Abstract
A diferenciação dos espermatídeos rato é um processo crítico para a produção de uma gâmeta masculina funcional com um genoma intacto para ser transmitido à geração seguinte. Até agora, os estudos moleculares desta transição morfológica têm sido dificultados pela falta de um método que permite uma separação adequada dessas etapas importantes de diferenciação spermatid para análises subsequentes. Tentativas anteriores de gating adequada destas células usando citometria de fluxo pode ter sido difícil por causa de um aumento peculiar na fluorescência DNA em espermátides submetidos à remodelação da cromatina. Com base nesta observação, que fornecem detalhes de um simples fluxo de citometria de regime, permitindo a purificação reprodutível de quatro populações de espermatídeos rato fixas com etanol, cada um representando um estado diferente no processo de remodelação nuclear. Enriquecimento população é confirmado utilizando marcadores específicos passos e critérios morfológicos. Os espermatídeos purificados podem ser utilizados para genómico e proteomic analisa.
Protocol
Cuidados com os animais foi em conformidade com o cuidado dos animais e uso comissão Université de Sherbrooke.
1. Tubo de Preparação
- O dia antes da separação de células, adicionar 1-2 mL de soro bovino fetal inactivado pelo calor (FBS) a 5 ml de polipropileno tubos de fundo redondo, e a 15 ml e 50 ml de polipropileno tubos cónicos.
Passo crítico: Certifique-se de que todos os tubos usados no protocolo é revestido.
Nota: revestimento FBS impede que as células germinativas de furar a parede do tubo. - Lentamente misturar O / N por inversão a 4 ° C para revestir uniformemente os tubos utilizando um rotor.
- No dia seguinte, retire FBS a partir de tubos revestidos por decantação.
- * Passo crítico: Certifique-se de que os 5 ml de polipropileno tubos de fundo redondo e os 15 e 50 ml tubos utilizados para preparação de células (protocolo passos 2,1-2,11) estão completamente esvaziados de FBS para impedir Fanning (ou seja, desvio impreciso dos fluxos laterais). Usar uma pipeta de P200 para remover o FBS.
- Deixar um pequeno volume residual de FBS (cerca de 100-200 mL) no 5 ml de polipropileno rodada tubos de fundo utilizados para a recolha de células purificadas.
- * Passo crítico: Certifique-se de que os 5 ml de polipropileno tubos de fundo redondo e os 15 e 50 ml tubos utilizados para preparação de células (protocolo passos 2,1-2,11) estão completamente esvaziados de FBS para impedir Fanning (ou seja, desvio impreciso dos fluxos laterais). Usar uma pipeta de P200 para remover o FBS.
2. Preparação celular
- Sacrificar um rato macho sob anestesia com O2 / isoflurano (indução 5%, em seguida, mantida a 2%), seguida por asfixia com CO2.
- Especial e do decapsulate ambos os testículos e mediu com pequenas tesouras em 500 ul de tampão de triagem para um tubo de 1,5 ml.
- Lavar as células germinativas de túbulos seminíferos por gentil pipetagem cima e para baixo no tubo de 1,5 ml, com um primeiro truncado 100-1.000 ul ponta, e depois com uma ponta intacta 100-1.000 ul.
- Remover detritos e aglomerados por uma etapa de filtração usando um filtro de células 40 pm e recolher filtrado para 50 ml prev tubo cônicoiously revestido com FBS no passo 1.
- Lavar o filtro uma vez com tampão de triagem para um volume total de 3 ml e transferência do filtrado em tubo de 15 ml previamente revestida na etapa 1.
- Adicionar 16 ul de EDTA 50 mM, pH 8 por mililitro de suspensão de células (48 uL de 3 ml) de modo a obter uma concentração final de EDTA a 0,8 mM.
- Para fixar as células germinativas, adiciona-se lentamente 3 volumes de etanol gelado a 100%, utilizando uma pipeta de 10 ml com agitação suave (vórtice a baixa velocidade), a qual irá produzir uma suspensão leitosa.
