को micropipettes के एक संलग्न।
  2. पैच एम्पलीफायर (2A चित्रा) के headstage को microelectrode धारक कनेक्ट करें। Hea कनेक्ट करने के लिएजमीन के लिए dstage, headstage के लिए एक उपयुक्त कनेक्टर के लिए एक 18 गेज अछूता तांबे के तार मिलाप।
  3. एक 3 अक्ष मैनुअल micromanipulator पर headstage माउंट। Headstage बढ़ते प्लेट संलग्न (यह micromanipulator के साथ-साथ खरीदा या कस्टम एक मशीन की दुकान में किया जाना चाहिए) micromanipulator से और फिर उचित शिकंजा का उपयोग बढ़ते थाली को headstage कनेक्ट।
  4. एक प्रयोगशाला बनाया कनेक्टर के माध्यम से रैखिक actuator के लिए दूसरा micropipette देते हैं और फिर एक दूसरे micromanipulator (चित्रा 2 बी) पर दोनों माउंट। micropipettes गठबंधन, एक-दूसरे का विरोध, और क्षैतिज लगाया जाना चाहिए। नोट: manipulators के ब्रांड और शैली में कोई फर्क नहीं है।
  5. एक कांच की शीशी में, V23T MSCL proteoliposome समाधान के 0.01 मिलीलीटर के साथ DPhPC liposomes की 0.1 मिलीग्राम मिश्रण।

नोट: यह कदम एक स्थिर लिपिड bilaye के गठन के लिए महत्वपूर्ण है जो प्रोटीन-से-लिपिड अनुपात (~ 0.0002), को कम करने की जरूरत हैआर।

  1. एक 34 गेज Microfil सुई का प्रयोग, proteoliposome समाधान (चित्रा 3) के साथ दोनों micropipettes के सुझावों को भरने।
  2. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के शीर्ष पर जलाशय, जगह और विरोध में 1 मिमी छेद (चित्रा 2 बी) के माध्यम से micropipettes खिलाओ। नोट: किसी भी खुर्दबीन के रूप में लंबे समय बूंदों स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है पर इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. Hexadecane (99%) के साथ सतह के लिए जलाशय भरें। Hexadecane आगे की शुद्धि की जरूरत नहीं है।
  4. एक तिहाई 10 माइक्रोन व्यास borosilicate ग्लास micropipette का उपयोग, micropipettes की नोक पर गोलाकार बूंदों फार्म, micropipettes के सुझावों पर पतला V23T MSCL proteoliposome समाधान (~ 0.00052 एमएल) बांटना और फार्म के लिए, एक तिहाई micromanipulator पर मुहिम शुरू की बूंदों (चित्रा 3)।
  5. (एफ के रूप में वांछित (कम या मात्रा में वृद्धि से) बूंदों के आकार पर नियंत्रण और उन्हें monolayers पूरी तरह से फार्म करने के लिए 10 मिनट के लिए आराम करते हैंigure 3)।
  6. संपर्क में बूंदों लाओ, बाईलेयर गठन 1 से 2 मिनट के भीतर हो जाएगा।

7. सॉफ्टवेयर और उपकरण की स्थापना

  1. कंप्यूटर, माइक्रोस्कोप, पीजोइलेक्ट्रिक थरथरानवाला नियंत्रक, समारोह जनरेटर, पैच एम्पलीफायर, और कम शोर डाटा अधिग्रहण प्रणाली पर मोड़ से सॉफ्टवेयर तैयार करें।
    नोट: किसी भी पैच एम्पलीफायर का उपयोग किया जा सकता है और निम्न निर्देश सामग्री और उपकरणों की सूची में सूचीबद्ध है हम इस्तेमाल किया है और जो एक के लिए विशेष रूप से कर रहे हैं।
  2. पैच एम्पलीफायर के सामने पैनल पर, VHOLD / IHOLD और वी शिकंजा कसने के लिए "मोड" knobs निर्धारित किया है।
  3. सामने पैनल पर "Lowpass" बेसल 2 से 1 किलो हर्ट्ज और उत्पादन हासिल करने के लिए फिल्टर सेट।
  4. पूरे सेल β = 1 के लिए "विन्यास" सेट करें।
  5. Knobs के बाकी शून्य करने के लिए या सामान्य स्थिति में स्थापित कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
  6. 5 kHz पर सभी डीआईबी वर्तमान माप नमूनाएक 1 किलोहर्ट्ज़ बेसल विरोधी aliasing फिल्टर के साथ।
  7. डेस्कटॉप पर आइकन पर डबल क्लिक करके सॉफ्टवेयर चलाएँ।
  8. "Digitizer" संवाद खोलने के लिए "कॉन्फ़िगर> Digitizer" क्लिक करें और फिर "परिवर्तन" बटन पर क्लिक करें।
  9. "परिवर्तन Digitizer" संवाद में "Digitizer प्रकार" सूची से "Digidata 1440 सीरीज" का चयन करें।
  10. अंकरूपक पता लगाने के लिए स्कैन बटन पर क्लिक करें।
  11. "परिवर्तन Digitizer" संवाद से बाहर निकलें, और फिर "Digitizer" संवाद बाहर निकलने के लिए "ठीक" क्लिक करने के लिए "ठीक" पर क्लिक करें।
  12. "कॉन्फ़िगर> प्रयोगशाला बेंच" पर क्लिक करें।
  13. प्रयोगशाला बेंच के इनपुट संकेतों टैब में, digitizer चैनल के तहत एक एनालॉग का चयन करें। 0.002 करने के लिए पैमाने कारक सेट करें।

लिपिड bilayer 8. गठन

  1. एक BNC केबल का उपयोग करना, ओ का उत्पादन कनेक्टबाहरी कमांड इनपुट सामने करने के लिए aveform जनरेटर (डाटा अधिग्रहण प्रणाली के पीछे के पैनल पर) बंद कर दिया। Headstage के लिए एक 10 हर्ट्ज, 500 एम वी पी-टू-पी त्रिकोणीय तरंग भेजें।
  2. Micromanipulator का प्रयोग, वे थोड़ा स्पर्श और (आमतौर पर लगभग 1 मिनट से 2) (आंकड़े -3 सी और 3 डी) के लिए होते हैं thinning बाईलेयर के लिए इंतजार जब तक संपर्क में बूंदों लाने के लिए क्षैतिज कांच micropipettes चलते हैं।

नोट: बाईलेयर गठन की प्रक्रिया की प्रगति माइक्रोस्कोप के माध्यम से नेत्रहीन देखा जा सकता है और वर्तमान माप (चित्रा 4) द्वारा नजर रखी जा सकती है।

  1. बाईलेयर आकार समायोजित (~ व्यास में 250 माइक्रोन) micromanipulator का उपयोग, प्रवर्तक पर मुहिम शुरू की छोटी बूंद की स्थिति को नियंत्रित करने के द्वारा। नोट: बाईलेयर आकार नेत्रहीन माइक्रोस्कोप के माध्यम से अनुमान लगाया जा सकता है। इस विधि के लिए यह आसान शोधकर्ता आसानी से bilayer के आकार को नियंत्रित करने के लिए बनाता हैmicromanipulators का उपयोग बूंदों घूम रहा है।

9. गतिशील उत्तेजना और MSCL Gating

  1. बाईलेयर का गठन किया और (बाईलेयर यानी तोड़ने या प्रवाहकीय नहीं है) स्थिर है गया है, एक समारोह जनरेटर का उपयोग कर एक sinusoidal संकेत भेजकर बूंदों को प्रोत्साहित।
  2. Bilayer में शामिल MSCL प्रोटीन को प्रोत्साहित करने के लिए, पीजोइलेक्ट्रिक इमदादी नियंत्रक करने के लिए एक 175 माइक्रोन चोटी से शिखर आयाम, 0.2 हर्ट्ज आवृत्ति, और 50% शुल्क साइकिल के साथ एक sinusoidal तरंग भेजें। (Waveforms के विभिन्न प्रकार के विभिन्न आयाम, आवृति, और कर्तव्य चक्र के साथ भेजा जा सकता है)