Passo crítico: adição lenta de etanol é importante e crucial para preservar a integridade da preparação de células. Notamos que a rápida adição de etanol provoca a lise celular, resultando em uma importante redução de triagem eficiência. Para obter uma suspensão de células de 3 ml, 9 ml de etanol deve ser adicionado em cerca de 1 min. - Incubar as células em gelo durante 15 min, com mistura ocasional por inversão.
- Centrifugar a suspensão de células a 800 xg durante 5 min e remover a clarasobrenadante.
- Suavemente ressuspender as células germinativas fixas em 2 ml de tampão de triagem.
- Adicionar 4 ul de corante de ADN SYTO16 (solução 1 mM em DMSO) e incuba-se durante pelo menos 30 min (protegida da luz).
Nota: Os melhores resultados são obtidos usando triagem SYTO16 uma vez que é um corante de ADN permeável que é facilmente incorporado nos núcleos altamente compactadas de espermatídeos.
Sorter 3. celular Set Up
Nota: Aqui, a 4 de laser (405 nm - violeta, 488 nm - azul, 561 nm - verde-amarelo, 633 nm - vermelho) 20 parâmetro de separação de células BDFACSAria III é usado. O software BD FACSDiva 6.1.3 é usado para visualizar e analisar os dados. As configurações podem variar dependendo do tipo de classificador utilizado.
- Esteriliza-se o classificador de FACS através da execução de etanol a 70% como fluido de revestimento durante o processo de encerramento de fluidos (menu "Citómetro" no software) antes da triagem. Selecione "Cytometer" na barra de ferramentas do software e escolha "sh Fluidicutdown ". Siga as etapas mencionadas pelos processos.
- Preparar e filtrar 1x PBS com um filtro de 0,22 um, de modo a eliminar quaisquer cristais e contaminantes. Encher o reservatório de bainha para a linha de soldadura superior no interior do tanque.
- Inicie o software e fazer o login. Comece o classificador FACS para aquecer os lasers durante pelo menos 30 minutos antes da classificação. Executar dois processos de inicialização fluídicos para lavar o etanol a partir dos fluidos. Selecione "Cytometer" na barra de ferramentas do software e escolha "startup Fluidic". Siga os passos mencionados pelos processos.
Nota: Isso restaura fluídica com fluido de revestimento normal (1x PBS). - Limpe o bloco de triagem e as placas de deflexão com água destilada e seque-as completamente. Sonicar um bico de 100 | iM colocada num tubo de água destilada durante 2 minutos num banho de ultra-sons. Limpe o bico minuciosamente.
- Inserir o bocal 100 fim na célula de fluxo e virar a alavanca de bloqueio dos ponteiros do relógio para o bocal 12posição h. Defina a pressão do invólucro a 20 psi.
- Ligue a corrente e ajustar a amplitude de obter valores-alvo para a freqüência (cerca de 30), queda de 1 (cerca de 150) e Gap (cerca de 12) e para estabelecer um padrão de gotículas breakoff estável (poucas gotas por satélite). Desligue atenuação.
- Certifique-se de que o fluxo é linear e atinge o centro do aspirador de resíduos, alterando o ângulo do tipo bloco. Nota: Um bocal 130 uM a 10 psi também foi testado e nenhuma diferença óbvia foi encontrado.
- Definir atraso laser para 0 para o -77,39 azul, para o vermelho, 37,33 para o violeta e -39,85 para os lasers verde-amarelo.
- Definir áreas de escala para 1.14 para o 1.0 azul, para o vermelho, 0,75 para o violeta e 0,96 para os lasers verde-amarelo.
- Usando um Sort Test (na "Side Stream" janela do software), certifique-se que os fluxos secundários não são abanando. Na janela "Side Stream", ajuste os controles deslizantes de tensão de cada fluxo de lado para que eles atingiram o middlE de tubo de colheita de teste. Se o fluxo de centro não é apertado, ajustar o 2º, 3º e 4 configurações th gota para restringir o fluxo de centro.
- Inicie o Setup Cytometer e Rastreamento (CS & T) na aplicação de software (menu "Cytometer").
- Use a configuração e acompanhamento de contas de citómetro a 1 gota por cada 350 mL de automatizar a caracterização e monitoramento do desempenho citômetro utilizando as instruções do fabricante.