10 प्रसंस्करण और व्याख्या परिणाम

  1. .ABF प्रारूप में, डाटा अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग कर दर्ज वर्तमान माप, बचाओ। एक समारोह फ़ाइल "abfload" का उपयोग मैटलैब में डेटा आयात (.ABF प्रारूप में), तो विश्लेषण और डेटा की प्रक्रिया। "Abfload" फ़ाइल मुफ्त ऑनलाइन के लिए उपलब्ध है।
  2. अनुमान टीएक उचित कैमरे का उपयोग कर दर्ज की गई हैं कि पूर्ण प्रवर्तन चक्र के दौरान छोटी बूंद के वीडियो का उपयोग बाईलेयर और बूंदों के क्षेत्रीय विस्तार में वह तनाव,।
  3. पानी / तेल इंटरफ़ेस का क्षेत्र, साथ ही बूंदों के बीच कोण अनुमान लगाने के लिए इमेज प्रोसेसिंग तकनीक का उपयोग कर व्यक्तिगत फ्रेम प्रसंस्करण द्वारा Matlab में प्रोसेस वीडियो,। नोट: वीडियो से ली गई एक 2 डी फ्रेम का उपयोग, पानी तेल इंटरफेस (छोटी बूंद यानी धार) का पता लगाने और उसके बाद क्रांति से सतह क्षेत्र का अनुमान है।

Representative Results

एक आंकड़े और लिपिड bilayer झिल्ली के यांत्रिक उत्तेजना के पाठ्यक्रम में प्रोटीन गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए 2 प्रदर्शन प्रयोगात्मक स्थापना और उपकरणों का इस्तेमाल किया। हमारे माप में बिजली के शोर को कम करने के लिए, कार्य केंद्र एक प्रयोगशाला बनाया फैराडे पिंजरे के भीतर रखा जाता है, AxoPatch 200 बी एम्पलीफायर पर एक जमीन कनेक्शन करने के लिए आधारित।

एक स्थिर इन्सुलेट लिपिड bilayer के गठन के इस अध्ययन में एक महत्वपूर्ण कदम है। इस व्यवस्था में, एक लिपिड monolayer एक कार्बनिक विलायक के एक स्नान में डूबे जलीय बूंदों के तेल / पानी इंटरफेस में assembles। बूंदों संपर्क में रखा जाता है, अतिरिक्त तेल का सफाया कर दिया, और एक दो अणु मोटी लिपिड bilayer करने के विरोध लिपिड monolayers पतली है। बाईलेयर लक्षण वर्णन में इस्तेमाल सबसे आम तकनीक वोल्टेज दबाना है। वर्तमान में मापा जाता है, जबकि वोल्टेज दबाना साथ, bilayer भर में वोल्टेज एक निरंतर मूल्य पर बनाए रखा है। 4 चित्रा 2 सेमी) DPhPC लिपिड bilayer के 5 जानने के बाद, का गठन bilayer के क्षेत्र की गणना की जा सकती है। बाईलेयर क्षेत्र बूंदों (चित्रा -4 ए) की स्थिति बदलने से नियंत्रित किया जा सकता है। पीजोइलेक्ट्रिक क्रियाकारक का उपयोग करना, विभिन्न आवृत्तियों, आयाम, और कर्तव्य चक्र में waveforms (sinusoidal, वर्ग, त्रिकोणीय, आदि।) के विभिन्न प्रकार क्षैतिज करने की बूंदों के लिए आवेदन किया है और अक्षीय रूप से उन्हें हिलाना और इस प्रकार, बाईलेयर तनाव और क्षेत्र बदला जा सकता है किया जा सकता है (चित्रा 4 बी)।

डीआईबी यंत्रवत् प्रेरित किया जाता है जब झिल्ली भर में एक निरंतर डीसी संभावित बनाए रखते हुए, MSCL के एक कम सीमा (लाभ के समारोह) V23T उत्परिवर्ती मुख्य रूप से उप प्रवाहकीय राज्यों और कभी-कभी पूर्ण उद्घाटन घटनाओं सहित विश्वसनीय गतिविधियों उत्पन्न करता है (चित्रा 5) । ये ईवीदस्तावेजों शुद्ध V23T MSCL साथ पुनर्गठन बरकरार आंतरिक ई कोलाई झिल्ली और लिपिड से पैच दबाना तकनीक का उपयोग कर दर्ज उन लोगों के लिए समान हैं। चित्रा 5 में परिणाम सभी मौजूदा spikes शिखर संपीड़न पर मनाया जाता है कि जब से gating, तनाव में वृद्धि के जवाब में होता साबित होते हैं। शिखर संपीड़न पर, बूंदों के रिश्तेदार क्षेत्रीय विस्तार अधिक से अधिक है और इसलिए, इंटरफेस में तनाव अधिक से अधिक है।

एक डीसी वोल्टेज झिल्ली 36 भर में लागू किया जाता है, जब Alamethicin, एक वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल और सबसे अधिक अध्ययन पेप्टाइड्स में से एक, झिल्ली पारगम्यता बढ़ जाती है। transmembrane प्रोटीन और पेप्टाइड्स की मेजबानी के लिए लिपिड bilayer इंटरफेस की क्षमता भी पेप्टाइड alamethicin का उपयोग कर वोल्टेज gating वर्तमान रिकॉर्डिंग प्रदर्शन से परीक्षण किया है। Alamethicin 100 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए फॉस्फोलिपिड समाधान के साथ मिलाया जाता है। 6 के तहत वर्तमान माप से पता चलता है वोल्टेज दबाना (115 एम वी)। इस प्रयोग में बूंदों छोटे बाईलेयर इंटरफेस और इस प्रकार उच्च प्रतिरोध और छोटे समाई प्राप्त करने के लिए अलग निकाला जाता है। Alamethicin पेप्टाइड के gating व्यवहार वर्तमान (चित्रा 6) के असतत कदम के माध्यम से दिखाया गया है। भूखंड के सही पक्ष पर हिस्टोग्राम मूल रूप से चैनल के ही पहले प्रवाहकत्त्व स्तर है, जो आधार स्तर (0.0962 NS) से चालकता में परिवर्तन को दर्शाता है।