- Sair da aplicação CS & T. Aplicar configuração CS & T, certifique-se os parâmetros de transmissão ainda permitir um padrão de gotículas breakoff estável e ligue o botão Sweet Spot conforme descrito nas instruções do fabricante (na "janela breakoff").
- Otimizar o valor Gota Delay utilizando partículas fluorescentes (ver Tabela de Materiais).
- Instale os tubos de coleta no suporte. Abra a porta do bloco de classificação. Na janela "Side Stream", ligue tensão, em seguida, selecione "Teste de tipo "e clique no botão Aspirador gaveta para abrir a gaveta e ter acesso aos tubos de coleta.
- Otimizar os fluxos laterais de forma que eles vão para o centro do tubo. Ajustar os valores e controles deslizantes conforme necessário.
- Feche a porta do bloco de classificação e certifique-se de ajustar o relógio comparador de obter o ponto mais brilhante pérola no centro. Gaveta resíduos Unselect, uma espécie de ensaio e de tensão. Retire os tubos de coleta.
- Optimizar a gota atraso de acordo com as instruções dos fabricantes.
- Resumidamente, agitar vigorosamente frasco grânulo e diluir 1 gota de contas em 0,5 ml de PBS.
- Usando as instruções dos fabricantes, definir o atraso gota usando o modelo experimento Gota Delay disponíveis no software. Como alternativa, use o recurso Auto Gota Delay para definir o atraso queda.
- Coloque o tubo de partículas fluorescentes e ajustar a taxa de fluxo até que a taxa limite é de aproximadamente 3.000 a 4.000 eventos / segundo. Defina o tipo de precisão "inicial" e últimaly "afinar" na janela "Ordenar disposição". Selecione o filtro óptico e classificar esferas. Ajustar a gota Atraso até ~ 100% são classificados para a esquerda.
Nota: Este passo é crítico para certificar-se que as células de interesse espécie numa corrente de lado. Os grânulos e o filtro óptico são usados para alcançar perto de um desvio de gotículas de 100%.
- Coloque um ND (densidade neutra) filtro FSC 1.5 na extremidade esquerda do bloco detector FSC. Defina a extensão de janela para 2,00 ms e a escala FSC Área de 1,00 (no separador "Laser" na janela "Cytometer").
- Antes de carregar o tubo de ensaio, colocar um filtro de linha de amostra de 50 um na extremidade da linha de amostra para evitar a aglomeração. Para fazer isso, selecione "Alterar Filtro de exemplo" no menu "Cytometer".
- Teste a composição da amostra de fluido para alcançar uma boa separação sem abanando entre fluxo de lado e para impedir as células de degola para a Polipropiletubos ne.
- Coloque o tubo de amostra, ative as placas de deflexão e selecione "Test tipo" com a gaveta fechada. Olhe para fluxos secundários se a separação ocorre sem muito Fanning.
Nota: A ventilação é provavelmente devido a uma elevada concentração de proteínas no tampão de amostra.
- Coloque o tubo de amostra, ative as placas de deflexão e selecione "Test tipo" com a gaveta fechada. Olhe para fluxos secundários se a separação ocorre sem muito Fanning.
- Coloque o tubo de amostra no instrumento FACS. Seleccionar uma amostra de agitação de 300 rpm e uma temperatura de amostra de 4 ° C. Selecione "Obter dados" no "Aquisição Dashboard".
- Se necessário, diluir a amostra para alcançar uma taxa de eventos apropriado para um máximo de 5000 eventos / s (a uma taxa de fluxo máxima de 3.0). Estritamente respeitar estes limites de modo a manter a pureza das células separadas.
- Para analisar e classificar as células, otimizar o valor limite FSC para eliminar detritos, sem interferir com a população de interesse. Em escala logarítmica, ajustar a tensão do detector de tubo foto-multiplicador (PMT), com o filtro de 530/30, a fim de fazer-se que o sinal de fluorescência da população total se encaixa dentro da escala, e portão na população positiva (Figura 1, porta 1).
- Produzir um Scatter-área Forward (FSC-A) área-Side Scatter / (SSC-A) parcela da população positiva SYTO16 e ajustar o FSC-A para cerca de 110 V na escala linear, eo SSC-A para cerca de 150 V em escala logarítmica para visualizar todos os eventos enquanto excluindo muito grandes células e agregados celulares.