चित्र 1
चित्रा 1:। मुख्य भागों और तेल जलाशय के आयामों का वर्णन एक योजनाबद्ध तेल जलाशय वर्जीनिया टेक में मशीन की दुकान पर निर्मित है। यह एक एक्रिलिक शीट की सतह से चिपके एक machined बेलनाकार एक्रिलिक ट्यूब के होते हैं। आयामों और डिजाइन अलग आवेदन या दो से अधिक micropipettes समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।/53362/53362fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। प्रायोगिक स्थापना और micropipettes तैयारी (ए) यंत्रवत्, बनाने उत्तेजक, और इंटरफ़ेस bilayers निस्र्पक के लिए मानक कार्य केंद्र एक माइक्रोस्कोप, 3 अक्ष manipulators, एक डिजिटल कैमरा, पीजोइलेक्ट्रिक थरथरानवाला, कंपन अलगाव तालिका, और एक फैराडे पिंजरे में शामिल (नहीं दिख रहा)। (बी) प्रयोगात्मक स्थापना क्षैतिज hexadecane तेल की एक स्नान के भीतर तैनात दो विरोधी खूंटी-डीएमए हाइड्रोजेल भरा micropipettes के होते हैं। Micropipettes के प्रत्येक बिजली के कनेक्शन उपलब्ध कराने के लिए एक एजी / AgCl इलेक्ट्रोड होता है। Proteoliposome समाधान के साथ भरा एक तीसरा micropipette अन्य micropipettes की नोक पर बूंदों के रूप में इस्तेमाल किया जाता है। (सी) डीआईबी वर्तमान प्रतिक्रिया मापा जा सकता हैपैच एम्पलीफायर और कम शोर डाटा अधिग्रहण प्रणाली के संयोजन का उपयोग। (डी) एक micropipettes की नोक पर गठित जलीय बूंदों दिखा तस्वीर को बंद कर दिया गया। (ई) एजी / AgCl इलेक्ट्रोड ब्लीच में दो 250 माइक्रोन चांदी के तारों की नोक सूई से बना रहे हैं। इलेक्ट्रोड तो जमना के लिए यूवी प्रकाश के साथ ठीक हो जाता है, जो खूंटी-डीएमए हाइड्रोजेल से भर दो borosilicate ग्लास केशिकाओं के माध्यम से तंग आ चुके हैं। पुरुष कनेक्टर के साथ एक सीधे microelectrode धारक पैच एम्पलीफायर के headstage को micropipettes के एक से कनेक्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

चित्र तीन
चित्रा 3:। छोटी बूंद इंटरफेस bilayers के गठन को दर्शाता हुआ छवियाँ (ए) proteoliposomes के साथ भरा एक 10 माइक्रोन micropipette micropipette सुझावों से निकटता में माइक्रोस्कोप के तहत तैनात है। Micropipette से जुड़ा एक सिरिंज का प्रयोग, छोटी मात्रा में बांटनाproteoliposomes की वांछित मात्रा को गोलाकार बूंदों के रूप में। बूंदों दस मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति देकर monolayer फार्म करते हैं। संपर्क में बूंदों ले आओ; इंटरफेस पर सभी तेल समाप्त हो रहा है के बाद दो परतों का निर्माण होगा। बाईलेयर का गठन किया है, वहीं इंटरफेस के दोनों किनारों पर रासायनिक संरचना एक सूक्ष्म आकार micropipette का उपयोग वांछित रसायनों इंजेक्शन लगाने के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है (बी)। (सी) पहले से संपर्क के क्षण में बूंदों। (डी) लिपिड bilayer का गठन किया है जब बूंदों।

चित्रा 4
चित्रा 4: वास्तविक समय माप प्रारंभिक thinning और इंटरफेस के बाद विस्तार दोनों दिखाने के एक त्रिकोणीय विद्युत क्षमता के आवेदन के माध्यम बाईलेयर गठन के पाठ्यक्रम में मापा (क) वर्तमान।। मापा वर्तमान की भयावहता capaci को सीधे आनुपातिक हैदूरी, और bilayer इंटरफेस के इस प्रकार क्षेत्र। इंटरफेस और इसके विपरीत के क्षेत्र बड़ा है, बूंदों को एक साथ लाया जाता है और करीब। यांत्रिक उत्तेजना के आवेदन पर (बी), बाईलेयर इंटरफ़ेस का बढ़ता क्षेत्र और उत्तेजक संकेत के रूप में एक ही आवृत्ति पर कम हो जाती है।

चित्रा 5
चित्रा 5:। वास्तविक समय माप यांत्रिक उत्तेजना को बाईलेयर की प्रतिक्रिया के रूप में अच्छी तरह से MSCL की V23T उत्परिवर्ती के gating दिखाने वर्तमान प्रतिक्रिया के आकार का एक परिणाम के रूप में बाईलेयर समाई में एक sinusoidal परिवर्तन से संबंधित है, जो sinusoidal है बाईलेयर क्षेत्र बदलें। वर्तमान spikes, प्रत्येक चक्र के चरम पर होने वाली है, V23T उत्परिवर्ती के उप-प्रवाहकत्त्व gating संकेत मिलता है। आगे एक ध्रुवीय साजिश gating बाईलेयर इंटरफेस में तनाव में वृद्धि को दर्शाता है जो शिखर संपीड़न, पर होता है कि इंगित करता है।


चित्रा 6:। वोल्टेज दबाना और शामिल Alamethicin चैनलों के gating गतिविधि के लिए प्रवाहकत्त्व स्तरों की इसी हिस्टोग्राम के तहत वर्तमान माप Alamethicin पेप्टाइड के gating व्यवहार वर्तमान में असतत कदम वार वृद्धि के माध्यम से दिखाया गया है। प्रवाहकत्त्व स्तरों वर्जीनिया टेक 7 पर हमारे शोध समूह द्वारा किया जाता पिछले माप के साथ बहुत अच्छी तरह से मेल खाते हैं।

Discussion

Mechanosensation रहने वाले जीवों में विकसित किया है कि पहले संवेदी पारगमन रास्ते में से एक का प्रतीक है। अध्ययन और डीआईबी के Mechano-बिजली के गुणों को समझने के लिए इस घटना का उपयोग करना, कार्यात्मक उत्तेजनाओं उत्तरदायी सामग्री की ओर एक महत्वपूर्ण कदम है। यह एक mechanoelectrical ट्रांसड्यूसर और लिपिड bilayer इंटरफ़ेस में तनाव बढ़ाने का पता लगाने के लिए एक तनाव गेज के रूप में डीआईबी में एक mechanosensitive चैनल, MSCL, के समावेश और सक्रियण शामिल है। एक और नोट पर, एमएस चैनलों के समारोह मोटाई, आंतरिक वक्रता, और दबाव सहित लिपिड bilayers की बुनियादी गुण सामग्री के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है। ऊपर उल्लिखित के प्रकाश में, micropipette आधारित तकनीक शोधकर्ता dibs में एमएस चैनलों का अध्ययन करने और लिपिड bilayer की संरचना, साथ ही लिपिड, प्रोटीन बातचीत में अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता अनुमति के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

पिछले तीन दशक के दौरानएस, पैच दबाना यह वोल्टेज और तनाव दोनों के clamping की अनुमति देता है के बाद से, एमएस चैनलों का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक तरीका था। हालांकि, पैच दबाना भारी उपकरण और miniaturization, संवेदी और रूपांतरण उपकरणों के इंजीनियरिंग के लिए आवश्यक एक संपत्ति के लिए उपयुक्त नहीं की आवश्यकता है। उनकी सादगी, स्थिरता, और compactness के कारण dibs MSCL की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त वातावरण प्रतिनिधित्व करते हैं। यहाँ, हम बूंदों और bilayer इंटरफेस के आकार, प्रत्येक छोटी बूंद की रासायनिक संरचना, और गतिशील उत्तेजना के माध्यम से इंटरफेस में तनाव को नियंत्रित करने की क्षमता के साथ, एक micropipette आधारित तकनीक का प्रस्ताव द्वारा डीआईबी गठन तकनीक में पिछले अग्रिमों का विस्तार। तकनीक coaxially कांच केशिकाओं का विरोध करने के सुझावों के लिए, proteoliposomes युक्त, जलीय बूंदों प्रस्तोता के होते हैं। संपर्क में इंटरफेस में एक लिपिड bilayer रूपों लाया जब बूंदों कार्बनिक विलायक के एक स्नान में रखा गया है और कर रहे हैं।