- Na janela "Ordenar Layout", defina o "Classificar Precision Mode" para "pureza 4-way" (máscara Rendimento: 0, Máscara Pureza: 32, máscara de fase: 0). Selecione "Continuous" no menu "alvo Eventos" para triagem contínua.
- Adicionar populações para classificar no campo correspondente aos tubos (na janela "Ordenar Layout"). Populações lugar com freqüências mais elevadas no meio e aqueles com freqüências mais baixas nas extremidades. Defina as placas de tensão a 2.500 V. Durante a triagem, manter a coleta de amostra tUBEs no gelo.
4. celular Seleção
- Imediatamente antes da classificação, as células de filtro usando um filtro de 50 mm em uma previamente revestida 5 ml de polipropileno rodada tubo inferior.
- Lavar o filtro extensivamente com 1-2 ml de tampão de triagem.
- Células germinativas Ordenar fixas usando um classificador de células 488 nm equipado com laser seguindo o esquema gating detalhado na Figura 1. Recolha frações purificadas em 5 ml de polipropileno tubos de fundo redondo previamente revestidas no ponto 1 no gelo.
- Certifique-se de que 100-200 uL de SBF é mantido no interior dos tubos de recolha, para evitar a aderência das células escolhidas para a parede do tubo.
- Certifique-se de que a concentração de saturação é SYTO16 para evitar flutuações de fluorescência durante o período de triagem. SYTO16 está saturando quando não há nenhuma outra variação de intensidade da coloração de células no Alexa Fluor 488 parâmetro (coloração de DNA) nos gráficos de triagem. Se necessário, adicione 1 ml deSYTO16 para o tubo de triagem para atingir a saturação.
- Mostrar o total de eventos em um gráfico mostrando os seguintes parâmetros: número de eventos vs Alexa Fluor 488-A.
- Seleccionar as células positivas de coloração de ADN com uma porta, como mostrado na Figura 1.
- Células Mostrar os porta 1 em um gráfico utilizando SSC-A vs FSC-A como parâmetros
- Selecione as células com Gate 2, como mostrado na Figura 1.
- Células Mostrar os Gate 2 em um gráfico usando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parâmetros.
- Selecione as células com portão 5 e 6 no Portão Gate 2 gráfico, como mostrado na Figura 1.
- Exibir separadamente Portão 5 e 6 no Portão gráficos usando Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parâmetros.
- Selecionar spermiogenesis passos 1-9 espermátides no Portão 5 gráfico e spermiogenesis passos 10-12 espermátides no portão 6 ilustrações, como mostrado na Figura 1.
- Displaycélulas do portão 1 em um gráfico usando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parâmetros
- Selecione as células com Portão 3 e Gate 4, como mostrado na Figura 1.
- Exibir separadamente Portão 3 e Gate 4 de gráficos usando Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parâmetros.
- Selecionar spermiogenesis passos 13-14 espermátides no gráfico Portão 3 e spermiogenesis passos 15-16 espermátides no gráfico Gate 4, como mostrado na Figura 1.
- Células Mostrar os porta 1 em um gráfico utilizando SSC-A vs FSC-A como parâmetros
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Representative Results
Gating estratégia utilizada com citometria de fluxo
A Figura 1 representa a estratégia utilizada gating em citometria de fluxo para classificar quatro populações espermátide altamente puros. Resumidamente, as células com coloração positiva de ADN (Alexa Fluor 488-A) são primeiro seleccionadas com portão 1. Espermátides de spermiogenesis etapas 1-12 são seleccionado (porta 2) sobre um gráfico de pontos mostrando a granulosidade (SSC-A) com o tamanho (FSC -A) a partir da porta 1. Em seguida, a partir de espermatídeos spermiogenesis passos 1-9 e 10-12 spermiogenesis passos podem ser separados uns dos outros de acordo com a variação de intensidade da coloração do ADN (Gates, 5 e 6). Espermátides de spermiogenesis os passos 13-14 e 15-16 são directamente seleccionados a partir de células coradas positivamente em um gráfico de pontos que mostra o tamanho (FSC-A) contra a coloração do ADN (Alexa Fluor 488-A) (Gates, 3 e 4). Todas as populações classificadas são redefinidos com Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor borrões 488-A ponto de aumentar o pureza ir.