micropipettes पी से जुड़े होते हैंबूंदों की क्षैतिज विस्थापन की इजाजत दी iezoelectric oscillators,। गतिशील पानी तेल इंटरफेस में इंटरफेसियल तनाव की वृद्धि हुई है और इसलिए बाईलेयर तनाव में वृद्धि की बूंदों, परिणाम compressing। दो प्रमुख पहलुओं के समान है और हाल ही में प्रकाशित संपर्क बुलबुला बाईलेयर (सीबीबी) तकनीक 37 से इस विधि को अलग। इस के साथ साथ प्रस्तुत तकनीक का उपयोग करना, bilayer के आकार micromanipulators का उपयोग नियंत्रित किया जाता है और इस तरह की बूंदों की मात्रा CBB विधि के विपरीत है, लगातार बने हुए हैं। इसके अलावा, सीबीबी तकनीक यह सरल और आसान बनाने के लिए कर रही है इस पत्र में प्रस्तुत विधि में जरूरत नहीं कर रहे हैं, जो दबाव पंप, के लिए कहता है।

हम शामिल करने और एक पैच पिपेट या रासायनिक संशोधनों 38 के उपयोग के बिना पहली बार के लिए जीवाणु MSCL को प्रोत्साहित करने में सक्षम हैं। प्रणाली मजबूत असममित लिपिड bilayer झिल्ली के गठन की सुविधा के बाद से, यह और अधिक बारीकी से एल mimicsजैविक झिल्लियों में पाया ipid विषमता। इस MSCL की गतिविधि पर नियंत्रित झिल्ली रचना या विषमता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए हमें की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, इमेज प्रोसेसिंग तकनीक के माध्यम से, इस विधि बाईलेयर इंटरफेस में तनाव का अनुमान मदद करता है। डीआईबी में थोक और सतह बलों के बीच interconversion के सिद्धांतों को समझने में इस तकनीक सहायता, मौलिक झिल्ली संपत्तियों की माप की सुविधा है, और तनाव झिल्ली MSCL प्रतिक्रिया की समझ को बेहतर बनाता है।

इस विधि MSCL अध्ययन करने के लिए एक कदम और करीब एक biomolecular उत्तेजनाओं उत्तरदायी सामग्री प्रणाली की ओर है और एक अलग मनोवैज्ञानिक वातावरण के लिए ले जाता है, इस प्रणाली के लिए सीमाएं हैं। इस प्रणाली में तनाव की वजह से तेल / पानी इंटरफेस में तनाव को दूर करने के लिए जाता है, जो हर छोटी बूंद में लिपिड के रूप में लिपिड जलाशय की उपस्थिति के लिए कर्फ्यू लगा दिया नहीं जा सकता है। इसलिए, वर्तमान mechanosensitive चैनलों पर प्रेरित किया जा सकताकेवल एक गतिशील शासन में dibs में। प्रणाली में हवा के बुलबुले की उपस्थिति काफी प्रयोगों की परिशुद्धता और reproducibility प्रभावित करता है। हाइड्रोजेल में मौजूद हवा के बुलबुले बिजली के कनेक्शन है, तो नुकसान हो सकता है।