Validação do esquema de purificação por microscopia de epifluorescência
A Figura 2 representa a coloração DAPI das populações separadas de espermatídeos por citometria de fluxo. A espermiogênese os passos 1-9 spermatids exibir a forma redonda núcleo típico das espermátides redondas e ovais núcleo em forma de o passo spermiogenesis 9 espermátides. A espermiogênese os passos 10-12 spermatids mostrar um grande alongamento núcleo em forma de gancho. Espermiogênese os passos 13-14 e 15-16 espermátides têm um núcleo em forma semelhante, mas diferem ligeiramente em intensidade de coloração do DNA, o que permitiu a sua classificação. As etapas de diferenciação e pureza das diferentes populações ordenadas também foram investigados utilizando biomarcadores específicos, como descrito em um estudo anterior 9. A pureza das populações espermátide ordenadas está representado na Tabela 1.
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Figura 1. estratégia gating detalhada para classificar populações ultrapura espermátide. Representação esquemática da estratégia de gating usado para classificar spermiogenesis passos 1-9 espermátides, passos 10-12 espermátides, passos 13-14 espermátides e os passos 14-16 spermatids simultaneamente com um 488 nm equipado com laser classificador de células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Visualização de espermátides classificado por epifluorescência. Spermatids Ordenado são cytospined em lâminas de microscópio, coradas com DAPI e visualizados usando um microscópio de epifluorescência, com os filtros adequados para DAPI e estão equipados com uma ca CCDmera. As células são mostrados em escala de cinza invertido. Bar = 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tipo de célula observada em maioria | Pureza | Número aproximado de células (8 hr classificação) | Contaminantes | |
| População 1 | Passos 1-9 spermatids | 99-100% | 4000000 | Passo 10 espermátides |
| População 2 | Passos 10-12 spermatids | 95-98% | 1000000 | Espermatócitos |
| POPULAÇÃO 3 | Passos 13-14 spermatids | 99-100% | 800000 | Espermatócitos, espermátides passos 1-9 |
| População 4 | Passos 15-16 spermatids | 98-100% | 1500000 | Espermatócitos |
Tabela 1: Ordenar populações espermátide e seus contaminantes.
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Discussion
Células espermatogênicas foram sempre um desafio para o estudo, dada a complexidade do epitélio seminífero, bem como o sucesso limitado de cultura in vitro. Ao longo dos anos, muitas abordagens para purificar as células germinais de diferentes espécies foram desenvolvidos. Técnicas de sedimentação utilizando purificação gravidade com Percoll ou gradientes de albumina do soro bovino geralmente oferecem um bom rendimento de células germinais intactas, mas falta definição adequada entre alguns tipos de células, como células tetraplóides de meiose e espermátides 10. Além disso, estas técnicas exigem dispositivos especiais (muitas vezes caseiros) que podem não estar prontamente disponível para muitos laboratórios, o que torna-os difíceis de reproduzir, sem julgamento pesado e erro. Estes métodos são também demorados, muito sensível a vibrações e inconveniente, como o aparelho é geralmente mantida a 4 ° C, para manter a viabilidade celular. Quando bem sucedida, os métodos de sedimentação no entanto, fornecer vários milhões purificada c vivoells por população. No entanto, o baixo nível de enriquecimento de células que podem ser alcançados é a principal desvantagem destas técnicas, uma vez que raramente atinge mais do que 80-90% de pureza. Em certos casos, uma contaminação de 10-20% a partir de outros tipos de células está presente quando medido por ADN, ARN ou conteúdo de proteína, o que representa um grande impedimento para análises moleculares.
Quando buscando melhorar a pureza das populações de células, alguns pesquisadores têm combinado sedimentação por gravidade a outros métodos. Uma das abordagens mais eficazes é a utilização de ratos imaturos para limitar o número de populações de células diferentes que representam fases posteriores. Um pode tirar vantagem da primeira onda da espermatogénese e se obter uma preparação de células que contém células germinais até um determinado estágio de diferenciação com base na sua aparência sequencial após o nascimento. No entanto, esta abordagem combinada requer mais animais para compensar a quantidade limitada de material de partida e ainda não resolver a falta de definition dos métodos de sedimentação. Além disso, uma tal abordagem não pode ser aplicado praticamente para depois os tipos de células, tais como espermatídeos, mas é principalmente usado para espermatogônia e espermatócitos primários. Além disso, há alguma evidência de que a primeira onda de espermatogénese pode abrigar células com propriedades ligeiramente diferentes que o epitélio de ciclismo de ratos maduros 11,12.
A vitamina A sincronização da espermatogénese também foi utilizado para melhorar a purificação da célula germinal como este procedimento se reduz o número de fases presentes nos testículos de um animal tratado. No entanto, este procedimento foi utilizado principalmente para sincronizar a espermatogénese em ratos, com algum sucesso relatado em ratos 13,14. A partir de nossa própria experiência, a vitamina A sincronização em camundongos é demorado, raramente dá resultados reproduzíveis e produz efeitos secundários nocivos aumentando a preocupação com a integridade celular do epitélio seminífero.
Othegrupos R usados com sucesso de citometria de fluxo para purificar as células germinais de rato 15-18. No entanto, nenhum deles relatou a purificação das populações espermátide últimos os passos espermátides arredondadas. A nossa estratégia gating permite purificar quatro populações de células haplóides altamente purificados que representam passos de diferenciação importantes passíveis de estudos moleculares. A principal limitação do método descrito neste trabalho pode ser o rendimento limitado de células classificadas. O elevado nível de pureza é um pouco obtido à custa do número de células separadas. No entanto, para se certificar de que as condições de ordenação são ideais, nós adicionamos alguns conselhos importantes para o protocolo. Todos estes conselhos técnicos têm como objectivo aumentar o número ou a pureza de espermátides classificados. Por exemplo, a utilização de tubos revestidos de FBS durante a classificação diminui grandemente a perda de células que aderem aos tubos. Além disso, usando concentração de saturação de SYTO16 ajuda a reduzir as variações de intensidade de coloração de ADN, resultando em mais estável populatíons como visto em parcelas de FACS e um melhor rendimento e pureza de espermátides ordenados ao longo de um período de 8 horas. classificação Além disso, os conselhos técnicos prestados para o classificador FACS set-up certamente ajudar a aumentar a eficiência global de triagem, evitando entupimentos celulares ou contaminação cruzada na coleta de tubos. Alternativamente, portas pode ser expandido para aumentar o número de células classificadas, eventualmente resultando em um pequeno decréscimo na pureza da população, o que pode ser aceitável para alguns estudos. Além disso, as células germinativas fixadas com etanol coradas com SYTO16 são muito estáveis a 4 ° C e pode ser resolvido por mais de 8 horas, com ajustes gating limitados e supervisão. Em última análise, de vários dias de triagem podem ser combinadas para se obter um número suficiente de células para qualquer aplicação.
Fluxo classificados espermatídeos obtidos como descrito aqui podem ser utilizados para uma variedade de experiências. ADN a partir destas células pode ser facilmente extraído através de kits comerciais de purificação de ADN genómico e demonstrouser de qualidade adequada para análise por PCR e sequenciação 9 próxima geração (dados não mostrados). Espermatídeos ordenados também podem ser utilizados para análises de proteína 9 onde foi realizado várias imunoblots contra marcadores específicos de fase para confirmar a pureza elevada dos espermatídeos classificados. Verificou-se a integridade celular dos espermatídeos ordenadas e descobriram que o núcleo e citoplasma de todas as populações permanecem intactos. No entanto, verificou-se uma proporção de passos 13-14 espermátides e uma proporção menor de passos 15-16 espermátides que faltam seu flagelo (dados não mostrados). Assim, as populações de células germinativas altamente puros classificados utilizando esta abordagem são adequados para análises de proteómica e genómica, bem como outras aplicações.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Leonid Volkov e Éric Bouchard para a sua assessoria técnica em relação a microscopia de epifluorescência.
Ajuda financeira
Financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (concessão # MOP-93781) para GB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
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