हम MSCL की उत्तेजना के लिए सूक्ष्म पिपेट आधारित पद्धति के उपयोग का वर्णन करते हैं, तकनीक एमएस चैनलों के अन्य प्रकार का अध्ययन किया और biomolecules की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है हो सकता है। उदाहरण के लिए, इसी तरह की स्थापना एक चैनल से मुक्त छोटी बूंद इंटरफेस bilayer झिल्ली की mechanoelectrical प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया गया है। विभिन्न प्रोटीन का पुनर्गठन किया है और प्रत्येक बायोमोलिक्यूल के पुनर्गठन के वातावरण भिन्न है कि विचार में लेने के इस अत्यधिक नियंत्रित सेटअप का उपयोग कर सक्रिय किया जा सकता है। इस आलेख में वर्णित विधि केवल शोधकर्ता की कल्पना तक ही सीमित रहा है कि एक काफी व्यापक आवेदन क्षमता पर छू लेती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान वैज्ञानिक अनुसंधान बुनियादी पहल अनुदान FA9550-12-1-0464 की वायु सेना के कार्यालय द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Corning 430624
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) Avanti Polar Lipids 850356P Purchased as lyophilized powder
34-gauge microfil World Precision Instruments MF24G-5
400 mL Centrifuge bottels ThermoFisher 3141 Nalgene
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz Keysight Technologies 33220A
Ampicillian ThermoFisher BP1760 ACS Grade
Avanti® Mini-Extruder Avanti Polar Lipids 610000
Axio Scope.A1 Carl Zeiss -
AxioCam HSm Carl Zeiss -
Axopatch 200B Amplifier  Molecular Devices -
BCA protein assay kit Pierce  23225
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator Digi-Key BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Dialysis tubing 7 Spectra/Por 132113 MWCO 8000, 7.5 mm diameter
DigiData 1440A system Molecular Devices -
DNAse Sigma-Aldrich DN25
DPhPC Avanti 850356C
E-625 PZT Servo-Controller  Physik Instrumente E-526
FPLC System Pharmacia Biotech -
HCl J.T. Baker 9535-33
Hexadecane, 99% Sigma-Aldrich 544-76-3
Homoginizer Wheaton 357426 15 mL
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Affymetrix 17886
IRGACURE® 2959 IRGACURE® 555047962
Isopore Membrane Filters  EMD Millipore VCTP02500
Isopropyl Alcohol VWR International BDH1133-4LP
KCl Sigma-Aldrich P3911 ACS Grade
KH2PO4 Mallinckrodt 7100 ACS Grade
Kimble-Chase Kontes 420401-1515 Flex-Column
LED-100 UV Spot Curing System Electro-Lite, corp. 81170
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Manual Patch-Clamp Micromanipulators Thorlabs PCS-520N
MgCl2 ThermoFisher M33 ACS Grade
Microelectrode Holder  World Precision Instruments MEH1S
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000
MOPS, minimum 99.5% titration Sigma-Aldrich M1254-100G
N2 Gas Airgas UN1066
NaCl EMD SX0420-1 ACS Grade
Ni NTA agarose beads Qiagen 1000632
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID McMaster-Carr 8486K545
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator Physik Instrumente P-601
PAGE gel Bio-Rad 456-9033
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film Parafilm® PM999
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate Polysciences, Inc. 15178-100
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk Sterlitech Corporation PCTB0425100
Potassium Chloride  Sigma-Aldrich P5405-500G
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves  VWR International CA89-38-272
Replacement Gasket 1.0mm World Precision Instruments GO1-100
SDS Sigma-Aldrich L5750
Silver wire GoodFellow 147-346-94 Different diameters could be used depending on the application 
Sodium Azide Affymetrix 21610
Test tubes ThermoFisher 14-961-27 12 x 130 mm
Tryptone ThermoFisher BP1421
Ultracal 30K Millipore UFC803024 Amicore Ultra 30 MWCO
VWR Light-Duty Tissue Wipers VWR International 82003-820
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner VWR International 13089
Water Purifier Barnstead D11931
Yeast ThermoFisher BP1422
β-octylglucopyranoside Anatrace O311S

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 105 (सामान्य) बायोइन्जिनियरिंग छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayers MSCL DPhPC mechanosensitive चैनलों झिल्ली तनाव लिपिड bilayer biomolecular डिवाइस mechanoelectrical ट्रांसड्यूसर डीआईबी
Multifunctional, छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayers में बैक्टीरियल Mechanosensitive आयन चैनल का समावेश और उत्तेजना के लिए विधि Micropipette आधारित
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Najem, J. S., Dunlap, M. D.,… More

Najem, J. S., Dunlap, M. D., Yasmann, A., Freeman, E. C., Grant, J. W., Sukharev, S., Leo, D. J. Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. J. Vis. Exp. (105), e53362, doi:10.3791/53362 (2015).

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